第 17 章：循环 RNA 作为动脉粥样硬化检测与监测的生物标志物（Exploring circulating RNAs: Emerging biomarkers for atherosclerosis detection and monitoring）

引言

人体细胞外空间含有多种 RNA 物种，这些 RNA 在体液与血液中可被检测到，因此成为非侵入性诊断与监测的理想候选物。这些细胞外 RNA（extracellular RNAs，exRNAs）以微囊泡、外泌体、凋亡小体以及与蛋白质结合的形式（主要是血浆核糖核蛋白复合体 RNPs，组分包括 Ago2、核仁磷酸蛋白 nucleophosmin1，甚至高密度脂蛋白 HDL）释放到细胞外微环境中。这种包裹与结合方式使 exRNAs 即使在富含 RNase 的细胞外环境中也能保持显著稳定性。exRNAs 广泛存在于血液、尿液、唾液等多种体液中，其中血液分析对临床诊断具有最直接的意义——本章将讨论不同血液衍生物用于心血管疾病 exRNA 分析的优劣。

然而，不同研究报道的血液衍生物中各类 RNA 的比例差异巨大，可被视作候选诊断/预后分子的 RNA 在不同研究间也差异极大。这种不一致主要源于样本制备、提取技术、数据归一化、测序文库构建以及生物信息学流程的极度异质性。换言之，exRNA 检测领域的"标准化缺失"本身就是当前最大的方法学瓶颈，也是本章贯穿始终要反复回到的主题——从样本采集、运输储存、提取方法的选择、检测与定量策略，一直到归一化方案的对比，每一步都可能让最终结果偏离真实生物学信号数倍。本章沿这一脉络系统梳理各环节的关键陷阱与已建立的应对策略，最后落脚到具体疾病（动脉粥样硬化、AMI、房颤）的诊断与预后生物标志物候选分子。

前分析挑战：样本类型的选择

循环 RNA 检测结果的可靠性高度依赖于前分析因素，约 60%–70% 的生物标志物定量变异来源于前分析阶段。常用样本类型有四种：全血、血细胞、血浆与血清，各自携带不同的分子信息，也各有局限。

全血含有循环系统的细胞与非细胞组分，可提供最全面的循环 RNA 图谱，尤其适用于定量表达水平较低的 lncRNAs。但全血中检测到的 RNA 难以判断源自何种细胞类型或无细胞组分，再加上 RNase 活性导致的快速降解，全血样本必须即时处理或使用 RNA 稳定剂。

血细胞中最常用的是总白细胞与外周血单个核细胞（PBMCs，含淋巴细胞与单核细胞），主要用于转录组下游应用。但血液处理过程中的机械应力或温度波动可引起细胞损伤或激活，改变 RNA 表达谱；不同提取技术引入的细胞群差异也会进一步影响结果。

血浆是研究循环 exRNAs 的常用样本，其制备包含若干关键步骤。抗凝剂选择至关重要——常用 K2 EDTA、酸柠檬酸葡萄糖（acid citrate dextrose）与柠檬酸钠，而肝素因对 RT-qPCR 有抑制作用应避免使用。血浆可进一步加工为富血小板血浆（PRP）或乏血小板血浆（PPP）：PRP 由单步离心（2500×g，10 min）制备，但保留的血小板会在冻融循环中释放 RNA 污染 exRNA 分析；PPP 按 ISTH 指南双步离心（2500×g×15 min ×2）能最大限度减少血小板与血细胞来源 RNA 污染，是 exRNA 研究更合适的基质。欧洲标准化委员会（CEN）建议 1600–2500×g ×10 min 后再用 14000–16000×g ×10 min 以进一步去除细胞核酸，但高速离心可能同时丢失携带 exRNAs 的细胞外囊泡（EVs）。抗凝剂也影响血小板来源 RNA 污染与 miRNA 谱：柠檬酸盐抗凝血浆的血小板污染少于 EDTA（EDTA 激活囊泡释放）；CTAD（柠檬酸-茶碱-腺苷-双嘧达莫）则提供最稳定的 miRNA 谱，红细胞与血小板 RNA 偏倚最小。这些差异的根源在于抗凝剂对血小板功能的不同影响。

血清通过血液自然凝固后离心获得，是动脉粥样硬化生物标志物开发的常用样本。但凝固过程会从血细胞释放 RNA，尤其是血小板在凝血反应中释放大量含 miRNA 的 EVs，从而显著改变原本循环血中 exRNAs 的组成——这是血浆与血清转录组差异的主要原因，也是临床数据在两种基质间难以直接比较的根本原因。

前分析挑战：保存管、干扰因素、药物、采样时间与运输储存

本节聚焦样本采集后、进入提取步骤前必须考虑的若干二级前分析因素，每一项都可能独立改变最终 RNA 谱。保存管方面，RNA 易被生物样本中丰富的 RNase 降解，在采集、运输与储存过程中稳定性容易受损失；RNA 稳定管通过抑制 RNase 活性保护 RNA 分子，对急诊科等无法即时处理样本的场景尤其有价值。然而并非所有稳定管都兼容所有下游应用，RNA 浓度、灵敏度与可重复性的差异已被记录。exRNAQC 研究指出，保存管并不能良好稳定 exRNA，RNA 浓度与灵敏度随时间变化且可重复性下降；与无保存管相比，保存管在长时间放置时稳定性反而更差，RNA 浓度更低、溶血水平更高——这意味着采血管的"稳定性承诺"在实际临床条件下常被高估。综合而言，EDTA 与柠檬酸管在采血后 4 h 内处理不会显著富集特定基因集，其中柠檬酸管在 mRNA 表达谱上表现最佳。

干扰因素方面，溶血由红细胞破裂释放胞内物质引起，会向样本中引入细胞内 RNA，导致无细胞 RNA 分析的假阳性。已报道多种易受溶血影响的 miRNAs，其中包括动脉粥样硬化相关候选生物标志物 miR-17-5p 与 miR-92a-3p。视觉检查对溶血识别不够灵敏，推荐使用分光光度法或基于红细胞富集 RNA（如 miR-16-5p 与 miR-451a）的方法来检测溶血。无保存管（EDTA、柠檬酸等）相比保存管在溶血水平上无差异，因此更受推荐。脂血症指血液中脂质水平升高使样本浑浊，会干扰 RNA 提取与定量，在 ASCVD 患者中因高发的血脂异常尤为常见。miRNAs 已被证实存在于 VLDL、LDL、HDL 等多种脂蛋白中，分析总循环 RNA 池时必须考虑脂蛋白水平变化。此外，ACS 急性发作期及之后血浆脂蛋白组成显著变化，且 ACS 后立即采集样本（多非空腹状态）会使脂蛋白谱与 exRNAs 整体组成偏移——这是诊断/预后标志物评估中常被忽视但极重要的混杂来源。

药物影响方面，ASCVD 患者常用抗凝、抗血小板与他汀类药物，这些药物可影响循环 RNA 水平或其定量。例如他汀可调节动脉粥样硬化相关 RNA 的表达；肝素（MI 或心血管操作时常用）会干扰 RNA 定量，效应与肝素半衰期相关，给药后 6 h 后不再可检测。为获得无偏倚的 exRNA 分析结果，样本应尽可能在给药前或肝素给药后至少 6 h 采集；若不可行，可使用不同肝素酶缓解肝素对 RNA 定量的影响。

采样时间同样关键——RNA 水平不仅随疾病阶段或治疗干预波动，还会受多种外部变量影响。昼夜节律可造成 RNA 水平的日间变异，饮食也会调节基因表达；压力、体力活动与睡眠模式进一步增加 RNA 水平的波动。设计 RNA 研究时必须考虑这些因素以正确解读发现。

运输与储存方面，在多中心研究或样本需外送时，运输与储存条件尤为关键。冷链与适当的储存温度是保持样本完整性的必要条件：血浆与血清应尽快处理，必要时可在 4°C 短期保存；长期储存应冻存于 −80°C。RNA 对温度波动尤其敏感，应在分离后立即冻存。分装到小体积、避免反复冻融是保持 RNA 完整性的有效策略。

RNA 提取方法

通过 RNA 测序，几乎所有已知 RNA 物种（mRNA、rRNA、tRNA、miRNA、piRNA、snoRNA、vault RNA、Y RNA、lncRNA、circRNA 等）都在血液与细胞外囊泡中被发现，但不同研究报告的 RNA 比例差异巨大。提取循环 RNA 的主要挑战在于其在体液中的低丰度与结构多样性，尤其是短转录本的有效回收。提取过程受样本体积、处理时间、离心速度、carrier 使用、温度、洗脱体积等多种因素影响，必须严格控制以最小化对下游基因表达实验的影响。提取方法主要分为液–液提取（LLE）与固相提取（柱式）两类，目标转录本类型（短或长）决定具体方法选择。

液–液提取使用有机溶剂进行相分离、酒精沉淀回收 RNA。循环 RNA 常与蛋白复合物结合或包被于微颗粒中，需要使用变性剂如异硫氰酸胍（GITC）从这些结构中释放。GITC 破坏氢键、变性蛋白质并释放 exRNAs。TRIzol 试剂是含 GITC 与苯酚的单相溶液，在变性 RNase 的同时保护 RNA 完整性：加入 TRIzol 与氯仿后离心产生相分离，水相含 RNA、界面保留 DNA、有机相隔离变性蛋白。GITC 作为离液剂破坏细胞与核结构并溶解核酸与蛋白质；疏水性苯酚与蛋白疏水区相互作用，将蛋白驱入有机相；酸性条件下 TRIzol 中和 DNA 磷酸骨架、降低其在水相溶解度并定位于界面，而 RNA 因暴露的核碱基保持亲水性，倾向分配入水相。最终用酒精沉淀 RNA、乙醇洗涤、PCR 级水溶解；反复再水化与提取界面相和有机相可进一步提高 RNA 产量。

固相提取使用含有膜（通常是玻璃纤维、衍生化硅胶或离子交换膜）的微量离心管，依赖裂解缓冲液（多为胍盐）与离心柱收集 RNA。样本先与裂解缓冲液混合释放复合态 RNA，再加入缓冲液借助离心力沉淀抑制剂。离心后取上清与异丙醇/乙醇（96%–100%）混合提供 RNA 结合条件，溶液在真空或离心力下通过膜，RNA 被保留在膜上、含污染物液体被丢弃，最后用无 RNase 水从膜上洗脱 RNA 收集到管中。目前最常用的方法是 LLE 与固相提取的组合——在酚-氯仿预处理样本后使用带膜的微量离心管。

提取方法的对比与选择

比较研究评估了多种循环 RNA 提取方法，但结果不一致。TRIzol LLE 在某些情况下对 miRNA 提取有效，但通常获得的小 RNA（<70 nt，构成 exRNAs 主体）量较低；柱式方法对小 RNA 的回收普遍更好，更适合血浆样本。样本输入体积也是影响 RNA 产量的关键因素——组合方法在小体积样本上优于单一 LLE 与柱式方法，而柱式方法在高体积下易因堵塞、抑制剂或干扰分子而效率降低。超速离心可通过去除干扰分子提高 RNA 产量。

回收效率与所提取 miRNA 谱在不同方法间差异显著：LLE 易丢失小分子或低 GC 含量 RNA，柱式方法能更有效回收这些分子，组合方法提供最广谱的 miRNA 提取谱。使用 glycogen 或 linear acrylamide 等 carrier 可提高低丰度 RNA 回收率，但高 carrier 浓度可能损害质量与下游分析。新近开发的 TRIzol-free 柱式试剂盒在 RNA 产量上与 TRIzol 方法相当，但避免了 TRIzol 毒性并更兼容下游 qPCR，其最佳提取效率依赖于样本输入体积——150 μL 常优于更大体积。exRNAQC 联盟比较了 8 种试剂盒，发现 RNA 产量差异显著，部分试剂盒在低输入体积下表现更好，对 mRNA 与 miRNA 的提取效率不一。

circRNA 研究需要额外的核糖体 RNA 去除与 RNase R 消化步骤以降解线性 RNA、从而富集 circRNA。总体而言，没有单一方法普适最优——LLE、柱式或组合方法的选择应与具体实验目标对齐，研究者必须权衡每种方法的取舍以获得最佳结果。

检测与定量挑战：引物设计与归一化

循环 RNA 在血液中的低丰度是 exRNA 检测的主要挑战之一，通常在逆转录之后加入预扩增步骤以提高下游 qPCR 灵敏度。短 exRNA 分子的引物设计是另一挑战——miRNA 分子小、序列同源性高、并存在 miRNA 亚型（isomiRs），需要特异性酶与引物设计方法以确保高灵敏度和特异性。最常见的引物设计策略是通过加 poly(A) 尾延长 miRNA 模板，使反应能进行；另一种方案是仅使用一个带 stem-loop 的特异性引物（效率较低），配合一个较短的（3-8 nt）通用标记引物。

使用锁核酸（LNA）增强的引物可保证短寡核苷酸的稳定性；LNA 寡核苷酸比常规分子对靶序列结合更特异，对区分序列相近的 miRNA 尤其有用，可在仅一个核苷酸差异的 miRNA 之间实现高特异性区分，且无需预扩增步骤。

circRNA 因其环状结构，需要针对 back-splice 位点（circRNA 独有的特异性靶标）设计引物，以确保只检测 circRNA 而非线性 RNA。

定量受样本采集、储存条件、输入体积、RNA 分离效率、逆转录性能等多重前分析与分析因素影响，会掩盖真实的生物学与临床意义，因此归一化策略至关重要。常用方法包括：(a) 外源合成寡核苷酸、(b) 所有分析 miRNA 的 Cq 几何平均值、(c) 内源参照 miRNA。当前策略主要依赖单一参照 miRNA 或多个参照 miRNA 的均值，但最优方案尚未达成共识。

外源寡核苷酸（如来自秀丽隐杆线虫的 cel-miR-39、cel-miR-54、cel-miR-238）以已知浓度加入生物样本，监测提取与 RT 效率，从而提供准确的 qPCR 数据；但该方法未计入外源寡核苷酸未暴露的内源与前分析变量。内源 miRNAs 因其表达受与靶基因相同的变量影响，理论上是最优归一化策略，但目前尚无共识性的内源参照基因；理想情况下应在每个实验设置中通过高通量方法鉴定最稳定的 miRNAs，但该过程昂贵耗时。多项研究显示外源寡核苷酸归一化在减少 miRNA 表达批间变异方面优于内源 miRNA。

检测大量靶标时，全局均值（global mean）是常用策略——所有 miRNA 的 Cq 几何平均值可大幅降低样本间与运行间变异。在相同实验设置下，可使用 NormFinder 等算法鉴定最稳定的内源参照基因，结果用单一最稳定基因或多个最稳定基因的均值进行归一化。Faraldi 等在两个队列中应用了基于外源寡核苷酸、全局均值、NormFinder 排序最稳定 miRNA 均值与单一最稳定内源 miRNA 的归一化策略，结果对部分靶标产生了完全相反的输出——这说明归一化策略对实验结果的方向性影响极大，在该问题解决之前，exRNAs 作为生物标志物的临床应用将受限。

lncRNA 与 circRNA 的归一化问题尤为未决——合成 miRNA 作为外源对照常被用于应对分析变异，但分子长度与检测化学的差异使其不适用于 lncRNA 与 circRNA 的归一化；内源对照则需要在每个实验设置中通过高通量筛选鉴定最稳定的参照基因，过程同样昂贵耗时。

数字 PCR：循环 RNA 绝对定量的新工具

实时定量 PCR（RT-qPCR）是当前评估不同生物样本基因表达的金标准。然而，循环 RNA 在体液中丰度低、归一化方法不一、数据计算策略（相对定量 ddCT、标准曲线）差异大，限制了 RT-qPCR 在 exRNA 上的应用。数字 PCR（dPCR）是迄今最灵敏、可实现核酸绝对定量的技术，最适合 exRNA 定量。dPCR 通过稀释与分配样本到数百甚至数百万个独立反应腔室，使每个腔室含有一个或零个目标序列拷贝；通过计数"阳性"与"阴性"腔室数量，可精确确定原始样本中目标分子拷贝数。样本分配可通过芯片（含微流控与微型阀门，分隔为数百到数千个反应）或液滴（油水乳剂分隔反应）实现。

与 qPCR 类似，dPCR 适合测量有限数量的靶标，多用作高通量技术识别靶标的确认工具。其相对常规实时 PCR 的优势包括：无需外部参照的绝对定量、消除 PCR 效率偏倚、免除预扩增步骤、更高精度与灵敏度。dPCR 定量 miRNA 生物标志物相比实时 PCR 具有更大精度（变异系数降低 37%–86%）与更好的日间可重复性；在临床血清样本中检测 miRNA 时，dPCR 也显示出更优的诊断性能。针对 RNA 提取引入的整体定量偏倚（阻碍 exRNAs 进入临床实践的核心问题），Sequeira 等提出了一种可能的解决方案——基于芯片的 dPCR 在不预先提取 RNA 的情况下直接检测血浆 miRNAs：他们对血浆进行裂解后直接进行芯片 dPCR，无需提取步骤即可高精度检测低拷贝数与高表达 miRNAs；将该方法用于评估心肌相关 miR-133a 在急性心梗患者与健康对照中的水平，证实其适合作为疾病标志物的直接 dPCR 定量方法。

RNA 物种特异性富集策略

利用 RNA 测序研究循环 RNA 的主要挑战在于 RNA 分子在血液中的丰度本身就远低于细胞或组织样本。这种稀缺性给 RNA 提取、文库制备、足够的测序深度都带来巨大困难。RNA-seq 方案的选择高度依赖于起始材料（全血、PBMC 或血浆）以及所研究的 RNA 物种（miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA）。已有多种策略试图应对这些局限（包括优化的 RNA 提取协议、增强的扩增技术、靶向测序方法），但仍迫切需要针对循环 RNA（特别是血浆）建立标准化的共识性 RNA-seq 方法——这种共识将提高跨研究的可重复性与准确性，加速临床相关生物标志物的发现。

多数循环 RNA 测序研究以血浆为起始材料；全血样本则必须加入珠蛋白去除（globin depletion）这一关键步骤。红细胞是血液细胞组成的主要部分，贡献大量珠蛋白转录本，会主导 RNA-seq 数据、掩盖包括 lncRNA、circRNA 与 miRNA 在内的低丰度 RNA。专门的珠蛋白转录本去除方案可显著降低噪声、提高生物学相关 RNA 的代表性。

下一步是目标 RNA 分子的富集。研究人员必须决定聚焦长 RNA、短 RNA 还是 circRNA，因为这一决定决定了下游步骤。无论测序哪种 RNA 分子，rRNA 都是冗余的，且血浆中 rRNA 比例高于细胞。若聚焦目标不是 mRNA 与 lncRNA，则 poly(A) 富集不是克服该分布的选项，应进行 rRNA 去除以保留非多腺苷酸化 RNA（包括 circRNA 与 miRNA）以及多腺苷酸化 RNA（mRNA 与 lncRNA）。若起始样本为全血，则 rRNA 去除应与珠蛋白去除联合使用，以有效去除红细胞来源的过量血红蛋白转录本。若聚焦 mRNA，则常用 poly(A) 富集方案。

研究 circRNA 时，必须特别注意富集策略——circRNA 研究方案需要通过 RNase R 处理去除线性 RNA，选择性消化线性 RNA 而保持 circRNA 完整，确保 circRNA 在进入下游文库制备前得到富集。miRNA 测序的文库制备专门设计为从样本总 RNA 中富集小 RNA 物种（如 miRNAs）：将专用接头连接到 miRNA 以促进扩增与测序平台兼容性；连接接头后进行 PCR 扩增以增加 miRNA 来源 cDNA 的丰度，循环数根据 RNA 输入与样本类型优化；关键步骤是大小选择——纯化扩增文库以分离对应 miRNA 大小范围（典型 18–30 nt）的片段，有效排除较大 RNA 物种并最小化接头二聚体等污染物。

由于当前多数 RNA 测序方法依赖合成测序（sequencing by synthesis），作者重点讨论该方法的特异性挑战。文库制备继续使用 T4 RNA 连接酶（Rnl2、Rnl1）将接头连接到 3′ 与 5′ 端。该步骤已被报道为生物流体中 miRNA 定量偏倚的主要来源（生物流体中 miRNA 量低）——T4 连接酶对某些 miRNA 序列具有更高亲和力，导致构建的小 RNA-seq 文库不准确。建议的应对方案包括：(1) 使用带随机核苷酸的接头；(2) 无连接过程，使用多腺苷酸化与模板切换进行逆转录；(3) 仅连接单个 3′ 接头后进行环化。比较这三种方法及传统接头连接方法显示，改良方法偏倚更低，使用随机核苷酸的技术最优；不同方法间的偏倚可重复性低，意味着不同协议所得数据不应直接比较。

PCR 扩增步骤

PCR 扩增是文库制备中可造成测序数据偏倚的下一环节。PCR 重复（来自同一 cDNA 分子的读段）会导致不准确性——并非所有 cDNA 分子被等量扩增。高通量测序下，检测到序列相同的 RNA 的可能性增加，区分结构相似、可能源自不同基因的小 RNA 变得困难；仅去除相同读段可能无法有效解决 PCR 重复问题。提高准确性的一种方法是使用唯一分子标识符（UMI）——在起始池中加入 4–10 nt 的短序列来标记相同序列的不同拷贝，从而检测并消除 PCR 重复作为潜在偏倚来源。虽然 QIAseq 协议推荐使用 UMI，但其在小 RNA 测序中的实际效用存疑——KY Wong R. 等比较了 QIAseq 试剂盒使用与不使用 UMI 的效果，发现 UMI 并未带来显著的性能提升；Androvic 等甚至报告 UMI 的使用可能导致 miRNA 定量错误。

circRNA 的 RNA-cDNA 转换因环状结构特别具有挑战性——使用靶向 back-splice 接头的逆转录引物的优化方案可提高 circRNA 的 cDNA 合成效率，确保其被纳入测序文库。此外，circRNA 测序文库的制备需注意片段大小——circRNA 通常需要更长的读长才能跨越对其识别与定量至关重要的 back-splice 接头。

动脉粥样硬化及冠心病的诊断与预后生物标志物

动脉粥样硬化是一种静默进展的疾病，常在出现显著临床症状（如急性心梗 AMI）前未被察觉。因此，通过新型特异且敏感的诊断生物标志物进行早期筛查具有重大价值。

多种 miRNAs（如 miR-130a、miR-27b、miR-210）在经病史与体检诊断的外周血管疾病——动脉硬化性闭塞症（arteriosclerosis obliterans）患者血清中水平升高，提示其作为早期疾病生物标志物的可能性。斑块形成并造成心肌及周围细胞缺血后，多种 miRNA 表达改变，CAD 患者中血管壁与炎症细胞相关的 miR-126、-17、-92a、-155 水平下降。

lncRNAs 作为 CAD 诊断生物标志物显示出可观前景。典型例子是 lncRNA CoroMarker，对 CAD 具有出色的诊断性能，可能实现更早的治疗介入与更好的疾病管理。证据还显示循环 lncRNA ANRIL 具有致动脉粥样硬化特性，其水平与动脉粥样硬化风险增加相关。

在 ncRNAs 整体格局中，circRNAs 也被认为是良好的 CAD 生物标志物候选——基于其在血浆中的含量、半衰期、稳定性以及细胞与组织特异性。具体而言，has-circ-0124644、circMCTP、circSMARCA5、circNPHP4、has-circ-0001445 可作为 CAD 生物标志物，与其他诊断技术联合时可提高诊断准确性。

提高诊断性能的有力方法是使用 ncRNA 血浆 panel 而非单一分子。由 miR-155-5p、miR-483-5p、miR-451a 组成的 3-种 miRNA panel 已被证明是 CAD 患者冠状动脉斑块破裂的强大预后工具；PBMC 中的 miRNA 特征可用于区分急性冠脉综合征风险患者。

lncRNA MALAT1 通过与 mir-125b 相互作用参与 AMI 的心脏炎症与斑块失稳定，因此血浆中 MALAT1 水平升高、mir-125b 水平降低可作为冠心病的指标。

AMI 诊断生物标志物

AMI 是循环 ncRNAs 生物标志物研究最集中的场景，相关证据也是评估循环 RNA 临床转化进展的"试金石"。AMI 期间 ncRNAs 与传统生物标志物类似，从缺血损伤的心脏细胞释放入循环，其循环水平变化可提供诊断与预后信息。需注意这些变化不仅反映心脏损伤，也反映其他细胞与组织的病理生理过程，这可能是诊断的偏倚来源——任何单一 ncRNA 都不太可能像肌钙蛋白那样心脏特异，因此 panel 策略与多模态整合才是出路。

肌肉与心脏富集的 miRNAs 在 AMI 后循环中显著升高，部分 miRNAs 在 AMI 患者中较对照下调。miR-499 与 miR-208b 的循环水平与血浆肌酸激酶与肌钙蛋白 T 峰值显著相关，提示其作为梗死面积指标的潜在价值。血浆 miRNA 水平可有效区分 AMI 与稳定型心绞痛患者——某些 miRNA 上调与高敏心肌肌钙蛋白 T（hs-cTnT）水平变化在时间上对齐。但这些 AMI 特征 miRNA 的表达与不稳定心绞痛患者有重叠，使两种临床情况的区分复杂化。虽然循环 miRNA 谱作为 AMI 诊断生物标志物前景可观，但目前多数研究的证据显示它们并不优于肌钙蛋白——这一定位对评估该领域的"真实进展"至关重要：相比十几年前令人兴奋的发现，循环 miRNA 至今未能撼动肌钙蛋白在 AMI 诊断中的金标准地位。

lncRNAs 在 AMI 诊断上的价值并不落后于 miRNAs。lncRNA MIAT 在区分 STEMI 与不稳定心绞痛患者方面显示出与 hs-cTnT 相同的诊断价值。两种 lncRNAs——ZFAS1 与 CDR1AS——的血浆循环水平被鉴定为 AMI 的独立预测因子。部分 lncRNAs（如 CHAS、UCA1）在血浆中的特征性变化与心梗后经过的时间相关，也可用于区分 AMI 与非 AMI 患者。有建议指出与 mir-126 相互作用并抑制其表达的 lncRNA HOTAIR 是 AMI 的关键介质，可作为 AMI 的生物标志物。

血浆中多种 circRNAs 在 AMI 后上调——TMEM165、UBAC2、ZNF609、ANKRD12、SLC8A1 对区分 AMI 与对照显示出优秀的诊断能力，这五种 circRNA 的组合优于单一 circRNA。除诊断外，部分 miRNAs 还可预测 AMI。内皮细胞富集的 miR-126、miR-17、miR-92a 可在任何类型的血管损伤（先于组织坏死）发生时释放入循环。虽然有研究尝试揭示血浆中预测 AMI 的 miRNA 特征，但发现血小板富集的 miRNAs 显著贡献于循环 miRNA panel，仅 mir-126 不受此影响，可能可用于预测 AMI。血清中 circ-284（circHIPK3）与 mir-221 比值在颈动脉斑块破裂后升高，可作为区分无症状高度颈动脉疾病与急性颈动脉斑块破裂及卒中的有用生物标志物。

AMI 预后生物标志物

心肌缺血造成的损伤导致左心室（LV）重塑，有时进展为心力衰竭（HF）。AMI 患者群体代表 HF 最高风险组，HF 筛查极具价值——这意味着 AMI 出院后的长期监测是循环 RNA 临床应用的重要落地场景。AMI 后预后判断具有挑战性，ncRNAs 的循环表达可对此提供帮助。

miR-150 在血浆中表达下降已被鉴定为 AMI 后 LV 重塑的可靠预测因子。一个结合 4-种 miRNA panel 与 NT-proBNP 血浆浓度的模型显示非心脏富集 miRNAs 对提高 NT-proBNP 预测 LV 功能障碍的价值具有显著潜力——这一组合策略的逻辑是：传统蛋白标志物（如 NT-proBNP）反映心脏整体负荷，而 ncRNAs 可能反映组织重塑过程的细胞信号变化，两者互补。p53 响应性 miRNAs——miR-192、miR-194、miR-34a 的循环水平升高与 AMI 后 1 年的 HF 相关，提示这三种 miRNAs 作为 HF 预测因子的潜在用途。miR-328、miR-134、miR-133a、miR-208b 的血浆水平与 AMI 后患者死亡率具有强关联。

lncRNAs 不仅可作为诊断生物标志物，也可作为预后生物标志物。循环 lncRNA LIPCAR 水平可预测 AMI 后 LV 重塑风险；LIPCAR 在 HF 患者中的血浆水平也与心血管死亡风险升高相关。lncRNA CHAST 水平与心脏收缩功能相关，有潜力成为 AMI 后心脏重塑的独立预测因子。参与心脏发育的 lncRNAs——NRON 与 MHRT——的水平变化对 HF 预测具有显著潜力。HF 中许多血浆表达升高的 lncRNA 发生改变，其作为预后生物标志物的用途仍有待确定。circRNA MICRA 水平降低对 LV 重塑具有预后价值，HF 患者中 has-circ-006296 高水平与 BNP 水平显著相关，提示其作为 HF 新型诊断生物标志物的潜力。

其他潜在用途

房颤是另一种循环 miRNA 谱发生改变的疾病——患者血浆中 miR-1 与 miR-150 水平降低、miR-21 水平升高。房颤可能是心脏手术的并发症，has-cir-025016 水平可作为新发房颤的指标。

血浆 miRNA 水平还可能反映 CAD 中抗血小板药物的效应。传统血小板功能与血小板富集 miRNAs 之间存在显著相关性，使其成为抗血小板治疗反应的潜在指标；使用某些 P2Y12 抑制剂期间或从一种药物切换到另一种时，多种 miRNAs 表达发生变化。血浆 miR-92a 谱与血小板分布宽度（PDW）联合可识别 CAD 患者的阿司匹林抵抗。

本章个人批注

本章一口气梳理了循环 RNA 作为心血管疾病生物标志物从样本采集到临床应用的全链条——前分析因素、提取方法、检测定量、RNA-seq 富集、最后落到具体疾病诊断与预后。这是典型的"方法学综述"型章节，定位介于真正的机制综述（如前几章）与临床实践指南之间，因此对本领域研究者而言更像一份"避坑手册"。

最让我留下印象的是 exRNAQC 联盟的几次大规模比较研究——8 种试剂盒在 RNA 产量上的差异、不同归一化策略甚至对部分靶标产生"完全相反"的输出。这些发现本质上把循环 RNA 领域的核心瓶颈从"我们能不能测"推进到"我们能不能稳定、可重复地测"。对临床转化而言，前者已有答案（dPCR 的绝对定量能力已经足够），但后者仍未解决——这就是为什么到现在为止，没有任何循环 RNA 生物标志物真正进入常规临床实践，而肌钙蛋白依然是 AMI 诊断的金标准。作者没有回避这个矛盾，在多个节段反复重申"标准化缺失"是最大障碍。

另一个值得思考的现象是方法学与生物学之间的张力——同一组样本，不同方法得出方向相反的结论。这种"测量方法决定结论"的现象在 RNA-seq 偏倚章节（接头连接偏好、PCR 重复、UMI 是否真正有用）尤为突出。Androvic 等甚至报告 UMI 可能引入新的定量错误——这与高通量测序中 UMI 通常被默认为"金标准去重工具"的直觉相反，是本章最反直觉的细节之一。

相比机制综述章节，本章的"个人可发挥空间"更小，因为每一条结论都附着在具体引用编号上。我选择不做太多跨章节扩展（如没有把循环 RNA 与之前章节的非编码 RNA 治疗、单细胞测序等议题做连接），避免越界——那些议题在前面的章节已经有更专门的论述，本章聚焦在方法学与临床转化的鸿沟本身。

与上下章的衔接（一段话）

第 17 章位于全书的最后几章之一，紧接 RNA 治疗递送系统章节（Ch16），向前呼应了 Ch14 中 AI/机器学习用于多组学的方法论讨论，向后则衔接全书末尾的临床转化与未来展望类章节。在全书叙事弧线中，本章承接 Ch16 的"如何把 RNA 工具送到体内"——既然 RNA 治疗递送系统已经成熟，下一步自然要问"我们如何监测 RNA 治疗的效果以及疾病的进展"，循环 RNA 作为无创、可重复获取的"液体活检"材料正是这一逻辑落点。本章也呼应 Ch9（细胞外囊泡与外泌体）以及 Ch11-13（各种 RNA 物种机制综述）——前几章讨论的是"RNA 在体内做什么"，本章则把视角切换到"我们能从血液中读到 RNA 说什么"。可以说本章是全书的"实用枢纽"——把前面所有 RNA 生物学与方法学的累积知识收拢到临床转化的入口上。