第 13 章：溶瘤病毒与细胞迁移（Oncolytic Viruses and Cell Migration）

本章内容（What You Will Learn in This Chapter）

本章由 University of Huddersfield 生物与地理科学系的 Anke Brüning-Richardson 撰写，主线有二：(i) 系统介绍溶瘤病毒（oncolytic virus, OV）这一类利用病毒必须在宿主细胞内完成复制这一特性、经过遗传工程改造以特异性识别、入侵并最终摧毁肿瘤细胞的生物治疗剂；(ii) 阐述 OV 感染如何通过劫持宿主细胞内的微管（microtubule, MT）细胞骨架网络、扰乱微管的精细动态平衡，从而对细胞迁移产生后续效应。作者在引言中预先点出，病毒要完成复制周期必须借助 MT 通道到达细胞内复制位点（如靠近细胞核的病毒工厂），而新病毒粒子在出胞时也可能"搭便车"于 MT 轨道，因此微管动力学一旦被 OV 扰动，便会自然地波及到细胞迁移行为。本章围绕病毒与病毒复制、OV 概述、MT 与迁移动力学、病毒与 MT 的相互作用、OV 研究细胞迁移的实例、以及将病毒整合到迁移/侵袭实验中的方法学等议题展开论述。

1. 病毒与病毒复制（Viruses and Virus Replication）

病毒被认为与人类共同进化了数百万年。2001 年人类基因组序列公布时已揭示，约三分之二的基因组序列由内源性逆转录病毒组成；据估计，人类蛋白质组保守区域中约 30% 的适应性氨基酸改变由病毒驱动。结构上，病毒是小的感染性颗粒或因子，由蛋白质外壳或包膜加上可单链或双链的 RNA 或 DNA 遗传物质组成，因其无法离开宿主细胞独立复制，有人据此认为它们不是真正的生命体——然而病毒颗粒内已包含复制所需的全部构件，进入宿主后又能主动脱壳并启动复制过程。

病毒的结构被优化以适应其必须依赖宿主的复制周期：先附着并结合到特定宿主细胞表面受体上，再穿入细胞膜，然后在宿主内完成复制并最终释出；按其遗传物质是 DNA 还是 RNA，复制发生在宿主细胞核内或外。病毒生命周期的复制环节还包括在细胞内主动位移，以抵达复制位点——例如靠近宿主细胞核的病毒工厂；新装配的病毒粒子在出胞时可能"搭便车"于 MT 轨道到达细胞膜并释出。病毒按其遗传物质是 DNA 还是 RNA、双链还是单链、以及是否具有包膜进行分类。所有病毒的复制都遵循六个主要阶段：(1) 病毒附着于宿主细胞；(2) 穿入（可通过膜融合或胞吞）；(3) 脱壳——移除或降解病毒包膜/衣壳以释放基因组核酸；(4) 复制——可包含若干轮病毒蛋白与基因组的转录与翻译；(5) 病毒装配——新合成的基因组与蛋白组装成新病毒粒子；(6) 病毒释出或释放——经裂解或出芽方式离开细胞。

病毒表现出"嗜性（tropism）"——病毒表面蛋白与宿主细胞表面特定受体的相互作用决定了其宿主范围。病毒与宿主细胞内的诸多相互作用都涉及肌动蛋白与 MT 细胞骨架；病毒生命周期的所有阶段都借助这些亚细胞结构完成——它们使病毒得以运动到亚细胞复制位点、促进病毒装配并实现有效的细胞间传播。这种在宿主细胞内运动的能力可以被利用——即把病毒作为治疗工具去攻击那些对健康有害的细胞活动，例如癌细胞所展示的迁移与侵袭行为。

2. 溶瘤病毒（Oncolytic Viruses, OVs）

病毒能主动寻找特定宿主细胞、复制并最终摧毁这些细胞的能力已被癌症研究领域所利用，用于改进难治性癌症的治疗。常见的人类病毒可被遗传工程改造，使其经由特异性或增强型的受体识别来锁定癌细胞、感染并摧毁细胞，同时吸引免疫细胞到达感染部位。癌细胞因此被病毒所摧毁，并且免疫系统也被激发去识别那些在病毒破坏过程中被释放到微环境中的癌细胞抗原。这种以这种方式特异性靶向癌细胞的病毒即被称为溶瘤病毒（OV）。OV 因其能够感染细胞、诱导凋亡或将免疫反应引导至肿瘤部位而对癌症研究者与临床医生具有极大吸引力；这一点尤为关键，因为已知癌细胞能通过直接或间接抑制免疫系统来逃避治疗。在这一语境下使用 OV 属于免疫治疗的一种。OV 的另一吸引人之处在于：癌细胞中的突变会产生"非自身"结构，从而能够重新训练免疫系统去识别并摧毁其他癌细胞，使免疫治疗得以应用。迄今已被研究其作为 OV 潜力的病毒包括腺病毒、原细小病毒、痘苗病毒、呼肠孤病毒以及 1 型单纯疱疹病毒（HSV-1）。

通过遗传工程改造可使天然病毒获得肿瘤选择性。DNA 病毒（痘病毒除外）与逆转录病毒可通过插入特定启动子获得肿瘤选择性——这些启动子可被整合入病毒基因组，以诱导对病毒复制至关重要的基因表达。另一种改造涉及对基因转录与翻译的调控。癌细胞的特征之一是干扰素（IFN）信号通路缺陷；通过改造 OV，可使原本用于抑制 IFN 信号的蛋白功能失活——这意味着在正常细胞中复制会被中止，而在具有缺陷性 IFN 信号的癌细胞（痘病毒除外）中，由 IFN 介导的翻译关闭被解除，病毒便能继续复制。病毒也可被改造以抑制那些促进细胞凋亡的蛋白——这类蛋白在正常健康细胞中会抑制病毒复制；而癌细胞因获得突变而能逃避凋亡，故仍易受病毒感染与最终复制。癌细胞表面某些受体的过表达或丰度上升则有助于病毒进入。病毒对受体的嗜性可通过遗传工程进一步增强，以实现对宿主细胞更精准的靶向。

也许是免疫治疗的最早尝试：约公元前 2600 年埃及医师曾用敷料贴敷于切口，他们相信以此方式促进感染可导致肿瘤消退。19 世纪曾有医学记录描述一名 42 岁女性与一名 4 岁男童罹患白血病后，分别因感染流感与水痘而进入缓解期；1940 年代又有两名霍奇金病患者在感染病毒性肝炎后缓解的类似观察，促成了最早的免疫治疗临床试验。受这例肝炎感染疗效的鼓舞，1949 年启动了一项涉及 22 名同病患者的临床试验——给药方式为投用含于组织或血清中的肝炎病毒提取物。结果显示：7 名患者改善 1 个月后复发，13 名出现肝炎迹象，1 名死亡——这最初试验为在合适条件下利用特定 OV 靶向癌细胞提供了首批证据；同时也证明在免疫受抑的较年轻患者中可获得肿瘤消退与暂时缓解。

利用病毒治疗癌症的实践目前正在快速扩展，人们对将 OV 用于常规治疗的期望甚高。然而迄今仅有一种溶瘤病毒疗法被批准临床使用——Talimogene laherparepvec（OncoVEX^GM-CSF），即 T-VEC，于 2015 年获认证用于晚期黑色素瘤；目前虽有数种潜在疗法处于 I/II 期临床试验中（覆盖胰腺癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、结直肠癌等若干最具侵袭性的癌症），但尚无其他获批的病毒治疗方案。迄今有限的成功可归因于若干因素：实体瘤的内皮层与致密的细胞外基质（ECM）等物理屏障造成组织间隙高压，削弱了病毒的浸润潜能；强烈的固有免疫反应可能在病毒抵达靶位之前将其清除；实体瘤促进诱导的免疫抑制环境则会对抗 OV 诱导的针对肿瘤的免疫反应。为克服首批临床试验所暴露的局限，需要考虑若干策略：首先是病毒本身的选择——较大的病毒更便于插入额外治疗基因，但又可能因体积过大而难以穿越体内的物理屏障；已发现包膜病毒的溶瘤活性较弱且更易被免疫反应清除，故可能需要进一步改造以增强其溶瘤潜力。其次是 OV 的有效递送方式——既可瘤内注射（直接将病毒注入肿瘤部位）也可全身给药（静脉或腹腔注射）；瘤内注射是临床前与临床试验偏好的给药途径，但对位置深在或多灶性的肿瘤可能并不可行；全身给药看似理想，因其可使 OV 抵达原发与继发肿瘤，且为非侵入性的可重复给药方式。然而近期试验显示生物利用度并不理想——病毒在抵达靶位前即被宿主免疫系统快速隔离与破坏；为防止被免疫识别，可将病毒颗粒包裹于聚乙二醇（PEG）等聚合物之下。进一步的开发还包括使用"诱饵病毒"以隔离预先存在的抗体；潜在地，新出现的能够穿越血脑屏障（BBB）等物理屏障的病毒——例如目前正在流行的 SARS-CoV-2 病毒——可被以多种方式利用以靶向脑等难以到达的身体部位，既可单独使用，也可与其他抗肿瘤治疗剂偶联或与能够增强肿瘤特异性的其他蛋白组合使用。

3. 微管（MTs）与细胞迁移动力学（Microtubules and Dynamics of Cell Migration）

MT 在发育、伤口愈合以及免疫应答等迁移过程中所起的关键作用已在本书其他章节中讨论过。除此之外，MT 对有丝分裂中纺锤体形成与细胞内运输也至关重要。MT 结构因而被优化以承担这些不同的角色：它们是真核细胞细胞骨架中由管蛋白（tubulin）亚基组成的管状蛋白结构。管蛋白是一类小型球状蛋白，组成管蛋白超家族——共分六个家族：α、β、γ、δ、ε 与 ζ；其中与 MT 相关的是 α 与 β 管蛋白。α 管蛋白与 β 管蛋白相互作用形成异二聚体；异二聚体具有正端与负端，α 管蛋白构成负端、β 管蛋白构成正端——这一排列对 MT 在迁移中的作用至关重要，迁移依赖于 MT 的动态不稳定性。管蛋白异二聚体以平行方式对齐形成长链，即原纤丝；在链延伸过程中，二聚体自我定向使 α 与 β 管蛋白交替出现。负端与正端也因此被相应地称为原纤丝的端。新二聚体以及原纤丝的生长与延伸总是发生在链的正端。当 13 根原纤丝以平行且紧邻的方式横向排列时即形成 MT，构成刚性的稳定棒状结构；MT 的直径记录在 20–30 nm 之间。MT 棒状结构通过负端与微管组织中心（MTOC）相连，正端则可向细胞膜方向延伸或回缩。因此部分 MT 表现出动态不稳定性——它们通过正端的添加或丢失而生长或缩短；这是因为 GTP 与 MT 正端的结合。当新的管蛋白二聚体被加到正在生长的原纤丝上时，定位在末端的 GTP 分子被水解为 GDP；通常这是一个缓慢的周转过程，所以在丝的生长末端始终存在一个 GTP 帽——这对维持 MT 的稳定性是必要的。然而，如果正在生长的 MT 附近新管蛋白二聚体的浓度过低、新二聚体的添加速度慢于已添加二聚体中 ATP 分子的水解速度——即发生"灾变"：GTP 帽被移除，导致 MT 末端失稳、二聚体丢失与 MT 缩短。当有足够的管蛋白二聚体可供纳入时，这一过程可以逆转："拯救"形成新的 GTP 帽，MT 重新生长直至下一次灾变发生。

作为迁移过程的一部分，MT 也充当马达蛋白的轨道。马达蛋白对细胞内运输至关重要——它们结合囊泡、细胞器或生物大分子进行全细胞运输。被深入研究的马达蛋白是驱动蛋白（kinesin）与动力蛋白（dynein）。两者具有相似的显著结构——都拥有两个可借此附着到 MT 上的马达结构域，并拥有两条长的互相缠绕的尾结构域，货物即结合其上；某些驱动蛋白没有马达结构域且不结合货物，而是结合两条 MT。驱动蛋白沿 MT 向正端运动，将货物从细胞中心运送至细胞边缘；动力蛋白则沿相反方向运动。两者均使用"手递手"机制移动——两个马达结构域交替置于彼此前方，使马达蛋白能沿 MT 向前运动；因此至少有一个马达结构域始终附着在 MT 上。这一活动过程中，动力蛋白与驱动蛋白都需要 ATP 形式的能量——每一步马达结构域的运动都需要消耗一个 ATP 分子，并在下一步被新的 ATP 分子替换。根据所结合的是 ATP、其水解形式还是无，相应地马达结构域与 MT 的连接紧密或松弛，从而驱动蛋白向前移动。

如前所述，细胞中存在两类 MT：稳定的与动态的。稳定 MT 负责囊泡运输与细胞稳定性；动态 MT 则被用于需要快速响应变化的过程，如细胞迁移或有丝分裂。因此 MT 的动态不稳定性同样允许细胞的定向迁移；同理，任何靶向 MT 动态性质的活动都将影响细胞迁移。

4. 病毒与 MT 的相互作用（Viruses and MT Interactions）

病毒以其利用细胞机器进行复制的高效率而著称；而今也已知道，它们利用 MT 细胞骨架在被感染的细胞内运动。这是由于分子量大于 500 kDa 的分子无法在细胞内自由扩散，而直径大于 20 nm 的结构同样需要依赖能量的运输。对于具有大衣壳或基因组的病毒，定向运输必须借助肌动蛋白丝上的肌球蛋白运动以及/或 MT 上的动力蛋白与驱动蛋白来完成。本章将聚焦于病毒与 MT 的相互作用。动力蛋白与驱动蛋白如前所述地沿 MT 轨道运送货物；这使得病毒能够利用现有的运输系统——通过"搭便车"进入囊泡或细胞器内，或者在进入宿主细胞后直接结合马达蛋白。在病毒复制过程中，病毒首先需要抵达其复制位点——细胞质或细胞核。研究已揭示许多病毒利用并需要 MT 来抵达细胞核——这一过程既可通过内体运输实现，也可作为胞质溶胶货物完成。

部分病毒，如卡波济肉瘤相关疱疹病毒，通过激活涉及黏着斑激酶（FAK）与 PI3-激酶的信号级联以稳定 MT，进而在稳定的 MT 上通过涉及 RHO 的活性以沿内体向细胞核移动。另一些病毒如腺病毒或疱疹病毒，可通过调节正向运输量来操纵 MT 上的运输方向；这使得向负端、向细胞核方向的运输变得更加频繁，从而使病毒沿优选方向迁移。某些病毒已被报道其病毒组分与动力蛋白之间存在直接相互作用，从而允许沿 MT 的直接运输。破坏诸如 dynactin（连接货物与动力蛋白的宿主衔接蛋白）这类宿主衔接蛋白已被证明会影响病毒运输（例如向 MTOC 的运输），这表明这些病毒能够利用这类衔接蛋白而非马达蛋白本身来"搭顺风车"。最后，某些病毒如疱疹病毒或人类免疫缺陷病毒（HIV）则利用位于 MT 生长末端的蛋白质——即所谓的"末端追踪蛋白（tip-tracking proteins）"如 EB1、CLIP-170 或驱动蛋白 Kif4——通过与这些末端追踪蛋白直接相互作用，病毒诱导 MT 稳定化，从而允许向 MTOC 的运输。其他 MT 稳定化机制则通过干扰 Rac1 信号或在病毒出胞时增强 MT 的酪氨酸化或乙酰化实现。MT 受诸如乙酰化或酪氨酸化等翻译后修饰的影响，从而使 MT 之间出现多样化与功能差异，并与特定蛋白（包括末端追踪蛋白与马达蛋白）发生相互作用。在复制与病毒装配期间还发生着与细胞骨架的进一步相互作用。病毒在细胞内运动所采用的各种策略总结于图 3。

5. OV 实例与细胞迁移研究（Examples of OVs and the Study of Cell Migration）

如前所述，病毒的特征是无法独立复制、依赖于宿主细胞完成复制——因此它们需要进入宿主、诱导其亚基的产生以组装成新病毒、最终离开宿主细胞。一旦进入宿主细胞，OV 也必须在宿主内移动以抵达其复制位点，并协调自身遗传与结构单元的生产。

作者近年研究了不同病毒作为 OV 治疗高级别儿童与成人脑肿瘤的潜力，并观察到靶向癌细胞的细胞迁移在病毒感染期间受到影响。这些 OV 已被工程改造以特异性靶向癌细胞进行摧毁。研究显示 OV HSV 在胶质瘤细胞中产生显著的抗迁移效应并最终诱导细胞死亡，对脑肿瘤细胞的迁移与增殖均产生影响。作者最初用蓝舌病毒（BTV）的亚单位转染胶质瘤细胞的研究也呈现出令人鼓舞的结果——单层培养的胶质瘤细胞初步数据显示细胞增殖受到负面影响、迁移减少；进一步在 3D 球体培养中转染细胞时观察到相同结果，并伴随细胞凋亡增加（BTV 亚单位的初步数据证明病毒蛋白转染细胞的原则可行，且可能进一步应用于临床场景）。总体而言，这些病毒可能阻止癌细胞运动的观点对于预防高度侵袭性癌症（如脑肿瘤）的癌细胞扩散颇具吸引力。通过多种体外实验更细致地审视所述效应，揭示这些病毒利用 MT 作为在宿主细胞内循环的手段。

这些发现提示，对抗高度侵袭性与侵袭性癌症可借助应用 OV——OV 首先靶向细胞迁移以防止癌细胞扩散，然后诱导细胞死亡，并最终也导致免疫反应的激活。本节给出上述研究中两个例子的详细描述。

5.1 常见人类病毒作为 OV 及其对 MT 的影响（Common Human Viruses as OVs and Their Effect on MTs）

作者近年研究了常见人类病毒（包括 HSV、呼肠孤病毒与痘苗病毒）靶向癌细胞迁移的潜力。这些病毒已被预先工程改造以专门靶向源自高级别儿童胶质瘤与弥漫性内生型桥脑胶质瘤（DIPG）的细胞。在这些病毒之间观察到了它们对细胞迁移影响的差异：溶瘤 HSV 看起来是所测试中最具潜力的 OV，因为它对细胞迁移产生了特异性与显著的抗迁移、抗侵袭效应——而这并非其对增殖影响的副产品。活细胞成像、划痕实验与 3D 侵袭实验所观察到的效应被靶细胞的免疫荧光显微镜与蛋白质印迹所证实。研究发现 OV 改变了癌细胞的细胞骨架动态，导致通过翻译后管蛋白修饰的累积而使 MT 稳定化。病毒感染对 MT 翻译后修饰的影响在图 4 与图 5 中被突出显示——在用溶瘤 HSV 感染后，癌细胞中出现了管蛋白的去乙酰化与去酪氨酸化的增强。

值得关注的是，OV 处理细胞还导致了糖原合酶激酶 3（GSK-3）的抑制——GSK-3 是一种通过调控肌动蛋白聚合、黏着斑成熟与 MT 动力学来调节此类癌细胞迁移的酶。因而与 MT 末端相关联、并调控 MT 动力学的结肠腺瘤性息肉病蛋白（APC）的局部聚集被抑制，提示 MT 动力学受到破坏。图 6 显示：在加入溶瘤 HSV 后，癌细胞中 APC 的局部聚集受到抑制。

5.2 动物病毒蓝舌病毒（BTV）及其对 MT 动力学的影响（The Animal Virus Bluetongue Virus (BTV) and Its Effect on MT Dynamics）

来自文献的支持性证据涉及使用影响动物的病毒。在 BTV 亚单位效应的最初研究中，Shaw 等人讨论了利用 BTV 靶向 GBM 的可能性。该病毒属于呼肠孤病毒科、环状病毒属；迄今已鉴定出该属的 20 个种。这种非包膜病毒结构复杂，具有衣壳与双链（ds）RNA 基因组，感染包括绵羊、山羊、牛在内的家畜以及野生动物。病毒由七种结构蛋白（VP1–VP7）与至少四种非结构蛋白（NS1–NS4）组成，其编码基因为十段 dsRNA。结构蛋白与病毒的两层核心相关，将 RNA 聚合酶与分节段基因组包裹其中。非结构蛋白则在促进病毒在宿主内复制以及靶向宿主免疫中起作用。其中最丰富的非结构蛋白之一 NS2 与病毒包含体（VIB）相关联——VIB 是由病毒颗粒的致密聚集体构成的病毒工厂，使病毒得以合成。已报道像 BTV 这样的动物病毒可被用于靶向癌细胞。Wang 等人曾用完整 BTV 成功地在体外与体内靶向肾癌细胞；在异种移植模型中，瘤内注射 BTV 导致肿瘤体积显著缩小。

对非结构 BTV 蛋白 NS2 的研究揭示：该病毒可通过 NS2 的活性影响哺乳动物有丝分裂。用 NS2 构建体转染的 GBM 细胞表现出有丝分裂缺陷，破坏有丝分裂纺锤体的形成（通过活细胞成像与免疫荧光显微镜分析所观察）；此外，MT 与染色体之间的相互作用也受到影响。Bhattacharya 等人的研究进一步显示 BTV 病毒依赖于与 MT 细胞骨架的相互作用：当 MT 网络通过药理学手段被破坏时，胞内 BTV 增多而释放出的病毒随之减少——结论是 BTV 利用 MT 网络作为成熟病毒粒子从宿主细胞输出的运输系统。

MT 在细胞迁移中扮演关键角色。如本书前几章所述，MT 与肌动蛋白丝以及与黏着斑的协同使细胞能沿迁移方向极化；若这一活动被扰乱，将对细胞迁移整体产生后续效应。在作者最近的研究中注意到：用 NS2 BTV 构建体转染的胶质瘤细胞系 U87 与模拟转染细胞相比，对癌细胞具有抗迁移效应。与模拟转染细胞相比，用 BTV NS2 蛋白转染的 U87 细胞被发现其累积距离（accumulated distance, AD）显著降低——累积距离是使用 Tracker 工具分析迁移细胞动态影像后的移动距离指标。由于 MT 在细胞运动中扮演关键角色，所观察到的 AD 减少可能表明极化细胞所需的 MT 功能丧失。细胞骨架的机械协调因 MT 活动被破坏而受累，从而产生所观察到的效应。另一值得关注的观察是，活细胞成像过程中高比例的细胞表现为静止状态，凸显了病毒亚单位转染的有害效应。有趣的是，本研究中使用的第二种胶质瘤细胞系 U251 似乎未受到相同处理的影响——这可能源于 GBM 的异质性。U87 与 U251 已被充分表征，其在增殖、迁移与侵袭方面的差异已被报道。U87 已被证明其迁移能力远高于 U251。Li 等人的研究通过蛋白质组学方法得出结论：所观察到的表型差异源于蛋白质表达及其相关生物学过程的差异。Diao 等人在一个由含天然胶原界面的中空微室阵列构成的 3D 微制造模型中研究了包括 U87 与 U251 在内的四种不同胶质瘤细胞系，发现各细胞系在细胞形态、增殖、迁移与侵袭方面存在差异；U251 是细胞速度、方向性与位移均最小的细胞系。这种蛋白质表达与迁移活动的差异可能是观察到的细胞对 BTV NS2 转染产生不同反应的原因。对用 BTV NS 构建体转染的 3D 球体的初步研究也提示 U87 中存在抗迁移效应。

这些观察在考虑将 BTV 作为临床用新型 OV 时也具有明确意义。若 BTV 能抑制 GBM 细胞运动，则可能允许更有效的治疗——阻断单个细胞从原肿瘤迁移离开，将使化疗或放疗等治疗手段在第一轮治疗中能对抗更大比例的细胞，从而降低患者复发的风险。

6. 使用病毒进行细胞迁移研究的方法（Methods in Cell Migration Using Viruses）

在本章所述例子中，作者使用了常用的迁移与侵袭实验以确定 OV 的抗迁移活性。为适配病毒的使用，进行了如下方法的调整。在开展实验的地点必须遵守有关活病毒培养与操作的规定。

6.1 使用 OV 的划痕实验（Scratch Assay Using OVs）

待研究的癌细胞（此处为儿童胶质瘤或 DIPG 细胞系）以预定的细胞密度接种于 24 孔板中，待其汇合度达到 80–90%。经 24 h 孵育后，在每块板的底面画一条线。如前一章所述，在细胞层上引入一道温和的划痕，并用培养液洗涤各孔以去除脱壁的细胞与细胞碎片。随后加入含有待研究病毒、培养液中的病毒以不同的噬斑形成单位（pfu）范围（0.01 至 50）添加。使用显微镜系统（如 EVOS，Thermo Fisher，英国）以 ×4 倍率在 24 h 内观察细胞向划痕内的迁移。划痕面积的百分比变化按本书第二部分"细胞迁移研究方法"一章中所述方法确定。

6.2 使用 OV 的活细胞成像（Live Cell Imaging Using OVs）

待检测细胞被计数并以亚汇合密度加入 Ibidi（Ibidi，德国）或等效的专用成像皿中，然后在 37 °C 条件下让细胞贴附到成像板 2 h。移除培养基并替换为含有待测病毒（如 HSV、呼肠孤病毒或痘苗病毒）的培养液；本系统中所用的病毒浓度为 10 pfu/细胞——此数值需根据所用病毒预先确定。成像皿被置于连接到活体成像系统的培养室中（如 BioStation，Nikon，英国），以 3 min 间隔进行 48 h 成像；用 BioStation 软件创建可被导出并由分析工具（如 ImageJ 与 MTrackJ）分析的动态影像。追踪通过识别每个细胞的细胞核完成，并以 150 min 间隔追踪细胞迁移。

6.3 病毒感染 3D 球体的迁移/侵袭实验与活细胞成像（Migration/Invasion Assays and Live Cell Imaging of 3D Spheroids Infected with Virus）

按本书第二部分"细胞迁移研究方法"一章所述进行球体侵袭实验。在球体被包埋入胶原并完成胶原聚合后，通过加入适当培养液中的 8 × 10²、8 × 10³、8 × 10⁴ 或 4 × 10⁵ pfu/孔病毒使球体暴露于病毒。注意这些是本研究所用病毒预先确定的数值。在迁移实验中，球体用显微镜系统（如 EVOS 细胞成像系统，Thermo Fisher，英国）以 ×4 倍率成像。球体在 t = 0、24、48 与 72 h 后被成像——时间点可根据所用细胞系而调整。所得图像被用于确定球体随时间变化的迁移指数。

对于活细胞成像，使用如 Incucyte Zoom 一类的成像系统以 ×4 倍率成像。球体被覆以含病毒的培养液，HSV 与痘苗病毒使用 8 × 10⁴ pfu/孔。为便于可视化，所用病毒也表达 GFP。图像在 24 h 内每小时拍摄一次。影片用所附 Incucyte™ 软件生成，再以 ImageJ 进行数据分析与 GFP 可视化。

6.4 病毒感染对细胞迁移影响的免疫荧光分析（Immunofluorescence Analysis of the Effect of Virus Infection on Cell Migration）

为评估病毒感染通过靶向 MT 而对细胞迁移产生的影响，作者常规使用免疫荧光。为此，将附着在盖玻片上的病毒感染细胞在 100% 冰冷甲醇中固定。载玻片在 −20 °C 固定 2 min，然后用 PBS 洗涤三次。载玻片的封闭使用含 0.05% 脱脂奶粉的 PBS 在室温下进行 5 min。同时，将针对例如乙酰化与去酪氨酸化管蛋白（作为 MT 动力学破坏的标志物）等靶标的一抗在封闭缓冲液中稀释，并将抗体溶液以 13,000 rpm 微离心 5 min。将 200 μL 抗体溶液加到漂浮于水面上的石蜡膜片上；将盖玻片倒扣于抗体溶液上，在室温下孵育 1 h。孵育结束后取下盖玻片，用 PBS 洗涤三次。按一抗相同方法在封闭液中准备针对一抗物种的荧光标记二抗；同时加入 DAPI 作为核染料；之后如前所述在漂浮的石蜡膜片上孵育。注意必须遮盖孵育室以防止因荧光标记的漂白造成信号衰减。再孵育 1 h 后，用 PBS 洗涤盖玻片三次，然后以 Fluoromount-G 或等效封片剂的小液滴进行封片。载玻片用箔覆盖后于空气中过夜干燥。为分析病毒对蛋白表达的影响，每种条件下约 200 个细胞被记录其每个抗体的荧光信号，并通过计算校正的总细胞荧光（CTCF）进行测定。此外还应记录蛋白定位的变化——这可以通过在载玻片上计数显示出特定蛋白（如酪氨酸化或乙酰化管蛋白）定位的细胞数量来评分。

本章个人批注

通读本章最直接的收获是把"OV"这个看似独立的免疫治疗概念接回了本书前半部分反复出现的细胞骨架主题——迁移与侵袭的可成药性不是孤立的，而与微管动力学本身高度耦合。Brüning-Richardson 行文时显然已经假定读者熟悉 MT 在迁移中的角色（第 3 节几乎是对本书前面章节的快速回顾），所以她把笔墨集中在病毒一方对 MT 的"反向利用"与"破坏"上——这是合适的章节切分。

值得标注的几个细节：

(i) 第 1 节提到的"内源性逆转录病毒约占人类基因组三分之二"以及"蛋白质组保守区 30% 的适应性氨基酸改变由病毒驱动"——这是引自 Enard et al. 2016（eLife）与 Moelling 综述的说法，前者是宿主–病毒共进化的核心定量证据，但 30% 这个数字本身存在争议（评论文献中也有更保守的估计），如要在他处引用需谨慎复核原始数据。

(ii) 第 2 节关于 HSV-1 作为 OV 的临床试验历史叙述（公元前 2600 年埃及敷料、19 世纪白血病缓解个例、1949 年肝炎病毒提取物试验）写得相当引人入胜，但需要把这些当作"早期免疫治疗的猜想性前史"而非确凿的临床记录来读——其中很多环节的归因（如缓解是否真由病毒感染引起）在当时没有对照组。

(iii) 第 5.2 节关于 BTV NS2 在 U87 中引起 AD 下降而 U251 不响应的现象，作者归因于 GBM 异质性，并引了 Li 2017 与 Diao 2019 的细胞系差异数据。这是一条有用的提醒：任何 OV 候选若只在一个细胞系上得到"漂亮"数据都应被怀疑；U87 与 U251 长期被当作"GBM 标准模型"使用，但二者的迁移表型差异之大（U251 在 Diao 的 3D 模型里位移最小），意味着把它们混为一谈是文献中常见的简化错误。

(iv) 第 4 节描述的"tip-tracking protein + 病毒"的相互作用机制（EB1、CLIP-170、Kif4）是真正巧妙的——病毒不是被动地搭便车，而是通过重塑 MT 的动态生长端来重定向自身的运输。这一点和前面章节讨论 MT +TIPs 与迁移极化的内容形成呼应。

(v) 第 6 节给出的四个方法（划痕、活细胞成像、3D 球体侵袭、免疫荧光 CTCF）几乎是前面"细胞迁移方法"章节的小型应用复刻，但把"病毒加入"这一变量融入到每一个读出中——既给出浓度范围（pfu）也给出成像间隔（3 min、1 h、24–72 h 等具体参数）。这是本章作为方法学导向章节最实用之处。

(vi) Take-Home Message 在本节末尾被简化为 5 条要点而非单独成节处理——这里我把它合并进 H2 列表里的逻辑是：源文确实把它作为节末"清单"呈现，与前面的引言形式上有对称；但本笔记并未把 Take-Home 单独抬成 ## 要点（Take-Home Message） 一节，因为这会与后面的"本章个人批注"功能重叠。如有需要可在后续版本中将 5 条要点提取为单独章节。

未解决的问题： - 第 5.2 节提到的"高比例细胞在成像过程中静止"——具体百分率是多少？"静止"相对于什么基线？文中未给出。 - "T-VEC 之外没有其他 OV 获批"这个状态截至第 13 章写成时（推断 2023 年前后）成立，但 2023 年后已有 Delytact（teserpaturev/G47Δ）在日本获批用于恶性胶质瘤——这个时间线需在引用本章时核对。

与上下章的衔接（一段话）

第 13 章在全书中的位置非常特殊：它是第二部分（"细胞迁移研究方法 / Cell Migration Methods"）的收尾章节，也是第三部分（"细胞迁移与疾病 / Cell Migration in Disease"）之前的最后一座桥——把前面所有关于细胞骨架、迁移实验、3D 模型、活细胞成像、图像分析的方法学训练，应用到一个看似不相关但实际上与微管动力学深度耦合的治疗策略上（OV）。作者在引言中明示本章将"提供关于病毒与其生命周期、OV、病毒与微管的相互作用及其对细胞迁移影响的总体背景"，这一宣告实际上把第 13 章定位为"用整章篇幅把本书前 12 章关于 MT、细胞骨架动力学的知识综合起来，去审视一种特殊的抗癌治疗策略"。从全书结构上看，第 12 章讨论的是"药理学策略"（migrastatics、蛋白酶激活前药、治疗性捕获等）——这些都属于"小分子化药/递送系统"的范畴；而第 13 章则把"靶向迁移的治疗"思路推进到了生物制剂——以病毒作为载体的、同时具有"靶向 + 杀伤 + 免疫激活"三重作用的复杂治疗模式。两者合起来构成了"靶向细胞迁移治疗"的两条主路径：第 12 章的化学/工程化路径与第 13 章的生物/病毒学路径。第 13 章末尾的方法学小节（划痕、活细胞成像、3D 球体、免疫荧光 CTCF）实际上与第 11 章"软件应用"以及本书第二部分专门讨论迁移方法的其他章节直接呼应——这一选择让第 13 章既是一个具体应用案例，也具备可独立操作的方法学蓝本。下一章（第 14 章）按章节序号应进入"疾病"主题，本章对 OV 与 GBM 的讨论则预示了后续"脑肿瘤细胞迁移"专题的入场。