第 16 章：RNA 治疗递送系统——进展与挑战（RNA therapeutic delivery systems—advances and challenges）

Introduction

本章由波兰波兹南亚当·密茨凯维奇大学（Adam Mickiewicz University）纳米生物医学中心的 Katarzyna Fiedorowicz 与该校实验生物学研究所植物学系的 Łucja Przysiecka 合著。引言开宗明义地点出动脉粥样硬化作为心血管疾病主因的全球疾病负担，并指出当前治疗方案（生活方式干预+药物）所用药物常常伴随消化系统问题、肝损伤、肌痛等副作用以及生物利用度差的局限 [1]。这一治疗瓶颈为发展新型药物（特别是增强疗效、改善患者生活质量）提供了明确的需求。

接着作者将焦点转向 RNA 分子作为治疗手段的进展。RNA 治疗在近几十年间取得了可观的进展，但其实际应用长期受限于分子本身的不稳定性以及较差的递送效率 [2]。作者以 Wolff 等人的小鼠模型实验为例证：在没有载体的情况下，"裸"RNA 在动物体内 30 分钟内即被酶解清除 [3]。这一观察引出关键的技术问题——大分子、短半衰期、负电荷的 RNA 必须借助合适的载体才能进入细胞或组织。

作者随后系统列举了"理想载体"应当具备的关键属性（图 16.1）。载体应具有生物相容性、低细胞毒性；应能通过有效包裹保护 RNA 不受核酸酶降解和水解；应能防止非特异性蛋白吸附（最小化脱靶）；应能优化尺寸与电荷以促进细胞摄取并穿越细胞屏障；应能以适合细胞机器的方式释放核酸（例如促进内体逃逸）；应能靶向特定组织并实现可控释放（时间与空间双重控制）；应在循环中稳定、规避肾滤过、并能从血管外渗进入靶组织 [2]。最后，载体还应能适配不同种类的 RNA 并易于大规模可重复生产。整段引言以"理想载体清单"的形式为后续章节对各类递送系统的评价建立了一个共同的比较框架。

RNA delivery systems

承接前文对载体属性的概括，本节给出 RNA 递送系统的整体分类。文献中通常按引入技术将核酸递送系统分为两大类：病毒载体（慢病毒、腺病毒）和非病毒载体。病毒载体已有大量书籍章节和综述讨论 [5,6]，尽管其在基因治疗中有过令人瞩目的临床成功，但其内在免疫原性风险、有限的载荷包装容量以及生产难度等局限 [7] 限制了其广泛应用。

基于这一背景，作者明确本章的范围与重点：聚焦非病毒载体——这是一个庞大且异质的类别，正随着新型纳米材料与靶向策略的涌现而快速发展。本节的总分类作用是为后文按"脂质基—聚合物基—细胞外囊泡基—靶向—仿生膜包覆"的层级顺序展开各类平台做好铺垫。

Lipid-based nanoparticles

本节系统讨论脂质基纳米颗粒这一最早、最成熟的非病毒递送平台。脂质体（liposomes）作为最早的脂质纳米颗粒，是球形脂质囊泡，由一种或多种脂质双分子层在水性介质中乳化形成 [8]，直径范围 10 nm–1 μm。其主要组分包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。按壳层数可分为单室、多层、多囊泡三种；其内部为水相核心、由脂质膜包被。这种结构使亲水药物可包载于水相核心、疏水药物可嵌入脂双层的烃链区。良好的生物相容性与生物可降解性使其成为有吸引力的递送系统 [9]。脂质体可通过膜融合、脂质交换、内吞、胞饮等多种机制进入细胞 [10]。

为稳定结构并增强内吞效率，脂质体可被聚合物与胆固醇修饰 [11,12]。Doxil 作为 1995 年美国批准的首个临床抗肿瘤脂质体药物，标志着脂质体进入临床应用；此后脂质体被广泛用于抗肿瘤、抗炎、抗生素、抗真菌等药物与基因治疗递送的临床试验 [8,13]。在动脉粥样硬化领域，Kowalski 等 [14] 用阳离子脂质体（lip@EGCG/miR-223）靶向递送 siRNA 进入不同血管床（静脉与动脉）的原代内皮细胞以抑制炎症；Li 等 [15] 用共载抗氧化抗炎药 EGCG 与促脂质外排基因 miR-223 的脂质体以消除动脉粥样硬化斑块。

脂质体包膜通常电中性，但可通过修饰带正电或负电。阳离子脂质体被用来提高核酸转染效率：与 DNA、RNA、寡核苷酸等带负电阴离子通过静电作用形成"脂质复合物（lipoplexes）"——这一作用既增强生物相容性又便于临床应用 [16,17]。最常用的阳离子磷脂为 DOTMA 与 DOTAP [18]；商业化最知名的代表即为转染试剂 Lipofectamine。

在动脉粥样硬化研究中，一个代表性的实验性治疗系统是 VCAM-1 结合肽靶向的阳离子脂质体共载甲基化 NLRP3 siRNA（VCAM-1binding peptide targeting/(PCL)/methylated NLRP3 siRNA）[19]。研究者证明该系统可敲低 NLRP3、抑制 TNF-α 诱导的 NLRP3 炎症小体激活，并阻止 LDL 跨内皮转运。体内（大鼠）实验表明局部给药可有效下调颈动脉内皮的 NLRP3 表达，进而减少 EC 内的致动脉粥样硬化 LDL 沉积，抑制斑块形成。

最后，本节介绍了与 COVID-19 mRNA 疫苗一同崛起的可电离脂质纳米颗粒（ionizable lipid nanoparticles, LNPs）。LNPs 通常由四种组分构成：可电离脂质、磷脂、胆固醇与 PEG-脂质 [20]。可电离脂质尤其关键——它不仅与 mRNA 形成复合物，还能在 pH 变化时调节电荷，从而促进 LNP 的内体逃逸并将 mRNA 释放入胞质 [21]。这类 LNP/siRNA 系统已被用于肝细胞靶向递送 siRNA 沉默 Pcsk9 基因，进而降低 LDL-C，为动脉粥样硬化性心血管疾病提供潜在疗法 [22]（图 16.2）。

Polymer-based nanocarriers

与脂质基类似，聚合物基纳米颗粒可自发组装为多种结构；并且其化学基团多样，能通过共价与非共价相互作用构建 [23]。最常用的核酸递送聚合物包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯亚胺（PEI）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。聚合物 NPs 在尺寸、形状、释药性质上变化多样，已被用于多种疗法的药物递送 [24,25]。

PEI 在生理环境下由于胺基的质子化而带正电 [26]，可与核酸形成阳离子聚复合物（polyplexes），再与细胞表面带负电的多糖相互作用从而增强内吞。Kim 等 [27] 用脱氧胆酸（DA）修饰 PEI 形成可携带 MMP-2 siRNA 的复合物（PEI/DA-PEI/MMP-2 siRNA），可用于动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的抗再狭窄治疗。Ma 等 [28] 则将 miR-146a 与 miR-181b 装入 PEG/PEI 纳米颗粒，再载入 E-选择素靶向微粒（ESTA-MSV）。该系统（ESTA-MSV/PEG/PEI NPs/miR146a 和 miR-181b）在体内外均能缓解内皮炎症与动脉粥样硬化。

天然生物聚合物中，壳聚糖（chitosan）作为带高正电的线性多糖可从真菌、昆虫、蟹等外骨骼中提取的甲壳素加工而来 [29]。壳聚糖 NPs 具有生物可降解、低免疫原性、能携带多种治疗剂的优势 [30]。Nguyen 等 [31] 制备的壳聚糖 NPs（chitosan/TPP/miR-33）可向初始巨噬细胞递送外源 miR-33，从而降低 ABCA1 表达、减少胆固醇外排。

树状大分子（dendrimers）是结构高度对称的支化聚合物，具球形结构，由核心向外发散的树突组成层（每层称为"代"）[32]。其表面带有功能基团（数量随代数倍增），药物可载于核内或接于表面。树状大分子具高载药量、稳定性、单分散性、无免疫原性、尺寸可控与靶向性强等优势 [33]。最常见的两类阳离子型树状大分子为聚酰胺-胺（PAMAM）与聚丙烯亚胺（PPI）[34]。Liu 等 [35] 将寡精氨酸偶联树状大分子负载 siRNA，所得系统（f-PAMPAM-PEG-R9/siRNA）可在体内外下调心肌细胞血管紧张素 II 1 型受体（AT1R）表达、改善缺血再灌注损伤后的心功能恢复。最近的研究还表明，PAMAM 与脂质的非共价偶联可形成"脂树复合物（lipodendriplexes）"，兼具脂质与树状大分子优点 [36]（图 16.2）。

Extracellular vesicle–based delivery system

细胞外囊泡（EVs）是由细胞通过内溶酶体途径天然释放的、单层磷脂膜包被的分泌型细胞器，直径约 30–150 nm [37]。其独特之处在于能携带并转运特定蛋白、脂质、核酸与糖复合物，从而在细胞间通讯、药物递送与诊断中发挥作用 [38]。与前述人工合成系统相比，EVs 表现出高生物相容性、长血液半衰期、低脱靶与低免疫原性 [39]。

在动脉粥样硬化相关细胞（ECs、VSMCs、PLTs、巨噬细胞）激活或凋亡过程中会分泌特定 EVs；这些 EVs 又可反过来促进炎症与斑块形成。外泌体（exosomes）作为 EVs 的一个亚类，富含 miRNA，也携带多种 lncRNA 与 circRNA [40]。由于巨噬细胞是斑块中最丰富的白细胞亚群并在动脉粥样硬化起始与进展中扮演关键角色 [41,42]，其来源 EVs 成为研究的焦点。Wang 等 [43] 指出 MSC-EVs 具有抗炎作用，并在程序性细胞死亡与心肌组织修复中发挥功能——但其作用不仅由非编码 RNA 介导，还涉及蛋白、脂质等其他 EV 组分。Yang 等的研究显示 MSC 来源的 miR-145 外泌体（MSC-Exo/miR-145）可下调 JAM-A，从而在体外减少 ECs 迁移、在体内减少动脉粥样硬化斑块 [44]。Stamatikos 等 [45] 表明 EC 来源的载有 anti-miR-33a-5p 的外泌体（EC-Exo/anti-miR-33a-5p）可调节巨噬细胞与血管平滑肌细胞的胆固醇外排，缓解动脉粥样硬化（图 16.2）。

Targeted delivery

递送系统的靶向机制分为主动与被动两大类。被动靶向利用 EPR 效应（enhanced permeability and retention，即增强渗透滞留效应）：在动脉粥样硬化中，由于血管通透性增加，NPs 在动脉壁的病变区域富集；同时斑块内的巨噬细胞具有强大的吞噬活性，外周单核细胞也可摄取部分 NPs，使 NPs 在病变中累积 [46]。

主动靶向则依赖受体介导的细胞摄取。合成纳米载体出现后，主动靶向随其表面修饰能力而发展 [47,48]。动脉粥样硬化中涉及四大类细胞：巨噬细胞与单核细胞、内皮细胞、泡沫细胞、血管平滑肌细胞。作者将依此分节介绍针对各类细胞的主动靶向策略。

Macrophages and monocyte-targeted delivery

巨噬细胞源自血液单核细胞，在组织稳态与免疫中起核心作用，也是动脉粥样硬化斑块中的主要细胞类型，因此是治疗局部病变的潜在靶点。巨噬细胞表面有多种蛋白受体可作为潜在靶点，包括甘露糖受体、叶酸受体、整合素、CD44、CD36 受体以及其他清道夫受体 [49,50]。

Lee 等 [51] 展示了基于甘露糖靶向的光热治疗策略：甘露糖受体介导的递送使 MAN-PEG-C6 纳米组件在斑块中高度富集，配合光激活可减少斑块炎症（通过产生活性氧 ROS）并诱导巨噬细胞源性泡沫细胞凋亡，体内外均有效果。针对叶酸受体在巨噬细胞上过表达的特性，Guo 等 [52] 开发了口服型脂质-聚合物混合纳米颗粒（FA-LNPs/Nrg），用叶酸修饰并包载抗炎药柚皮素（naringenin）。该系统能有效跨越肠黏膜-上皮屏障、主动靶向主动脉斑块并在病灶巨噬细胞中蓄积。ApoE−/− 小鼠连续口服 3 个月后，主动脉根部斑块面积与坏死核心显著减小，提示该系统在口服主动靶向给药中具有前景。

CD44 受体靶向也被用于动脉粥样硬化治疗 [53]：研究者制备的载姜黄素自组装胶束表面展示寡聚透明质酸（对巨噬细胞选择性更高），体内实验显示主动脉病变面积显著减小。CD36 作为另一种在巨噬细胞表面高度表达的清道夫受体，也参与巨噬细胞吞噬 oxLDL 后向泡沫细胞的转化，因此是潜在治疗靶点 [54]。Kao 等 [55] 开发了单核细胞靶向磁性 NPs（MNPs），将氧化铁 NPs 用 MCP-1 基序功能化以特异性靶向小鼠单核细胞上的 CCR2，用于动脉粥样硬化病变的磁共振成像。

αVβ3-整合素在活化的 ECs 和斑块内巨噬细胞上均有表达，参与调控巨噬细胞成熟、泡沫细胞形成与晚期斑块的新生血管形成，是良好的靶向分子 [56]。Kim 等 [57] 合成的 pluronic 纳米载体包载氧化铁 NPs，通过 cRGD 肽偶联靶向 αvβ3 整合素，用于递送抗炎细胞因子 IL-10 至斑块。该系统在体外显示良好的抗炎效果，并在体内显著减小主动脉斑块面积。

Targeting through adhesion molecules

脂质代谢异常、氧化应激、炎症反应和血流紊乱——这些动脉粥样硬化早期阶段的特征——共同导致内皮激活与功能障碍，并触发一系列黏附分子与炎症趋化因子的表达，包括血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白 1（MCP-1）以及选择素（E-选择素、P-选择素）[58]。这些位于细胞表面的分子和受体可作为靶向基元（肽、抗体及其片段、整合素、内皮特异性配体）的特异结合位点，用于靶向递送 [59]。

VCAM-1 作为多种炎症性病理的靶点，已被一系列肽靶向纳米系统利用 [60]。Kuo 等 [61] 通过噬菌体展示鉴定了 VHPKQHR 肽并将其用于将 miRNA 抑制剂递送至人 ECs，与动脉粥样硬化病灶结合的微囊泡组装。Serrano 等 [62] 用抗 ICAM-1 包被的聚合物载体研究 CAM 介导的内吞通路。Ma 等 [28] 用 ESTA（硫代适配体）靶向 E-选择素，将载有 miRNA 的微粒（由脂质体或微囊泡载入多孔硅纳米孔构成）递送以缓解内皮炎症与动脉粥样硬化。

Targeting of extracellular matrix

动脉壁的细胞外基质富含 IV 型胶原；由于动脉壁中 IV 胶原的量随动脉粥样硬化斑块形成而增加，作者据此推断 IV 胶原可作为靶向药物递送的候选分子 [64]。与 VCAM-1 类似，靶向 IV 胶原的短肽也通过噬菌体展示被鉴定 [65]。近年多项研究 [66–69] 展示了基于 IV 胶原肽的 NPs 在动脉粥样硬化（特别是针对斑块侵蚀）诊断与治疗中的应用潜力。

Whole-cell membrane-coated biomimetic approach

仿生纳米载体是模仿源细胞的新型策略，可在多种疾病的诊断与治疗中发挥重要作用 [70]。该策略不仅增强靶向，还能改善药物在体内的溶解与分布、延长半衰期、降低毒副作用 [71]。其核心是将合成的 NPs 用分离的细胞膜包被，保留膜的天然组分与信号识别分子 [71]。用于动脉粥样硬化靶向的膜主要来自红细胞、巨噬细胞与血小板，其靶向潜力源于这些细胞对动脉粥样硬化斑块与炎症部位的天然亲和性以及炎症归巢效应 [72]。

Macrophage-cell membrane biomimetic nanoparticles

巨噬细胞是构建仿生 NPs 的细胞来源之一。巨噬细胞膜保留了内源性膜蛋白与功能，使系统能有效逃避免疫清除、延长血液循环时间、主动靶向并聚集于动脉粥样硬化斑块 [73]。Wang 等 [74] 用 PLGA 装载雷帕霉素，再以小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 提取的细胞膜包被，得膜功能化仿生 NPs。体内实验显示该系统比未包被 NPs 显著减少脂质沉积、抑制动脉粥样硬化进展，且具低毒与长期释药特性。Gao 等 [75] 用 ROS 响应的壳聚糖寡糖 NPs 载阿托伐他汀，再以巨噬细胞膜包被——膜可避免网状内皮系统清除并将 NPs 引导至炎症组织，由 ROS 响应性 NPs 在该处释放药物；该研究指出药物与膜对炎症因子的隔离作用可协同提高疗效。Sha 等 [76] 用膜包被的 SHP1i 载脂质体 NPs：NPs 与巨噬细胞竞争结合 oxLDL 与脂多糖，从而减少巨噬细胞对新脂质的摄取、抑制泡沫细胞形成、降低促炎细胞因子表达，同时增强巨噬细胞胞葬（efferocytosis）作用，多管齐下抑制斑块进展。

Platelets-membrane coated

血小板（PLTs）是直径约 2–4 μm 的小血细胞，对手术伤口、循环肿瘤细胞与炎症部位具天然靶向性 [77]。血小板在动脉粥样硬化的发生与进展中起关键作用——其倾向于结合动脉粥样硬化病变并对斑块具亲和力。血小板作为仿生系统还具高生物相容性、低巨噬细胞吞噬、延长循环时间等优势 [78]。Song 等 [79] 报道了成功将雷帕霉素（RAP）递送至动脉粥样硬化斑块：雷帕霉素是常用免疫抑制剂，但近期研究表明它能通过诱导自噬促进斑块中巨噬细胞清除、稳定斑块、刺激动脉粥样硬化逆转。Zhou 等 [80] 用血小板仿生的雷帕霉素-PLGA NPs（RAP@PLGA NPs）联合超声靶向微泡破坏（UTMD）技术，进一步提升主动脉区递送效率。Zhuang 等 [81] 提出用血小板细胞膜包被金属有机框架（MOF）作为 siRNA 递送载体：膜涂层提供精确靶向，MOF 核心具高负载效率与 pH 敏感性，可实现 siRNA 从内体到胞质的有效释放。

Red blood cells-coated

红细胞（RBCs/erythrocytes）作为体内长期循环递送载体 [82]，其膜具优异的生物相容性与无免疫原性，使其在仿生 NPs 中被广泛应用（虽然目前主要在癌症治疗中）[83,84]。RBC 膜包被 NPs 的稳定性来源于 RBC 膜的半透特性与膜上高度亲水的多糖 [85]。

Cao 等 [86] 用磷脂酰丝氨酸装载 LTV 药物的 NPs、再以 CLIKKPF 多肽修饰，使治疗剂可经简单共孵育自发包裹——这种红细胞膜包被的前药 NPs 可有效递送至动脉粥样硬化病灶、对病理性的 ROS 累积作出精确响应并加速按需释药。Li 等 [87] 报道了用 RBC 与血小板两种细胞膜共组装的仿生 NPs：载 JQ1（抗纤维化药）的 PLGA NPs 表面被杂合膜包被；血小板膜侧用于靶向心脏肌成纤维细胞与胶原，红细胞膜侧则提供长循环能力与低毒性。

Challenges in the applications of RNA delivery systems

经过多年研究，核酸类治疗的真正临床潜力已经清晰，但要实现安全广泛的临床应用，仍需克服若干挑战（表 16.1）。作者按四大类组织了这些挑战：克服生物屏障、平台的安全性与特异性、体外评估、生产/储存/可扩展性，外加伦理与监管考量。本节末段充当一个总览式的过渡，引出后文五个子节。

Overcoming biological barriers

基于 RNA 的递送系统需克服多重屏障才能将载荷递送至目标。对于静脉给药而言，首要生理屏障是剪切应力与蛋白吸附。这些屏障在病理条件下与健康组织可能有显著差异。因此"一种材料适用所有情境"的策略 [88] 难以实现预期效果，这对动脉粥样硬化递送平台尤为重要：剪切应力特征与损伤部位的免疫细胞会显著影响材料与组织的相互作用 [88]。研究表明，机械敏感性 ECs 在 5 dyn/cm² 剪切应力下以时间和浓度依赖方式增加 NPs 摄取 [89]；NPs 表面修饰或剪切流模式（震荡流）也会显著影响摄取。机械敏感性内皮表面层（ESL）的厚度也是重要因素——动脉粥样硬化区 ESL 厚度降低时，NPs 摄取可被增强 [90]。

当 NPs 暴露于体液或细胞培养基时，其表面会立即被蛋白包被（这一过程称为"蛋白冠形成"）。吸附蛋白的组成取决于暴露时间、蛋白浓度、pH，以及 NPs 的尺寸、柔性、表面电荷与功能基团 [91]。蛋白冠组成对 NPs 的命运（包括生物分布与半衰期）有显著影响 [92]。最初，蛋白冠被视为有效靶向的障碍；但很快发现制造"隐身 NPs"更为困难 [93]。因此反向思路更具吸引力——设计 NPs 时主动吸引特定蛋白以增强对特定细胞类型的靶向 [94]。

蛋白冠蛋白在健康与疾病状态下组成存在差异。例如，糖尿病与肝病患者中白蛋白浓度发生变化 [95]。这凸显出仔细评估递送系统的重要性，也开启了开发疾病诊断分子生物标志物的新可能。但目前蛋白冠研究方法学仍欠成熟，易导致数据误读；现行解决方案包括建立标准化流程 [96]。另一个常被忽视的因素是静脉 NPs 可被动转运至淋巴系统：Manolova 与 Reddy 等 [97,98] 的研究表明 NP 尺寸起关键作用，<200 nm 的颗粒可进入淋巴管，且 10–20 nm 的较小 NPs 摄取效率高于约 100 nm 的较大 NPs。Verbeke 的研究表明 PEG 可进一步增强这种转运 [99]；表面化学也影响 NPs 在淋巴管/淋巴结的蓄积 [100]。

对于口服给药，挑战更多——递送系统需首先耐受胃肠道的酸性、酶解环境。保护活性物质最简单的方法是药物包封；同时合理选择系统类型、适当化学修饰、添加蛋白酶抑制剂或渗透增强剂 [101]。随后还需跨越细胞膜屏障（融合或吞噬）：许多 NPs 经内吞进入细胞 [102]，被包裹进内体；Gilleron 等 [103] 的研究表明 siRNA 载脂质 NPs 在不同细胞类型中经不同机制内化，且仅 1%–2% 的 siRNA 载荷能成功从内体逃逸。Qiu 等 [104] 综述了三大主流策略：促进内体/溶酶体逃逸（海绵效应、溶胀、渗透裂解）、直接跨膜（膜融合）、规避溶酶体（运输至高尔基体/内质网）。Wang 等 [105] 近期研究展示了非共价相互作用的预测：通过调整组氨酸残基数量与周围疏水接触，可微调氢键网络并实现 pH 偏移，从而使肽能从内体逃逸、转染效率提高 9 倍；改变肽的手性后可使 siRNA、pDNA、mRNA 的转染效率达到 90%。

Safety and specificity of platforms

医学纳米技术的核心挑战之一是开发能在体内完全代谢和清除（经肾或肝途径）的递送系统 [106]。生物可降解系统的概念颇具前景——其分解产物（水、二氧化碳、乳酸、乙醇酸等）易于代谢 [107]。然而这类系统尚未被广泛应用。

目前大多数研究只关注递送材料的药代动力学，而非载体本身 [108]，凸显出 NPs 毒代动力学研究的迫切需求 [109]——日常生活中我们通过摄入、吸入、皮肤接触甚至注射持续暴露于各种 NPs，其在器官与组织中累积，对神经、呼吸、内分泌与生殖系统的毒性已被记录 [110]，机制包括细胞毒性、基因毒性、氧化应激与炎症。值得注意的是，在肿瘤治疗中仅约 1% 的 NPs 能到达靶点、其余 99% 蓄积于其他器官与组织；而在动脉粥样硬化治疗系统中，类似的定量估计尚未完成。

特定系统的总体毒性难以预测，取决于细胞类型与 NPs 特性（尺寸、电荷、表面化学）。例如较小 NPs 易穿过 EC 间紧密连接进入各器官；~6 nm 的小尺寸、阳离子 NPs 可借电荷作用跨过肾脏滤过屏障（与阴离子型相反）[111]。NPs 的代谢能力也受给药途径与特定疾病条件影响。例如 PLGA NPs 是研究最成熟、FDA 批准的生物可降解递送系统之一，但口服会在肝脏蓄积；静脉给药于糖尿病小鼠模型则在肠道蓄积，导致肠道酸化、菌群变化与肝脏转录重编程——具体表现为线粒体功能下调、炎症与细胞激活通路增强 [112]。在"消除/生物降解"与"最佳清除率"之间取得平衡是核心难题——尤其清除率必须慢到足以实现有效递送与靶向。

另一个关键挑战是 RNA-NPs 与靶点之间特异选择性互作的实现。非特异性与脱靶效应可来源于两方面：外源 RNA 本身或递送平台本身。前者的多项研究 [113,114] 显示 RNA 给药可引起免疫反应与细胞因子释放，严重程度呈剂量与 RNA 结构依赖。递送平台的结构、电荷与尺寸也起关键作用：Ozoplat 等 [115] 揭示阳离子脂质可激活补体系统，导致被网状内皮系统的巨噬细胞快速清除；其他研究表明阳离子 NPs 与阴离子血清蛋白或调理素的相互作用可引发溶血；阳离子 NPs 还以剂量依赖方式表现肝毒性。

另一个被广泛报道的问题是聚乙二醇（PEG）的使用。PEG 因延长循环时间、屏蔽 NPs 表面免受降解酶影响、影响 NPs 尺寸而成为众多递送系统的常用组分，但存在若干潜在缺点：PEG 不可生物降解，会以空泡形式蓄积于肾细胞胞质 [117,118]（机制尚未阐明）；还可引起延迟或速发型超敏反应 [119]，包括过敏性休克 [120]。当前已尝试多种降低 PEG 负面影响的方法：Mima 等 [121] 在小鼠模型中将神经节苷脂整合到 PEG 化脂质体；另一思路是用无毒、无免疫原性、可生物降解的多肽 PAS [122]；颇具前景的替代方案是用红细胞、白细胞或血小板的天然膜功能化 NPs——这种仿生方法可使颗粒在注射后血液中滞留达 72 小时 [123]，但仿生方法尚未充分标准化，免疫原性评估的需求也被提出 [124]。另一有前景的替代是透明质酸——可生物降解、对 CD44 具亲和力 [125]、可靶向炎症部位 [126]。

药物释放不受控也会带来不良效应，从而推动了"刺激响应递送系统"的发展。外源性触发（激光、磁、超声）可提高疗效并降低毒性；但对动脉粥样硬化而言，由内源性触发（活性氧升高 [128]、酸性 pH [129]、剪切应力响应 [130]）激活的系统更具前景——斑块部位就具备这些条件。剪切应力响应的药物在血流暴露下改变电荷或形状并释放载荷 [131]。最早的一批剪切应力响应纳米药物（PLGA 包被组织型纤溶酶原激活物）与脂质体凝胶由 Korin [132] 与 Lee [131] 于 2012 年发表。这类递送平台还可与心瓣膜、LVAD 等医疗器械结合使用以减少血栓并发症 [133]，但要充分发挥其潜力，首先需要解决体外评估方法的问题。

In vitro evaluation of RNA delivery systems

传统上，动脉粥样硬化研究采用单层培养的血管平滑肌细胞、ECs 和巨噬细胞细胞系 [134]。但 Chen 等 [135] 总结的表格显示该技术培养的细胞分化不当、对难代谢药物的抵抗力弱 [136]。更先进的直接（层叠）或间接（多孔膜分隔）共培养系统 [135] 在建模疾病发病机制、测试药效、发现新靶点方面有用 [137]，但也有局限 [138]。三细胞共培养虽能较准确反映人血管生物学，却成本高、耗时长，且重现性与均一性难以保证 [134]。

动脉壁细胞对机械载荷的响应也需考虑。体内血管承受静水压、脉动血压、剪切应力等多种血流动力学作用；剪切应力大小与模式取决于血管直径，范围 1–70 dyn/cm² [139]；在病变血管（如易损斑块）中远端可达 100 dyn/cm²，近端近其两倍 [132,140]。15 年前即有锥板装置、轨道摇床等体外剪切应力应用模型 [141,142]，但用于纳米药物测试并未普及。微流控技术的进步允许构建尺寸与几何精确定义、流量严格调控的通道；剪切应力传感器可被整合实现实时反馈控制 [143]。更先进的设备可支持三维细胞培养（lab on a chip），具备精确、可重现的高通量筛选能力 [144]。然而尚未有论文报告用此类平台测试动脉粥样硬化 RNA 递送系统。值得一提的是，微流控系统已用于 RNA 载脂质 NPs 的可重现制备 [144]。尽管 3D 模型应是测试 RNA 递送系统的目标，但目前仍缺乏完善的验证方法。

细胞培养技术虽已大幅进步，但并非所有问题都能在体外模型中解决——生物分布与脱靶效应需由动物模型确认 [145]。但这并不简单：Paunovska 等 [146] 表明在巨噬细胞与 ECs 上的体外研究并不能很好预测体内递送效果，可能筛掉了许多优秀的体内候选递送系统。意识到纳米技术专家开发的潜在递送系统远超可测试的数量，同一团队开发了高通量条形码系统，可在小鼠模型中同时功能评估多个 mRNA 递送系统 [147]。

Manufacturing, storage, and scalability of RNA cargo, nanomaterials, and RNA delivery systems

RNA 治疗剂的生产涉及多个步骤：首先设计、制备、纯化 DNA 模板；接着进行 RNA 合成、纯化与修饰；同时开展所需纳米体系的合成与理化参数评估；最后将核酸封装或吸附到 NPs 中。每个步骤都需要仔细规划、优化与评估。DNA 模板的元件、酶/化学法生产与纯化技术已在多篇文献中详述 [148,149]；较长 mRNA 序列通常经体外转录生产，较短序列（如 miR、siRNA）则化学合成。RNA 生产过程中会被 dsRNA、未加帽 mRNA、mRNA 片段等副产物污染——这些副产物干扰 mRNA 翻译、高估 mRNA 总量或激活免疫反应；预防策略包括 HPLC、纤维素阴离子交换剂 [150]、氢键或两者组合的纯化 [151]。通过 RNA 化学修饰可进一步改善翻译效率与稳定性 [152]，对基于静电吸附的递送系统尤其重要（RNA 暴露于酶的程度更高）。改善线性 mRNA 表达最常见的修饰包括添加 5′ 帽、poly-A 尾、以修饰核苷替换尿苷 [153]。将 RNA 生产与纯化整合为单一流程（虽仍具挑战）可减少冻融循环、最终提高产物产量与质量。但更长 RNA 产物的运输与储存稳定化仍是难题。Fang 等 [154] 2023 年在 Nature Chemistry 报告的"cloaking"反应是较有前景的策略——在核糖 2′ 位羟基上进行可逆酰化，显著增强 RNA 的热稳定与酶稳定性（不依赖长度与来源），且该反应可在人细胞内自然逆转或通过添加水溶性亲核试剂化学逆转。

粒子的合成（纳米或更大）通常分为物理、化学、生物三大类 [155]。NP 材料类型（金属、脂质等）决定其关键性质，从而适用于不同医学应用。纳米技术的主要难点是合成重现性（即使在实验室规模），这极大影响对形状与尺寸的精确控制。另一挑战是工艺中常需高温或对 RNA 有毒的化学溶剂，使规模化生产成本高。重现性问题在 EV 这类天然递送系统中尤为突出——EVs 来自不同细胞类型，其组分随细胞与环境条件而变化，导致批间差异显著。另一主要障碍是缺乏 EV 分离与表征（含脂质、蛋白、核酸）的标准化方案。

储存是另一重要问题，NPs 稳定性指形状、尺寸、聚集、组成与表面化学等多属性的保持。金属 NPs（如金、银）的稳定 NPs 货架期常可达 2 年以上 [156,157]。树状大分子、聚合物星等可冻干后于 -20°C 或室温长期储存。某些脂质体仅能在室温保存 4–5 周、某些可在 4°C 保存。储存温度与时间影响囊泡（含外泌体）的稳定性：-80°C 长期储存的外泌体在大小、形态、活力与生物活性上与新鲜分离样品有差异。已实施的改进包括冻干、液氮气相（-150°C）或低温保存；冻伤是低温储存的另一问题，研究 [158,159] 显示可通过添加渗透型或非渗透型冷冻保护剂有效克服。

治疗性 RNA 可在合成过程中或合成后加入 NPs。前者要求合成过程中保持友好的 RNA 环境（温度、无核酸酶水、无毒溶剂）；后者则在严格控制条件下（络合时间、温度、关键的 RNA:NPs 质量比）通过静电吸附实现。需强调的是，未修饰 NPs 最终产物——RNA 递送系统——在理化参数、生物活性、稳定性与储存条件上可能差异巨大；故终产物的理化与生物参数评估至关重要。值得关注的是研究发表中合成与修饰方法学描述的不足：许多研究未详细给出条件或浓度，特别是常用总 NPs 浓度而非总 RNA 浓度。不同 NPs 在载药量、释放动力学（也常被忽略）以及关键的 RNA:NPs 比上差异显著——信息缺失使不同研究、不同递送系统的对比几乎不可能，尤其是后者需要为每个系统细致优化。这种发表态度导致其他研究者难以重现合成，浪费时间与资源；另一可能原因则是将 NPs 发展为商业产品的考量。

Ethical and regulatory considerations

尽管 RNA 递送平台近年来取得显著进展，伦理与监管层面的关键挑战仍然存在 [160]。如前所述，目前仍缺乏纳米材料对人体健康影响的综合研究——这一不确定性应反映在患者知情中。例如，基于纳米技术的治疗知情同意书应声明该类治疗仍处早期评估阶段，长期风险与受益在当前科学知识下尚不能完全阐明。需特别指出的是，目前对纳米技术产品尚无专门监管规定，只有非约束性建议。例如 2019 年 REFINE 联盟（Regulatory Science Framework for Nano(bio)material-based Medical Products and Device）发布白皮书，尝试统一纳米医学、纳米医疗器械、纳米健康产品相关的术语与定义；联盟也描述了关键挑战，例如对纳米技术产品的监管信息需求或适当表征纳米材料的方法 [161]。Gottardo 等 [162] 建议监管应在设计早期就考虑纳米材料的安全性与可持续性，而非待后期再控制与测量其对人体健康与环境的影响；监管还应涵盖用于食品、食品包装与农业的新型材料。

伦理与监管考量不应仅限于人体健康，也应涉及 NPs 对环境的影响。我们对纳米材料在植物与动物中的长期影响数据仍不足；初步报告显示银 NPs 对水生生物有显著影响 [163,164]。因此需要进一步研究 NPs 的环境影响并发展更环保的合成与处理方法 [165]。NPs 的环境释放应通过框架（安全标准、分类与标签系统、生态系统监测）监管，但此类监管的建立可能耗时长。

本章个人批注

本章是全书 Ch15（RNA 治疗策略）之后的"递送工程"专章，与 Ch15 形成自然的"药物 ↔ 载体"配对。读完后给我的整体印象是：作者采取"理想载体属性 → 主要非病毒平台分类 → 主动靶向策略 → 挑战与展望"这一由抽象到具体的递进结构，每一类平台都给出了代表性的动脉粥样硬化应用案例，使综述对临床读者具有较强的可读性。值得注意的几点：(1) 序章提出的"理想载体属性清单"在后续每一节都被反复参照——这本身是一种把"性能指标"贯穿全文的写法，对工程师读者比对生物学者更友好；(2) 脂质体部分对 LNP 的发展给予了相当篇幅（与 COVID-19 mRNA 疫苗背景挂钩），这反映了 2021 年后 LNP 在核酸递送领域的主导地位；(3) 细胞外囊泡部分特别强调"不仅是非编码 RNA 起作用"——这一提醒对只想关注 RNA 的读者是一个方法论上的校正；(4) 主动靶向部分按"巨噬细胞/单核 → 黏附分子 → ECM → 仿生膜"的顺序展开，逻辑上从"细胞表面受体"逐步过渡到"组织水平"再到"整个细胞伪装"，是一个层层升级的策略谱系；(5) 挑战部分五大节非常实用——"蛋白冠"、"PEG 替代"、"刺激响应"、"3D 体外模型"、"工艺重现性"分别对应了不同阶段的实际问题，对刚进入该领域的研究者具有路线图价值；(6) 伦理与监管一节虽短但有现实意义——尤其是"研究者发表不充分描述方法可能是商业化考量"这一观察，作为该领域"非技术性瓶颈"的诚实揭示，值得在文末呼应。

与上下章的衔接（一段话）

在全书结构中，Ch15 探讨了 RNA 治疗本身（适配体/ASO/RNAi/RNA 编辑），Ch16 则把视角转向"如何把这些分子送到目标位置"——这是 Ch15 末尾点明的"三大挑战之一：建立精准递送系统"的直接承接。本章系统展开了非病毒载体的工具箱（脂质 → 聚合物 → EVs → 仿生膜）与主动靶向策略（细胞表面受体 → 黏附分子 → ECM），并以"五大挑战"（生物屏障、安全性、体外评估、工艺、伦理监管）作为综述的现实落点。从 Ch16 到 Ch17 的衔接呼应是自然的：Ch17 的"循环 RNA 生物标志物"侧重"基于 RNA 的诊断与无细胞检测"——这是同一分子家族的另一类临床应用（detect 而非 deliver），与 Ch15/Ch16 的"治疗"层形成"诊断-治疗-递送"的完整三角。本章末尾的"发表方法学不充分"问题也间接预示了 Ch17 中标准化与可重现性议题的持续重要性。