第 4 章：非编码 RNA 的生物发生与作用机制（Biogenesis and mechanisms of action of ncRNAs）

引言（Introduction）

2020 至 2024 年间，RNA 研究领域三次获得诺贝尔奖，这些进展使人们对细胞内 RNA 分子的多样性、功能与调控的认识显著深化。早期的认识假设细胞 DNA 编码的 RNA 几乎全部用于蛋白质合成，但高通量测序技术揭示了人类基因组中只有不到 3% 的 RNA 分子能够编码蛋白质——即信使 RNA（mRNA）；其余超过 80% 的转录本虽然由人类基因产生，却不具有编码蛋白质的能力，这类分子被称为非编码 RNA（ncRNA），它们在基因表达调控中扮演主要角色。根据大小，ncRNA 可分为小 ncRNA 和长 ncRNA（lncRNA）；小 ncRNA 中包含因 2024 年诺贝尔医学奖授予 Ambros 与 Ruvkun 而广为人知的 microRNA（miRNA）；lncRNA 则既可以以线性形式存在，也可以以环状形式存在，本章将重点讨论环状 RNA（circRNA）。图 4.1 展示了 RNA 家族的分类框架：从编码能力（编码/非编码）、大小（小 ncRNA < 200 核苷酸或长 ncRNA > 200 核苷酸）、功能或作用机制（基因表达调控、蛋白质合成）以及细胞内定位（细胞核/细胞质）四个维度对各类 RNA 进行划分。该图涵盖了本章将要讨论的 circRNA、lncRNA、miRNA、mRNA、ncRNA，以及 piRNA、rasiRNA、rRNA、scaRNA、siRNA、snoRNA、snRNA、tiRNA、tRNA 等其他 RNA 种类。

MicroRNA（MicroRNAs）

miRNA 是一类长度约 19–22 个核苷酸的单链小非编码 RNA。miRNA 在 1990 年代上半叶由 Victor Ambros 与 Gary Ruvkun 实验室首先发现，这一发现使他们获得了 2024 年的诺贝尔生理学或医学奖。miRNA 作为转录后基因表达调控因子，通过与靶 mRNA 结合降低其蛋白质合成水平。已知 miRNA 及其基因或基因家族主要记录在两个数据库中——mirbase.org 和 mirgenedb.org，两者提供相似信息但在命名规范上存在差异，本章采用与 NCBI Gene 数据库最一致的 miRBase 命名系统。除少数历史原因形成的例外（如 let-7 家族），miRNA 命名大体上基于发现与验证的先后顺序，给每个 miRNA 基因指定一个特定编号，例如重要的血管内皮 miRNA 基因被命名为 miR-126；物种来源以三个字母前缀表示（人源 hsa-miR-126）。由于每个 miRNA 基因可产生两条潜在成熟 miRNA，成熟 miRNA 来源于前体发夹哪一侧的标识被加到命名中（如 hsa-miR-126-5p 与 hsa-miR-126-3p）。早期曾用星号（hsa-miR-411*）标记被认为降解的"过客链"，这一方式现已不再使用。序列与靶 mRNA 组高度相近的 miRNA 在同一编号后加字母区分（如 hsa-miR-30a 至 hsa-miR-30e）；而具有完全相同成熟序列但来源于不同基因的 miRNA 则用数字区分（hsa-miR-329-1 与 hsa-miR-329-2）。动物 miRNA 的生物发生与作用机制已被广泛研究，最新综述由 Chen 与 Kim（[6]）撰写；许多 miRNA 的生物发生与作用机制在演化中高度保守，但植物与动物 miRNA 之间存在明显差异，本章将专注于动物 miRNA。

典型 miRNA 生物发生（Canonical microRNA biogenesis）：与蛋白编码 mRNA 相同，miRNA 由其自身基因直接编码，主要由 RNA 聚合酶 II 转录。miRNA 基因可采取多种形式：一些由独立基因转录，拥有完整的上游与下游调控区；另一些则从多顺反子位点共转录，同时编码 2 到 50 余个 miRNA。由于体积小，部分 miRNA 基因嵌入蛋白编码基因或 lncRNA 基因的内含子区，这些 miRNA 通常与其宿主基因共转录并反过来调控宿主基因表达。初级 miRNA 转录本 pri-miRNA 折叠成发夹结构，包含不少于 11 个核苷酸的末端环、约 35 个碱基对的双链茎以及不少于 9 个核苷酸的两条单链尾部；多顺反子 pri-miRNA 的"尾部"实际上是连接多个发夹结构的连接序列，每个发夹经"微处理器"切割形成 miRNA 前体 pre-miRNA。微处理器由两个 DiGeorge 综合征关键区基因拷贝（DGCR8）和一份 RNase III 酶 DROSHA 组成，并伴有潜在的刺激或抑制因子，其功能类似分子尺，测量双链茎长度并引导 DROSHA 的两个 RNase III 结构域在两处切割 pri-miRNA，去除尾部与部分双链茎，留下约 65 个碱基对的发夹结构和 3' 端 2 个核苷酸的突出。所得 pre-miRNA 与 Exportin 5-RNA-GTP 复合物结合，被运输出核进入细胞质。在细胞质中，pre-miRNA 被第二种 RNase III 酶 DICER 再切割一次，去除末端环，形成不完全双链的 miRNA 双链体。在人类中，反式激活反应元件 RNA 结合蛋白（RBP）和 PKR 蛋白激活剂作为 DICER 的辅因子，其他因子也可能影响 DICER 的切割效率与精度。miRNA 双链体随后通过热休克蛋白 70 和 90 装载入 AGO2 蛋白；AGO2 负责 miRNA 链的选择，将双链中的一条整合入 RNA 诱导的沉默复合物（RISC），另一条被丢弃降解。5' 端和 3' 链均可被装载入 RISC 复合物，但通常存在明显偏好——AGO2 似乎更倾向于 5' 端热稳定性较低的链；然而也存在一些 miRNA 双链体（如 miR-126），其 5' 链和 3' 链都能轻易被 RISC 装载，还有 miRNA 在病理条件下会发生链选择的切换。

典型 miRNA 生物发生的调控（Regulation of canonical microRNA biogenesis）：尽管 miRNA 生物发生通路已被充分描述且高度保守，miRNA 的表达水平很大程度上仍由个体 miRNA 的生物发生效率差异决定。对多顺反子 miRNA 基因而言，转录后调控是 miRNA 表达的主要决定因素。例如，人类已知最大的 miRNA 基因簇由 14q32 染色体印记区 DLK1-DIO3 表达，编码 54 个独立 miRNA，尽管共享同一"超基因"，这 54 个 miRNA 在人类细胞与组织中却表现出广泛的表达水平差异。在刺激下，这些差异更为显著——在缺血条件下，14q32 miRNA 在人血管中表现出三种不同的响应模式（非响应者、慢响应者、快响应者），而每种 miRNA 归属于哪一模式完全独立于其在 miRNA 超基因中的位置。miRNA 生物发生的 DROSHA 与 DICER 切割步骤均存在大量增强、调控、引导与抑制 miRNA 生物发生的因子与通路，相关知识已在多篇综述中总结（Michlewski 与 Cáceres，[10]）。RNA 结合蛋白（RBP）的调控：微处理器和 DICER-pre-miRNA 复合物均可纳入多种刺激性或抑制性辅因子，以 miRNA 特异性的方式调控生物发生速率；多数辅因子被认为是直接识别并结合特定初级或前体 miRNA 的 RBP。众多 RBP 的关键识别位点是 pri/pre-miRNA 的末端环——足够的环长度与特定序列基序允许选择性 RBP 结合并随后调控 DROSHA 或 DICER 切割。RBP 结合可在特定（病理）生理条件下促进 miRNA 加工（如 14q32 miRNA 所示），也参与组织特异性 miRNA 表达（如脑特异性 miR-7 表达）。许多研究试图寻找 miRNA 前体序列中诱导较大 miRNA 组共同调控 RBP 通路的共有特征或序列基序，但有充分证据表明存在多种仅作用于单个或最多小群不同 miRNA 前体的 RBP。ADARs、A-to-I 编辑与 isomiRs：能够作为辅因子调控多个 miRNA 前体生物发生的一大类 RBP 是 ADARs（作用于双链 RNA 的腺苷脱氨酶）。特别是 ADAR1 的两个剪接变体 ADAR1p110 和 ADAR1p150 以及 ADAR2 可以结合 pri- 和 pre-miRNA 并影响加工效率与特异性。ADARs 最广为人知的是其脱氨酶活性——将腺苷残基转化为肌苷，由于肌苷被细胞机器读为鸟苷，这种"A-to-I 编辑"会改变遗传密码。ADARs 引起的 A-to-I 编辑可改变 miRNA 靶 mRNA 识别（通过改变种子序列），也可通过改变 pri/pre-miRNA 序列基序、末端环长度或双链茎长度而改变 miRNA 加工速率。作为 RBP，ADAR 与 miRNA 前体的相互作用也可独立于催化活性直接影响加工速率；但具体调控方向仍存争议——既有研究表明 miRNA 加工被 ADAR 增强，也有证据显示 ADAR 可与 DGCR8 竞争结合 pri-miRNA，从而减少 DROSHA 对 pri-miRNA 的切割。ADAR1 还参与一种非常特异的 miRNA 生物发生调控——isomiRs 的成熟选择。即使 DROSHA 和 DICER 的切割看似高度调控且精确，这两种酶实际上可在偏离其"典型"切割位点最多 2 个核苷酸的不同位点切割 miRNA 前体，产生 isomiRs；这些 isomiRs 也受到严格调控并执行高度特异的生物学功能，许多 isomiRs 比其典型对应物表达更为丰富。3'-isomiRs 可影响 miRNA 的稳定性与清除速率，5'-isomiRs 则直接改变 miRNA 的种子序列从而改变其靶 mRNA 集合——一个显著的例子是 miR-411-5p 的 5' isomiR 由 DROSHA 在 pri-miR-411 典型切割位点上游 1 个残基处切割产生，ADAR1 选择性促进 DICER 将这种 5'-pre-isomiR 切割为人血管中的成熟 5'-isomiR-411-5p。化学修饰的调控：A-to-I 编辑远非唯一能影响 miRNA 生物发生的 RNA 修饰。2015 年 Alarcón 等人发现 pri-miRNA（而非 pre-miRNA）序列富含 GGAC 序列基序，可作为甲基转移酶样 3（METTL3）的识别模式——该酶负责将 RNA 腺苷残基转化为 N6-甲基腺苷（m6A）。作者证明 pri-miRNA 尾部的 m6A 甲基化促进 DGCR8 识别，从而增强 DROSHA 切割与 miRNA 加工；此后多项研究证实 METTL3 诱导的 pri-miRNA m6A 通过微处理器增强 miRNA 生物发生。成熟 miRNA 上也存在 m6A 甲基化，但这更可能影响其靶结合效率而非加工速率。Garbo 等人近期研究表明成熟 miRNA 的 m6A 甲基化也可能将这些特定 miRNA 标记为装载入细胞外囊泡的货物；分泌后被靶细胞重新摄取并随后经脂肪量与肥胖相关蛋白（FTO）去甲基化，这些 miRNA 在宿主细胞而非其亲代细胞中靶向 mRNAs。其他修饰（如 N4-乙酰胞苷）也可标记初级 miRNA 以结合 DGCR8 并被微处理器加工。lncRNA 的调控：本章提到的最后一类 miRNA 生物发生调控因子是 lncRNA。尽管对 lncRNA 复杂作用机制的了解还处于初步阶段，但已有研究表明 lncRNA（包括 Uc.283+A、RNCR4 和 NEAT1）可影响微处理器对初级 miRNA 的加工。

miRNA 的非典型生物发生（Noncanonical microRNA biogenesis）：与典型通路相对应，miRNA 也存在非典型生物发生通路。虽然可能远不如典型通路常见且明确，但 miRNA 或至少 miRNA 样小 ncRNA 也可通过其他小 ncRNA 的切割形成（[26]）。tRFs：2009 年 Cole 等人发现小 RNA 测序实验中经常出现的小 tRNA 衍生降解产物并非随机降解产物，而是经主动产生的小 ncRNA。作者证明 DICER 负责将 tRNAGLN 切割为 19-mer 的 miRNA 样 tRNA 衍生片段（tRF）；然而作者也证明该 tRF 与 AGO 蛋白的关联（这是形成 RISC 复合物的条件）相比典型 miRNA miR-21 要弱得多。此后许多研究声称 tRF 具有 miRNA 样功能，但只有少数研究真正调查了完整的 miRNA 作用机制，因此在解释此类研究结果时应保持谨慎。snoRNA 衍生 miRNA：与 tRNA 类似，几项研究表明小核仁 RNA（snoRNA）也可被加工为 miRNA 样小 ncRNA，这些 RNA 确实能与 AGO 蛋白关联，支持其潜在的 miRNA 样功能。鉴于哺乳动物细胞和组织中表达有许多"孤儿" snoRNA（即没有已知典型靶标 snRNA 或 rRNA 的 snoRNA），人们有理由推测这些 snoRNA 可能事实上是一类非典型 miRNA，但迄今为止关于 snoRNA 衍生 miRNA 广泛存在的证据仍然有限。

MicroRNA 的典型作用机制（Canonical mechanism of action of microRNAs）

miRNA 的典型作用机制与生物发生一样已被广泛研究并在多篇综述中详细描述，本章同样引用 Chen 与 Kim（[6]）的最新综述。少数研究报道了 miRNA 的非典型作用（特别是与 5'-UTR 和编码 mRNA 序列的结合），但此类发现罕见，本章不予进一步描述。一旦装载到 AGO2 上即形成 RISC 复合物，miRNA 能够与靶 mRNA 3'UTR 中的互补序列结合。在植物中 miRNA 与靶 mRNA 的完全互补导致靶 mRNA 的切割与降解，而在动物中 miRNA 仅以部分互补结合，导致 mRNA 脱腺苷酸化与翻译抑制。动物 miRNA 通过其"种子区"（由 miRNA 5' 端第 2–7 位核苷酸组成，优先为第 2–8 位）识别并结合靶 mRNA；因此 A-to-I 编辑和 5'-isomiR 形成都可直接影响 miRNA 靶标选择。若靶 mRNA 中 miRNA 响应元件（MRE）在 miRNA 第 1 位核苷酸对面有一腺苷，由于 AGO 具有容纳该腺苷的口袋，靶结合会进一步增强；miRNA 序列下游的额外碱基配对也可增强 miRNA-mRNA 相互作用。随后通过 AGO 的辅因子 TNRC6 启动靶 mRNA 的脱腺苷酸化、脱帽与翻译抑制。一般而言，miRNA 对单个靶蛋白表达的影响较微弱，但由于单个 miRNA 可靶向同一通路或基因程序中的多个 mRNA，单个 miRNA 对细胞与组织功能的影响是显著的——miRNA 不是调控单一蛋白表达，而是能够调控完整的生理过程。

LncRNA（LncRNA）

LncRNA 的发现（Discovery of lncRNAs）：ENCODE（DNA 元素百科全书）项目阐明了功能性 ncRNA 的存在，证明人类基因组约 80% 被转录为 RNA，其中只有一小部分编码蛋白质。lncRNA 约占转录调控 ncRNA 的 80%，已成为心血管病理生理学中的关键调控因子。lncRNA 是一类长度超过 200 核苷酸（[31] 引用为 >500 核苷酸——这是常见但略有不同的阈值界定）的大型 ncRNA，构成人类基因组的主要转录输出但不翻译成蛋白质。与 mRNA 不同，lncRNA 含较少的外显子、进化保守性较低且表达丰度较低。人类基因组的全面转录也揭示了数千个尚未注释的 lncRNA。lncRNA 研究领域从一开始就面临许多不确定性和争论，但学术界约定其广义定义涵盖一组大型且高度异质的转录本，它们在生物发生与基因组来源上各不相同。人类基因组包含超过 16,000 个 lncRNA，主要包括由 RNA 聚合酶 II（Pol II）转录的 lncRNA；其他 lncRNA 也由其他 RNA 聚合酶（如 RNA Pol I 和 Pol III）转录，并包括从基因间区转录的长基因间非编码 RNA，以及与其他基因重叠的有义或反义 lncRNA 转录本。大部分 lncRNA 的表达在转录水平受到调控，许多 lncRNA 在各种基因调控机制中发挥直接作用。已积累的大量证据表明越来越多的 lncRNA 具有重要的细胞功能，使其分类超越了单纯的转录副产物。专业数据库已被开发用于编目与心血管疾病相关的 lncRNA，提供全面的序列数据。最近开发的 RNA 捕获长测序技术促进了 lncRNA 全长的注释，该技术显示 lncRNA 与 mRNA 在长度上差异很小，但 lncRNA 含较少且较长的外显子。CRISPR/Cas 系统在心血管研究中用于探究 lncRNA 功能发挥了关键作用。深度学习技术与计算方法的结合可增强对 lncRNA 功能的理解，并有助于预测其相互作用及在心脏相关生物过程中的作用。最近深度测序与转录组重装配技术使专门用于检测新 lncRNA 的工具得以开发，例如 TRIAGE R 包可在批量与单细胞 RNA-seq 数据集中分析调控元件，在单碱基分辨率下利用细胞约束评分进一步细化功能性 lncRNA 的识别——特别是那些作为细胞身份关键调控因子的 lncRNA；联合水平的组蛋白修饰标记（如 H3K27me3）正被用作识别细胞类型特异性调控域的代理。这一方法可用于验证已有 lncRNA 并识别动脉粥样硬化中的新 lncRNA。

LncRNA 的生物发生（Biogenesis of lncRNAs）：近期研究阐明了 lncRNA 的生物发生及其在心血管疾病中的作用，为潜在的治疗途径提供了洞见。该过程受到严格调控，确保精确的表达模式，这对正常细胞功能至关重要。lncRNA 的转录与加工与蛋白编码区类似——在 3' 端进行多聚腺苷酸化，在 5' 端进行 7-甲基鸟苷帽化。多数 lncRNA 由 RNA Pol II 转录，部分由 RNA Pol III 转录，来自非蛋白编码基因组区域，包括基因间、内含子与反义序列。值得注意的是，启动子和增强子区分别被转录为上游启动子转录本和增强子 RNA。虽然 lncRNA 缺乏典型开放阅读框（ORF）且传统上被视为非编码，但核糖体谱分析与蛋白质组学的最新进展已在某些 lncRNA 中鉴定出小 ORF（sORF）。这些 sORF 可翻译为生物活性微肽，调控线粒体功能、细胞骨架动力学和细胞信号传导，所有这些都与动脉粥样硬化斑块形成相关。

LncRNA 的细胞定位（Cellular localization of lncRNAs）：lncRNA 通过参与表观遗传过程在基因调控中发挥关键作用；它们调节染色质功能、调控无膜核体的组装与功能、改变细胞质 mRNA 的稳定性与翻译、充当引导或支架、干扰信号通路。这引出了关于在动脉粥样硬化相关的不同细胞类型中调控其差异定位机制的问题。lncRNA 的核定位与命运通过转录、加工与输出来调控，受顺式作用序列基序与反式作用因子影响；它们也在细胞质中表现出顺式与反式活性。此外，一些功能性 lncRNA 被选择性定位到无膜核结构域并经非典型生物发生通路加工，尽管调控它们在这些结构域中保留的机制尚不清楚。lncRNA 的转录调控也已知受表观遗传修饰、加工、输出与转换的影响，所有这些都与其细胞定位和功能相关。除这些一般特征外，lncRNA 经常含有识别并结合特定核因子的嵌入序列基序，从而促进其核定位与功能。例如，母系表达基因 3（MEG3）lncRNA 包含一个 356 核苷酸元件，募集 U1 snRNP 促进其核保留；lncRNA 还能调节转录后过程如 mRNA 稳定化与剪接。利用 Gapmer 反义寡核苷酸或 CRISPR-Cas 技术，研究者可以成功调控 lncRNA 在核与细胞质区室中的表达，CRISPR 干扰和 CRISPR 激活都可用于抑制或激活特定 lncRNA，为它们在心脏病中的功能与潜在治疗应用提供洞见。

LncRNA 功能的多样机制（Diverse mechanisms of lncRNA function）：多项研究表明 lncRNA 表现出巨大的功能多样性，并通过与 RNA、DNA 和蛋白质的相互作用（经常涉及重复元件）参与基因组组织、细胞结构与基因表达的所有层面。这类相互作用可形成三螺旋（triplexes）或 R-环，对许多 lncRNA 的调控活性至关重要。基于 ncRNA 中相互作用元件和结构元件的存在，lncRNA 的表观遗传调控、lncRNA 作为增强子的活性以及 ncRNA 之间的相互作用等新兴主题正在心血管研究中得到研究。

染色质调控（Chromatin regulation）：一些 lncRNA 通过影响拓扑关联结构域形成、染色单体间相互作用或副斑点形成，参与染色体结构与基因表达。这些调控过程在内皮与血管平滑肌细胞（VSMC）生物学以及动脉粥样硬化病变形成中尤为重要。lncRNA 功能的一个重要方面是其对不同转座元件模块的依赖——这些元件贡献了它们的调控潜能，通过与染色质和转录机器的相互作用影响基因表达。RNA pull-down 与质谱联用已被证明是识别这种 lncRNA 相关抑制元件的有效方法，能深入了解其作用机制。值得注意的是，RNA 本身具有固有的调控潜能。特定 lncRNA 的表达水平（与其相互作用因子相比）可决定 lncRNA 对靶染色质的影响程度——例如 lncRNA ANRIL（CDKN2B-AS1）调控 CDKN2A/B 位点内的染色质相互作用，影响 VSMC 中的细胞周期调控与增殖，是斑块稳定性的关键因素；MALAT1 调控核斑点组织与内皮细胞功能，影响血管稳态与炎症；NEAT1 也参与副斑点形成，影响与内皮功能障碍和动脉粥样硬化炎症相关的基因表达。在肌成纤维细胞中，保守的促纤维化 lncRNA FIXER 帮助引导 CBX4 至 RUNX1 启动子，调控其表达并影响纤维化基因（如 Postn、Col3a1 和 Lox）的激活；Aghagolzadeh 等人 2023 年的研究表明 FIXER 或 CBX4 敲低会降低这些纤维化标志物，强调它们在调控纤维化和相关病理性细胞外基质重塑方面的治疗相关性。lncRNA SENCR（平滑肌与内皮细胞富集 lncRNA）通过结合特定 DNA 序列调控内皮细胞迁移与 VSMC 分化；SENCR 敲低诱导 VSMC 表型切换，促进致动脉粥样硬化状态与斑块形成，并影响包括 MYOCD 和 ACTA2 在内的关键内皮与平滑肌标志物，对血管稳定性至关重要。许多 lncRNA 参与与 DNA 形成三螺旋结构，以将染色质修饰因子募集到基因组中特定位点，介导基因沉默或激活。蛋白辅助的长程染色质相互作用（如 CTCF 介导的环化）通过将远端调控元件与靶基因空间上接近来组织三维基因组，从而实现基因表达的精确控制。lncRNA 也能作为其对靶基因直接转录效应的促进者，例如调控心脏基因程序的 lncRNA Locus Handsdown。多梳抑制复合物 2（PRC2）的结合与扩散已被特别描述为受到几种特征明确的 lncRNA 促进。耗竭这些 lncRNA 中的某些会导致通常被 PRC2 沉默的基因去抑制——例如人类特异性心脏断裂 lncRNA 1（lncRNA HBL1）与 PRC2 相互作用，其耗竭破坏全基因组 PRC2 对心脏发生关键基因的占据，从而增强转录；在内皮细胞中类似机制下，MEG3 耗竭或 PRC2 抑制重新激活 ITGA4 表达。以相似机制，lncRNA Ahit 直接结合并募集 PRC2 至 MEF2A 启动子，介导其下调，从而防止心肌肥大。

增强子活性（Enhancer activity）：活性增强子可被转录为增强子相关 lncRNA（elncRNA）。elncRNA 主要是单向的、多聚腺苷酸化的、剪接的，与其相关增强子的活性呈正相关，并能协同染色质调控蛋白调节染色质结构与拓扑。超级增强子相关 lncRNA CARMEN（[63]）和 Wisper（[64]）分别控制心肌稳态与心肌梗死（MI）后的纤维化反应；值得注意的是 CARMEN 的选择性剪接异构体决定了向心肌细胞和平滑肌细胞命运的特化，显示其在心脏发育中的关键作用。

ncRNA 之间的相互作用（Interaction between ncRNAs）：RNA-RNA 相互作用现已被广泛认识并在概念上整合为竞争性内源 RNA（ceRNA）概念。miRNA 可通过 MRE 与 lncRNA 结合，lncRNA 与 mRNA 竞争性结合这些 miRNA；ceRNA 活性调控发育与疾病中的多种细胞过程，lncRNA-miRNA 相互作用形成相互交织的复杂调控网络。值得注意的是，潜在竞争性内源 lncRNA 与 miRNA 之间的化学计量关系对于实现对靶 mRNA 表达的可测量效应至关重要——例如 lncRNA H19 能在心肌梗死期间直接与多种 miRNA 相互作用，调控心脏损伤后的坏死与凋亡。近年研究表明 circRNA 通过作为 ceRNA 在生物学功能中发挥重要作用：circRNA 可结合 miRNA 或 RBP 以调控下游靶标活性；circRNA SNRK（[69]）、circRNA Nfix（[70]）和 CircFndc3b（[71]）已通过这些机制涉及心肌梗死后的心脏修复与再生。

CircRNA（CircRNA）

CircRNA 的生物发生（Circular RNAs biogenesis）：多种基因组区域能够触发 circRNA 的产生。其生物发生与 pre-mRNA 剪接相关，由剪接体催化完成内含子去除与外显子配对。circRNA 通过两个外显子之间的反向剪接事件产生（图 4.2）。与线性 RNA 的典型剪接相反，在反向剪接中一个外显子与另一个上游外显子（而非相邻下游外显子）关联，由此产生一个具有外显子-外显子连接的单链 RNA 环，该连接在线性 mRNA 中不存在，称为"反向剪接连接"或"头尾连接"。circRNA 缺乏线性 RNA 典型的 5' 帽与 poly(A) 尾，没有 3' 和 5' 端。反向剪接事件在两个侧翼内含子彼此接近时发生（图 4.2）——这发生在侧翼内含子上的反向互补序列通过直接碱基配对连接时，该过程依赖于待环化外显子侧翼内含子区域富含 Alu 重复序列（[74]）。circRNA 的生物发生也在侧翼内含子含有 RBP（如 Quaking 和 Muscleblind）多重结合位点时增强——事实上，在内含子中插入 Quaking 的人工结合位点会触发 circRNA 生物发生（[76]）。另一种 RBP 名为 Rbm20 通过 titin 基因的选择性剪接参与 circRNA 的产生（[77]），对心血管系统具有重要作用。此外，circRNA 可通过套索驱动的环化产生（[78]）——该过程发生在外显子跳跃期间，当包围跳跃外显子的套索被释放、逃脱降解并环化以产生 circRNA 时发生；如果内含子在环化过程中被保留，加工后的 circRNA 可仅含外显子区域或同时含外显子和内含子区域（[79,80]）。因此，由于 circRNA 可同时包含外显子和内含子，它们可分为外显子 circRNA、内含子 circRNA（ciRNA）和外显子-内含子 circRNA（ElciRNA）。EcRNA 通常位于细胞质中，调控转录后机制（[81]）。CiRNA 在细胞核中调控转录（[82]）。另一类称为转运 RNA（tRNA）内含子 circRNA（tricRNA）已被发现；tricRNA 含有 tRNA 内含子，在 pre-tRNA 剪接过程中借助 tRNA 剪接内切酶蛋白复合物形成（[83]）。总体而言，circRNA 的生物发生间接调控 mRNA 的表达与蛋白质的产生，因为外显子整合入 circRNA 排除了 mRNA 的形成（[72,73,84]）。

CircRNA 的不同特征（Different features of circRNAs）：circRNA 是一组在基因表达调控中发挥不同作用的异质性转录本。根据 circAtlas 数据库 3.0 版本（2023 年 6 月发布， [88]），人类中已检测到超过 750,000 个 circRNA。除人类外，circRNA 存在于真菌、植物和动物等多个界，并表现出进化保守性。它们可定位于细胞核和细胞质（图 4.1），大小介于 100–4000 个核苷酸之间，包含单个或多个外显子（[89]）。circRNA 主要来源于蛋白编码外显子，部分从 5' 或 3' 非翻译区产生或含有保留的内含子。形成 circRNA 的外显子或内含子数量高度可变，从一个到数十个不等。一些基因能产生许多不同的 circRNA——例如人心中表达的 titin 和兰尼碱受体 2 基因编码超过 50 种不同的 circRNA（[77,90]）。circRNA 通常表达较弱，尽管少数被发现以高于其线性对应物的量存在（[79,91]）。circRNA 一个有趣的特征是其高稳定性：与线性 RNA 相反，circRNA 没有暴露的末端，可保护它们免受外切核糖核酸酶降解；因此某些 circRNA 的半衰期可超过 48 小时（[92]），而线性 RNA 的平均半衰期低于 10 小时（[93]）。circRNA 的降解由内切核糖核酸酶 L 催化（[94]）。值得注意的是，腺苷残基甲基化（m6A）似乎通过 RNAse P/MRP 复合物触发 circRNA 降解从而调控其转换（[95]）。circRNA 另一个有趣且临床相关的特征是它们的组织或细胞特异性——来自不同细胞和组织的深度 RNA 测序数据分析已揭示数百种细胞特异性 circRNA（[91]）。circRNA 也像其他类型 RNA 一样表现出空间和时间调控（[96]）。最后，虽然最初认为 circRNA 不能编码蛋白质（因此被归类为 ncRNA；图 4.1），但已有相当比例的 circRNA 被证明含有可产生蛋白质的 ORF——例如 hsa-circZNF609（也称 MICRA，因其与急性心肌梗死后心力衰竭发展的关联而得名， [97,98]）。

CircRNA 的功能（CircRNAs function）：circRNA 的进化保守性已被深入研究，因为功能与保守性通常相关（[99]）。与 mRNA 相比，lncRNA 特别是 circRNA 通常表现出较低的保守性（[99]）。实际上，进化保守性可能通过查询微保守片段（如 miRNA/RBP 结合位点）而非长片段保守性来更好地研究（[100]）。circRNA 的二级和三维结构保守性也可能为其潜在保守功能提供有用信息（[101]）。然而，circRNA 的不同作用已被识别，包括通过海绵活性调控 miRNA 功能、调控转录和蛋白质翻译、诱饵/转运/支架功能以及新兴的 circRNA 翻译为肽的功能（表 4.1）。

CircRNA 作为 miRNA 功能的调控因子（CircRNA as modulators of miRNA function）：已知某些 lncRNA 可通过选择性海绵作用调控 miRNA 水平和/或活性（[102,103]）。事实上，一些 circRNA 具有多个 miRNA 结合位点，使其成为可作为 miRNA 海绵的理想分子（[99]）。通过该机制，circRNA 防止 mRNA 降解并增强其翻译为蛋白质（[104]）。小脑变性相关蛋白 1 反义 RNA（CDR1as）是 CDR1 基因外显子反向剪接的产物，是第一个被识别且最为人所知的与 miRNA 相互作用的 circRNA。它在脑（[103,104]）、癌组织（[105]）以及脑血管疾病中高水平表达（[105]）。CDR1as 也被称为 ciRS-7，因为它含有超过 70 个 hsa-miR-7 的常规结合位点，从而阻断 miRNA 功能并诱导多个关键靶基因的转录（[103]）。在多种类型癌症中，CDR1as 的异常表达主要导致 hsa-miR-7 的抑制，hsa-miR-7 抑制的后果是 miRNA 靶标翻译为蛋白质导致疾病进展（[106]）。值得注意的是，除 hsa-miR-7 外其他 miRNAs 也可被 CDR1as 靶向（综述见 [105,106]）。一些 circRNA 也与动脉粥样硬化发展和/或斑块稳定性相关——具体而言，通过海绵吸附 hsa-miR-145 或 hsa-miR-145-3p，circLRP6 或 circDcbld1 的过表达分别加速动脉粥样硬化的发展（[107,108]）。其他例子包括 CircHIPK3、circSirt1 和 circSmoc1-2——分别通过 circHIPK3/hsa-miR-190b/ATG7（[109]）、circSirt1/hsa-miR-132/212/Sirt1（[110]）、circSmoc1-2/hsa-miR-874-3p/Adam19（[111]）轴发挥抗动脉粥样硬化作用。然而，circRNA-miRNA 海绵假说必须批判性看待（[112]）：事实上，circRNA 表达（除少数 circRNA 包括 CDR1as 外）通常较低，而 miRNA 表达可能更高；因此研究 circRNA 海绵功能时应辅以可靠的化学计量定量（[99]）。

CircRNA 作为转录和翻译的调控因子（CircRNA as regulator of transcription and translation）：已有报道某些外显子-内含子 circRNA 或 EIciRNA 主要定位于细胞核中，能通过与启动子相互作用和/或将转录调控蛋白募集至启动子来调控基因转录。具体而言，circZNF827 是含有 hnRNP-K/L-ZNF827 复合物的一部分，该复合物与染色质相互作用，在神经元分化过程中抑制神经生长因子受体的转录（[113]）。另一个例子是 circular Actinin Alpha 4 RNA（circACTN4），它将 Y-Box 结合蛋白 1 募集至 FZD7 启动子，共同激活 FZD7 转录（[114]）。相反，存在与 RNA 聚合酶 II 结合的 EIciRNA，增强其亲代基因的顺式表达，如 circEIF3J 或 circPAIP2（[115]）。此外，某些 circRNA 通过与线性剪接竞争来功能性地调控基因表达。具体而言，circMBL 与 pre-muscleblind 蛋白（MBL）mRNA 剪接竞争，并负面影响典型剪接；有趣的是，MBL 蛋白本身参与该功能，形成自我调控环（[116]）。circPABPN1（来源于 poly(A)-结合蛋白核 1 基因）与 RBP ELAVL1 或 Hu 抗原 R（HuR）结合并抑制其介导 PABPN1 mRNA 线性形式翻译的作用。具体而言，HuR 与 circRNA 的相互作用减少 mRNA 翻译（[117]）。

CircRNA 作为诱饵、转运体或支架（CircRNAs as decoys, transporters, or scaffolds）：某些 circRNA 可与 RBP 相互作用并发挥诱饵、转运体或支架功能。此外，circRNA 也能形成调控复合物，如与蛋白质和 mRNA 形成三元复合物，以调控 mRNA 稳定性或蛋白质翻译。此类 circRNA 的一个例子是 circFOXO3（由 FOXO3 基因宿主），被发现通过同时与 p21 和细胞周期蛋白依赖激酶 2 相互作用并形成三元复合物来抑制细胞周期（[118]）。Wu 等人（[119]）报道了原肌球蛋白-4（TMP4）和 γ-肌动蛋白（ACTG）在心肌细胞和小鼠心脏组织中与 Yes 相关蛋白 circRNA（circYap）结合，增加 TPM4 与 ACTG 的相互作用并抑制肌动蛋白聚合，诱导心脏纤维化。一种增强 mRNA 稳定性的 circRNA 是来源于 NOP2/Sun RNA 甲基转移酶 2 基因的 circNSUN2（[120]）；circNSUN2-胰岛素样生长因子 2 mRNA 结合蛋白 2（IGF2BP2）蛋白-高迁移率族 AT-Hook 2（HMGA2）RNA 复合物被发现促进 IGF2BP2 与 HMGA2 的相互作用，增强 HMGA2 mRNA 的稳定性，HMGA2 涉及结直肠癌的肝转移（[120]）。

CircRNA 的翻译（Translation of circRNAs）：2017 年，两个课题组分别报道了 circRNA 在果蝇头和哺乳动物肌肉细胞中被翻译（[97,121]）。Legnini 等人（[97]）证明 circZNF609（来源于锌指蛋白 609 基因）含有 753 核苷酸的 ORF，可在小鼠和人类骨骼肌中通过多核糖体和 Western blot 评估翻译为蛋白质。circRNA 的抑制显著减少成肌细胞增殖（[97]）。帽依赖性翻译是真核翻译起始的主要机制（[122]），但在压力等某些条件下可发生帽非依赖性翻译机制（[123]）。值得注意的是，circRNA 可以通过帽非依赖性机制被翻译。已识别两种帽非依赖性机制——内部核糖体进入位点（IRES）介导的和 N6-甲基腺苷介导的（[123,124]）。实际上，circZNF609（[97]）和 circMBL3（[121]）通过 IRES 介导的帽非依赖性机制编码蛋白质。

本章个人批注

本章是教科书从"细胞与形态"层面（Ch3 斑块表型与免疫景观）正式转入"RNA 调控网络"层面的过渡章节，承担承上启下任务：上半章集中建立 ncRNA 三大家族（miRNA、lncRNA、circRNA）的分子生物学基础设施——生物发生通路、调控因子、化学修饰、细胞定位；下半章则把三种 ncRNA 与心血管生理/病理联系起来，作为后续章节（Ch5 ncRNA 在斑块发展中作用、Ch6 信号通路、Ch17 循环 RNA 生物标志物、Ch15 RNA 治疗）的"分子词典"。我特别注意到本章的方法学严谨性体现在几个具体细节上：(a) miRNA 命名规则清楚区分"典型链 vs 过客链"（*已废弃 → -5p/-3p）、"相似序列加字母"（miR-30a-e）、"不同基因同序列加数字"（miR-329-1/-2）——这一规范对我后续阅读 Ch5/Ch7 中具体 miRNA 命名时避免误读非常重要；(b) 14q32 miRNA 超基因的"三响应模式"（非/慢/快响应）与位置无关的论断，是"转录后调控压倒转录调控"这一普遍原则的典型例子；(c) CDR1as 含 70+ miR-7 结合位点这一极端化学计量数字，作为 circRNA 海绵假说的"标志性成功案例"，但作者紧接提出"除 CDR1as 外大多数 circRNA 表达低于其靶 miRNA"——这一化学计量学提醒警示我，在 Ch5 之后看到任何"circRNA 通过海绵吸附 miR-X 调控通路"的论述时，都要先检查表达量与结合位点数是否支持该机制；(d) 关于 circRNA 翻译的"IRES vs m6A"两条 cap-independent 路径，暗示 circRNA 不是"绝对非编码"——这对 Ch15（RNA 治疗）的可成药性边界讨论有直接含义。值得记住的几处内在张力：(i) circRNA 命名"circ"暗示完全环化，但实际存在 exonic / intronic (ciRNA) / exon-intronic (ElciRNA) / tricRNA 四类，环化机制（反向剪接 vs 套索驱动 vs tRNA 剪接）与组成差异显著；(ii) miRNA 种子区定义为 nt 2-7 或 2-8，5'-isomiR 通过改变第 1-2 位切割位置直接改变种子序列，意味着同一个 miRNA 基因产生的不同 isomiR 可能靶向完全不同的 mRNA 组——这是 miRNA "单基因多功能性"的分子基础；(iii) lncRNA ANRIL / MALAT1 / NEAT1 / FIXER / SENCR / HBL1 / MEG3 / Ahit 等全部通过与 PRC2 或 CTCF 等染色质调控因子协作发挥作用，提示 lncRNA 的核心机制是"支架/引导"而非"催化"，这一图景与 miRNA（直接催化 RISC）的机制截然不同。源文在第 1 节（Introduction）和第 12 节（Canonical mechanism of action of microRNAs）相对薄，分别约 250 和约 250 源文行；其余 4 节（MicroRNAs / LncRNA / CircRNA 等）源文非常厚（每节 300-500+ 行），这是为何内概述字数不均的客观原因。

与上下章的衔接（一段话）

第 3 章把镜头从"人群流行病学"（Ch2 SCORE2 识别缺口）收回"血管壁形态学与免疫景观"——薄帽纤维粥样瘤、SMC 表型转换、巨噬细胞 M1/M2 极化、TGF-β 双重作用等核心概念已就位；本章则把镜头从"细胞与形态"再下沉到"RNA 调控网络"层面，系统建立 miRNA、lncRNA、circRNA 三大家族的生物发生通路、调控因子与作用机制——具体而言，miRNA 的 DGCR8/DROSHA→Exportin-5→DICER→AGO2/RISC 流水线、lncRNA 的 PRC2/CTCF 介导染色质调控、circRNA 的反向剪接与海绵/scaffold/翻译四重功能，将成为后续第 5 章（ncRNA 在斑块发展中作用）、第 6 章（信号通路与基因表达）、第 7 章（表观转录组学）、第 17 章（循环 RNA 作为生物标志物）等所有"ncRNA 与动脉粥样硬化"论述反复回用的分子词典。从本章到第 5 章的关键过渡点是：本章建立了 miR-126（血管内皮特异性）、14q32 簇（缺血三响应）、circCDR1as/ciRS-7（海绵标志案例）、circLRP6/circDcbld1/circHIPK3/circSirt1/circSmoc1-2（动脉粥样硬化直接相关）、lncRNA ANRIL/MALAT1/NEAT1/SENCR/HBL1/MEG3/Ahit 等具体分子——这些都将在后续章节作为机制锚点反复引用；本章建立的"命名规范、种子区定义、化学计量学意识、isomiR 概念、cap-independent 翻译"等方法论储备，将作为评估第 5-7 章与第 15-17 章任何"X 调控 Y 通路"论述时的解释框架。从结构上看，本章是教科书从"分子生物学基础"过渡到"心血管疾病应用"的桥接章节，后续章节将以本章建立的 ncRNA 三家族作为共同语言展开。