第 9 章：使用高分辨率成像研究体外细胞迁移（Using High-Resolution Imaging to Investigate Cell Migration In Vitro）

Background to Fluorescence Microscopy: Fluorescent Proteins and Super-Resolution Imaging

定位细胞内蛋白的常用做法是将目的蛋白的 cDNA 与一种荧光蛋白（fluorescent protein, FP）例如增强型绿色荧光蛋白 eGFP 融合表达，再进行活细胞成像（live cell imaging）。更精细的方案是利用 CRISPR 或相关方法对内源蛋白进行标记，这样荧光标签会以内源水平表达，但技术上更具挑战。此外也有 Halo、SNAP 这样的小标签可与可穿透细胞的染料结合使用。自 GFP 被首次作为报告基因以来，已经衍生出大量变体，但 eGFP 仍然表现优异，是作者实验室做融合蛋白初筛的首选；从零开始的话则推荐尝试 StayGold。在多色实验中，作者建议使用 FPbase 来挑选合适的荧光蛋白，特别需要核对激发/发射光谱、确认激光器和滤光片匹配，并检查多色之间发射光谱的串色；FPbase 还提供理论亮度（与量子效率 QE 相关）以及二聚化倾向等信息。理论上 eGFP 与 C 端融合的 α-actinin 定位正常，但与 N 端融合则定位异常，提示标签位置选择需要做正交对照。

宽场荧光显微镜的分辨率大约是发射光波长的一半（488 nm 激发对应约 250 nm），因此两个距离小于 250 nm 的荧光点无法被分辨成一个以上的目标；这一极限来源于光通过样品与物镜时的衍射——小目标衍射角度更大，使一个点光源被成像为一个模糊斑（在 XY 中即 Airy disc，在 XYZ 中即点扩散函数）。物镜的数值孔径（NA）决定可收集的光锥大小，大多数物镜 NA 上限为 1.4，对应到一定波长后分辨率就基本固定；分辨率还与波长（红光衍射更大）和折射率（油浸、水浸、气浸）相关。Abbe 在 1873 年用公式 d=λ/(2·NA) 描述了衍射极限，Z 方向（轴向）的分辨率比 XY（横向）还要低约 3 倍。

为突破衍射极限，多种超分辨率方法被开发。Zeiss 共聚焦显微镜上常见的 Airyscan 使用 32 元阵列，每个单元相当于 0.2 个有效针孔，将 32 张子图合成处理后可在接近正常亮度下获得约 1.7 倍的横向分辨率提升，且兼容标准染料与荧光团。结构光照明（SIM）以精细光栅照射样品，生成的干涉图样将衍射光斑宽度减半，从而使分辨率提高一倍；通常需要采集 9 张图样旋转的图像，再经傅里叶变换回到实空间。新版本如 Zeiss Elyra SIM 使用晶格图案；iSIM 通过透镜阵列产生多点照明与针孔阵列，再经第二次透镜阵列将光斑收缩 2 倍，由 sCMOS 相机采集，最终分辨率同样约为 Airyscan 的 2 倍，但完全依赖光学设计，不需要图像处理；近期还用机器学习改善反卷积。

STED（受激发射耗尽显微镜）属于共聚焦的改进版本，在扫描点光源之外加一束环形（甜甜圈形）的耗尽激光，关闭环内荧光团的发射，从而将可发射区域压缩；分辨率随耗尽激光强度的平方根变化，商业机型（如 STEDYCON）横向分辨率约 50 nm，但轴向无附加改善；所用染料必须与耗尽激光匹配，eGFP 表现不佳，通常使用 star-red 类染料或 Halo-Tag 配合特异 STED 染料。单分子定位显微镜（SMLM，包括 PALM 与 dSTORM）分辨率可达约 20 nm。PALM 最早用 paGFP 演示，需要 405 nm 短波光激活，使少量分子在空间上分散到可分辨；paGFP 对比度有限，pamCherry 表现更好但瞬转细胞事先不发光。最常用的是来源于 EosFP 的 mEos3.2，它在 405 nm 下从绿光光转换为红光，对比度高，转染细胞可先用 488 nm 识别；EosFP 改造的单体版本如 mEos3.2 现在普遍使用，作者曾用其分析 α-actinin-2（ACTN2）在心肌细胞 Z 盘中的周转，类 FRAP 应用。dSTORM 与 STORM 同时发展，用一对染料标记的抗体，通过 β-巯基乙醇促使分子进入暗三线态，加氧清除剂延长暗态，再用 405 nm 短波光让少数分子重新进入基态并被激发定位；最常用染料为 Alexa 647。SMLM 的活细胞版本（sptPALM）使用可光激活/可切换荧光蛋白，少数分子被切换后追踪定位，但 405 nm 光对细胞毒性较大。所有 SMLM 都需要数千帧（典型 5000–10000）合成一张最终图。

光片（light sheet / 选择平面照明显微镜）严格说不是超分辨率，但通过仅照亮与成像平面一致的薄光片，避免激发平面外的荧光团，从而显著减少光漂白和光毒性，并改善轴向分辨率。晶格光片（LLS）可生成窄至约 500 nm、长度 12 μm 的超薄光片，特别适合单细胞、球体、小类器官及果蝇胚胎等样品；用其快速扫描可在不到 1 秒内采完整个细胞体积，XY 分辨率约 290 nm、Z 约 450 nm；商业版 Zeiss LLS 采用倒置配置并以 Alvarez 板校正折射率失配。整体上，最佳选择取决于显微镜的易得性、是否支持活细胞成像以及所需分辨率与速度；通常这些高端显微镜位于影像中心，由受过训练的工作人员协助使用。

Preparation and Transfection of Cells for Live Cell Fluorescent Imaging

大多数培养细胞都可用于活细胞荧光成像。初筛新 eGFP 融合蛋白时，常用瞬时转染与易转染的细胞系，例如 HEK-293（人胚肾 293）与 COS-7（非洲绿猴肾成纤维样细胞），但这些细胞的细胞骨架与整体形态有时不如其他细胞系发达，对细胞迁移与骨架研究未必适合。根据实验目的不同可选择其他细胞系：B16-F10（小鼠黑色素瘤）适用于片状伪足内的肌动蛋白动力学研究；肌源成肌细胞适用于成肌细胞融合研究；PC-3（人前列腺癌）适用于肌球蛋白异构体对细胞骨架组织与细胞迁移影响的研究。这些细胞系均可从 ATCC 获得。

DNA 偶尔可用小抽的质粒做快速测试，但转染效率较低；常规使用 Qiagen Plasmid 试剂盒进行大抽，并按厂家说明纯化，最终乙醇或异丙醇洗涤使其无菌。浓度用 nanodrop 在 260 nm 测，260/280 比值用于检查纯度；纯化 DNA 在无菌 TE 或蒸馏水中于 -20 ℃ 保存，目标浓度约 1 mg/ml。活细胞成像通常使用玻璃底培养皿（IBIDI Cat. No: 81218-200 等，#1.5 厚度 170 μm 盖玻片）；塑料底培养皿自发荧光强、光学质量差，应避免。盖玻片上可能需要用 poly-L-lysine、laminin 等附着因子预处理，具体依细胞类型而定。固定细胞实验中，可使用直径 13 mm 或 20×20 mm 的 #1.5 盖玻片；新盖玻片上有灰尘（灰尘会发荧光），需先清洗。简单的清洗方法是用含少量洗涤剂的热水颠倒冲洗约 1–2 分钟，再用热水洗 5 次、冷水 5 次、蒸馏水 5 次，最后保存于 70% 乙醇；也可用 1 M HCl 替代洗涤剂，再用蒸馏水洗 10 次。

对于 dSTORM 等更具挑战性的超分辨率应用，作者使用强酸洗程序：将 #1.5 20×20 mm 盖玻片放入耐酸的盖玻片架（如 Thermofisher C-14784），戴手套防止接触腐蚀性化学品；在通风橱内将 125 ml 蒸馏水、25 ml 氢氧化铵与 25 ml 过氧化氢混合于 250 ml 玻璃烧杯中，置于 80 ℃ 加热搅拌器上，把盖玻片连同支架浸入清洗液至少 3 小时并持续搅拌；之后转入装有至少 150 ml 蒸馏水的干净烧杯中，洗 9 次（每次换 150 ml 新鲜蒸馏水），再转入甲醇或 70% 乙醇中保存。需要时单片用镊子取出，短暂通过本生灯火焰灭菌后放入干净染色架；操作中需特别小心，盖玻片受热时极易碎裂。细胞培养在这些盖玻片上后，按需包被附着因子，固定染色后倒置于含 dSTORM 缓冲液的带凹槽载玻片上，密封后即可成像。

转染前一天将细胞传代并按所需密度铺板于成像皿或盖玻片上。吸去培养基，加足量 TrypLE 覆盖生长面（如 25 cm² 培养瓶加约 1 ml），放回 37 ℃ 培养箱 1–2 分钟，用相差显微镜（Nikon 倒置 ×10）确认细胞脱壁；再加新鲜培养基（如 DMEM + 10% 血清 + 青链霉素，25 cm² 瓶加 10 ml）中和 TrypLE，将含细胞的培养基转入 15 ml 无菌 Falcon 管，1000 rpm 离心 5 分钟沉淀细胞；几乎完全吸走上清，轻弹管底使沉淀松散，重悬于 1 ml 培养基。取约 10 μl 用 Neubauer 血球计数板计数，将浓度调至约 5×10⁵ cells/ml；向玻璃皿（生长面积 3.14 cm²）加 400 μl（约 2 万细胞），得到约 6 万细胞/cm²（即 1×10⁶ μm²），约 50–80% 汇合度；让细胞贴附 5–10 分钟，再补足培养基至约 2 ml。也可将细胞以约 50 μl 小滴分散点于皿面，贴附后再加 2 ml 培养基，从而在皿内获得不均匀的细胞密度。

转染常用 FuGENE 6，偶尔用电转（如核转）；不同细胞系应测试不同转染方法，所有步骤在组织培养通风橱内无菌操作。FuGENE 6 在 4 ℃ 保存，使用前置室温约 15 分钟；试剂与 DNA 通常按 3:1（如 6 μl FuGENE 6，2 μg DNA）。将 6 μl FuGENE 6 直接加入约 92 μl 无血清培养基（DMEM，不含抗生素）的 1.5 ml 无菌 Eppendorf 管中，轻弹混匀，孵育 5 分钟；加入 2 μg（约 2 μl）DNA 质粒使终体积 100 μl（DMEM 初始体积需根据 DNA 体积调整），轻弹混匀后室温孵育至少 15 分钟；将混合物滴加到细胞上，放回培养箱；细胞在 24–48 小时后可成像。除转染外，还有许多小分子荧光探针可直接加入活细胞孵育约 1 小时后成像，例如 SPY-DNA、SPY-F-actin（荧光 latrunculin 类似物）、SPY-tubulin（荧光紫杉醇类似物），均可在 Spirochrome 购买；亦有针对线粒体（Mito-Dye、MitoTracker）、溶酶体、内质网膜等的荧光探针以及线粒体膜张力报告探针（同样可从 Spirochrome 购买）。各探针需在自己体系中测试其效果，公司通常愿意提供免费样品以供测试。

为生成球体（spheroid），通常使用稳定转染细胞（也可使用瞬转细胞）。稳定转染的转染步骤与前述相同，但细胞在转染当日铺入 6 孔板的一个孔；转染次日将细胞传代至新孔并加入含 G418（geneticin，氨基糖苷类抗生素）的新鲜培养基。大多数 eGFP 等表达质粒含抗性基因，可使细胞在 G418 存在下存活；针对每种细胞系预先确定 G418 浓度，使未转染细胞在 5 天内 >90% 死亡。经 7–10 天筛选，可保留为表达 eGFP 混合系细胞，也可用 FACS 分选单个荧光细胞、按约 1 细胞/孔铺入 96 孔板获得单克隆；也可在首次加 G418 时即以低密度（约 1×10⁴ cells/ml，20 ml 铺 25 cm² 皿）做克隆选择，7–10 天后挑选单克隆。生成球体的两种主要方法：一是使用非贴壁皿（如 Nuclon Sphera 多孔板），将消化计数的细胞稀释至 5×10³ cells/ml，每孔加适当体积（96 孔 200 μl，24 孔 500 μl 等），3–4 天后成像；二是简单的悬滴法，在 100 mm 直径塑料培养皿底加约 10 ml 无菌 PBS，将约 1–2×10³ cells/ml 的细胞悬液以 50 μl/滴（约 800 细胞）间隔点于倒置皿盖上，将皿盖小心翻转扣回皿底，约 2 天形成球体。

Preparation and Transfection of Cells for Live Cell Imaging

转染后 24–48 小时，作者用宽场倒置荧光显微镜检查 >20% 的细胞表达所选 eGFP 或其他 FP 融合蛋白，之后通常向培养基中加入 10–20 mM 无菌 HEPES（来自 1 M 储存液）。大多数细胞培养基含碳酸氢钠，与培养箱内 CO₂ 共同维持 pH；但多数显微镜难以维持 5% CO₂ 环境，HEPES 可在数小时内替代碳酸氢钠维持 pH。标准生长培养基对细胞健康有利，但含酚红（pH 指示剂）和血清，二者均会发荧光。当 eGFP 信号弱时，作者使用商用的无酚红、无血清成像液，包括 Live Cell Imaging Solution（Fisher Scientific）和 Fluorobrite DMEM（Thermofisher Scientific）。前者含 140 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、1.0 mM MgCl₂ 和 20 mM HEPES，但不含葡萄糖和血清，仅适合短时（最长约 4 小时）活细胞成像；Fluorobrite 实质是无酚红 DMEM，补加血清与谷氨酰胺（或 glutamax）可支持较长时间培养，在非 CO₂ 环境下仍需添加 HEPES。

为对球体进行成像，作者用低熔点琼脂糖（Sigma Aldrich 等，适用于细胞培养的级别）将其固定。配制 1% 溶液（0.5 g 琼脂糖加 50 ml 水，加入无菌 50 ml Falcon 管），微波加热至溶解后于水浴中冷却至约 40 ℃。将单个球体从悬浮培养（悬滴或非贴壁板）中小心转移至 8 孔玻璃底皿的一孔中（培养基约 100 μl，含 HEPES），加入 100–200 μl 温热琼脂糖溶液，将皿放回培养箱。琼脂糖与培养基的比例决定凝胶最终的"硬度"。作者不使用 Matrigel，因为它散射过多光，会显著降低图像质量。

Confocal and Airyscan Imaging

作者实验室日常使用一台配有快速 Airyscan 的 Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜进行活细胞成像，所用物镜为 ×40 N.A. 1.4 油浸物镜。显微镜配有加热台，使用前打开加热至 37 ℃ 并预热 30–60 分钟，以减少成像开始后的热漂移和样品失焦。样品上台后先用目镜检查，再切换到共聚焦模式；即使计划使用 Airyscan，也通常先用共聚焦模式拍摄首张图（以 488 nm 激光激发 eGFP，Airy 设为 1），调节激光强度与增益以获得良好信噪比，再切换到 Airyscan，选择 SR（超分辨率模式），再次调整激光强度与增益；然后选择 Z 起始和终止位置采集 Z-stack。如果需要首先表征整个细胞深度内的蛋白组织，则采集从顶到底覆盖整个细胞的 Z-stack；之后确定要继续采集的 Z 区域与裁切位置（如细胞前导边），用单平面或短 Z-stack 跟踪小区域。Z-stack 的大小与时间间隔依样品而定，首次对新构建体成像时会测试不同 Z-stack 大小与时间间隔。例如驱动蛋白 kinesin 沿微管移动速度约 0.5–1 μm/s，为在分辨率约 0.3 μm 的显微镜上逐帧可靠追踪同一荧光点并测量速度，需要至少 2 fps 的帧率。

以在 PC3 细胞中表达 eGFP-Myo1E 为例，作者首先采集覆盖整个细胞的较大 Z-stack（900 × 900 像素 XY，88 切片，间距 0.173 μm，总 Z 深度 15.22 μm），用以概览细胞形态并发现 eGFP-Myo1E 主要位于细胞皮层与丝状伪足结构中；然而对整个 Z-stack 逐时成像（约 1 个 Z-stack/分钟）速度过慢，且可能光毒性大。Z-stack 显示许多丝状伪足位于细胞基底层与外周，从而可判断应将成像区域缩小到富含突起的部位。作者将 Z-stack 减至 3.29 μm（19 × 0.173 μm 步距），将区域裁切到细胞边缘富含突起处（XY 444 × 444 像素），放大到 ×10.9，使一次 Z-stack 采集可压缩到 1 秒以内，仍能定量 eGFP-Myo1E 丝状伪足的整体行为（生长、收缩、数量变化）；若需测量 Myo1E 在丝状伪足内的动态运动，则需将成像速率再提高 5 倍以上。当 Airyscan 在较大视场下对快速事件仍嫌过慢时，作者改用 iSIM，对细胞质中移动较快的颗粒（如病毒蛋白颗粒）成像；iSIM 在约 90×80 μm（1745×1550 像素）的大视场下可达 100 fps，最小 Z 步距 0.05 μm，以 0.173 μm 步距采集 3.29 μm 的 Z-stack 比 Airyscan 快约 5 倍；最终分辨率与 Airyscan 相当，但自建 iSIM 仅配 488 nm 与 561 nm 两束激光，且光漂白比 Airyscan 快，因此 iSIM 更适合短时间大视场高分辨成像，特别是追踪快速运动目标。

随着 3D 模型（球体、类器官）应用增加，作者也用共聚焦对球体成像，但更关注一次观察多个细胞并以较快帧率评估小区域内动态行为；通常在单平面成像即可，例如用 eGFP-lifeact 标记 F-actin 后比较野生型 PC3 球体与用 siRNA 敲低 Myo1e 或 Myo10 的球体，可见敲低细胞中聚焦良好、富含 eGFP-lifeact（即富含肌动蛋白）的突起减少；Myo1e 敲低细胞中仍存在细小突起，而 Myo10 敲低细胞似乎只能形成 blebs。

Lattice Light Sheet

对大体积细胞或 3D 成像而言，更温和的选择是晶格光片显微镜。样品制备与共聚焦活细胞成像完全相同，需要 #1.5 玻璃底皿。晶格光片配有三束激发激光（488 nm、561 nm 和 640 nm），蓝色波段通常对细胞光损伤更大；成像使用 48× NA 1.0 水浸物镜，作者通常用 1000 nm × 30 μm 的光片对细胞、球体和小型类器官成像。在晶格光片中，光片以一定角度[参考文献 29]高速扫过样品，步距 0.2 μm（例如 10 个平面组成的图像覆盖 2 μm）。与任何显微镜一样，采集速度取决于所需视场大小（软件可调）；以 1000 nm × 30 μm 光片对包含多个细胞的小球体的大视场成像时，单个时间点（完整扫描）只需约 4 秒。裁切到更小 ROI 可显著提高帧率，而本例中较大视场可在 3D 下快速同时观察许多细胞并可视化其相互作用。

Processing and Analysis

图像就是数据，与其他数据一样需要处理与分析。作者通常对固定细胞的 Airyscan 和 STED 图像进行反卷积，可带来约 1.4 倍的分辨率提升，使用 Huygens Professional 或 Zeiss 共聚焦软件（Zen Blue）；活细胞图像通常不做反卷积，但若需要看清细节也会做。LLS 图像也可反卷积，需在校斜（deskewing）之前完成，Zen Blue 内置此功能。图像分析根据具体定量需求选择不同软件，包括商业软件 Arrivis、Imaris、Huygens，或开源的 Fiji（ImageJ bundle，https://imagej.net/software/fiji/）；Fiji 是开源软件，社区提供大量插件（https://imagej.net/plugins/）。作者也开发了自己的软件，例如用于分析球体的 ImageJ 插件。ICY（https://icy.bioimageanalysis.org/）提供免费图像分析软件，可与 ImageJ 和 Matlab 互操作；CellProfiler（https://cellprofiler.org/）目前为版本 4，可用于多种定量任务。对喜欢编程（尤其是 Python）并需要分割细胞核、细胞器或细胞体的人来说，可使用 Napari（https://napari.org/stable/）和 Cellpose（https://cellpose.readthedocs.io/en/latest/index.html）。作者也开发了基于 Python 的软件用于分析超分辨率图像中的模式。

Take Home Message

作者在 Take Home Message 中强调三点：活细胞成像对理解细胞行为动态、细胞骨架随时间的重塑、细胞器运动等至关重要；过去几年中涌现了许多新的活细胞成像方法，分辨率不断提高；超分辨率成像技术虽然应用于活细胞具有挑战，但 Airyscan、SIM/iSIM 和光片相对易于使用；图像应被视为"数据"，应据此设计实验以确保能分析所需内容（包括分辨率、成像速度、ROI 和图像分析方法的选择）。

本章个人批注

Peckham 这章的结构其实非常清晰：第一节铺原理——FP 选型、衍射极限、几种超分辨率的光学机制与权衡；第二节讲"如何把细胞准备好"——从 DNA 纯化到玻璃底皿清洗到转染到球体制备；第三节补完活细胞成像特有的几个细节（HEPES 替代 CO₂、低背景成像液、琼脂糖固定球体）；第四节是操作实例（Zeiss LSM 880 + Airyscan、iSIM 的取舍），并嵌入光片与图像处理两小节。从阅读角度看，前两节信息密度大且便于作为方法学参考；第四节的具体参数（Z-stack 步距、帧率、激光波长）是真正动手时会反复翻回来的内容。最让我印象深的是她反复强调的"images are data"——很多新手以为拍到好图就完成了实验，但她把 ROI 大小、Z-stack 深度、帧率、分辨率都还原成"先想清楚要量化什么再设计采集"这种工程化思路。α-actinin 的 N/C 端标签对照、kinesin 的速度反算帧率、Myo1E/Myo10 敲低的 bleb vs filopodia 差异——这些例子都很具体，能直接迁移到自己课题的设计阶段。

与上下章的衔接（一段话）

承接上一章 Ch07（Methods to Investigate Cell Migration）从总体方法学的概览，本章进入"高分辨荧光成像"这一具体分支：Ch07 主要介绍活细胞成像、跨膜迁移分析、流式细胞术与共培养等方法的大类，而 Peckham 在这里专攻其中最有空间信息量的一支——荧光成像，从 FP 选择、显微镜选型到转染与样品制备、Airyscan 与 iSIM 等的具体操作，再到光片和图像后处理。这与下一章 Ch10（Computational Modelling of Cell Migration）在风格上正好相反——Ch10 是从数据中抽提数学模型，本章则强调如何在数据产生阶段保证其质量（分辨率、对比度、时序、ROI 设计），二者互为前提：模型的价值取决于输入数据的时空精度。Take Home Message 中"images are data"恰是连接本章与后续建模/分析章节的暗线。