第 7 章：研究细胞迁移的方法（Methods to Investigate Cell Migration）

1 细胞迁移检测方法（Cell Migration Assays）

细胞迁移能力被发现，以及该细胞行为与疾病之间的关联被确立，使得从细胞与亚细胞水平精细地表征细胞迁移逐渐成为研究热点。要研究细胞迁移，前提是学会培养感兴趣的细胞——体外细胞培养技术本身的发展是细胞迁移研究的一座里程碑。第一批体外细胞培养由美国胚胎学家 Ross Granville Harrison（1870–1959）建立，他沿袭 Wilhelm Roux（1850–1924）的思路，从蛙胚中取出活组织，并在供体之外建立了生长条件。Harrison 注意到组织生长依赖于固体支持物，他发现最理想的支持物是成体蛙的淋巴液；他也意识到无菌操作的必要性，决定用无菌蒸馏水清洗胚胎供体，因此成为最早采用无菌技术的组织培养使用者之一。借助这一首例体外系统，Harrison 得以观察到样本中伸出的长条状延伸物，其活跃的运动形式与神经元相似 [1]。首批在体外培养的人类细胞来自宫颈癌患者 Henrietta Lacks（1920–1951）的癌组织，1951 年由她的外科医生将子宫组织活检样本转交给癌症研究者 George Otto Gey（1926–1970）。Gey 在合适的培养条件下发现这些肿瘤细胞能够无限增殖生长，从而成为首例被建立的细胞系，并以其供体命名为 HeLa [2, 3]。HeLa 细胞是最早用于癌症研究的细胞，也对脊髓灰质炎疫苗的开发起到了重要作用 [4]。Jonas Salk 博士在全球脊髓灰质炎暴发后开发出灭活疫苗——HeLa 细胞易被该致病病毒感染，因而支持了病毒的大规模生产。多年之后，为了提升人类免疫缺陷病毒（HIV）的生产与表征，研究者再次使用 HeLa 细胞，发现它们对 HIV 感染相对耐受，由此支持了对 HIV 病毒生命周期的研究 [5]。HeLa 细胞的使用也带来了伦理问题：取组织时未获得本人同意，而该组织被"永生化"成为研究工具；即便在今天 HeLa 仍在使用，据估计基于 HeLa 的相关论文已超过 70,000 篇 [1]。Henrietta Lacks 的后代在其身后被告知该未经同意的组织获取与使用，并因此推动了美国关于患者知情同意相关法律法规的修改 [1]。

在首批无限增殖细胞培养成功之后，许多癌细胞如今已被常规地在体外培养；许多所谓"已建立细胞系"是在添加了胎牛血清（FCS）的培养基中生长的，但当代的趋势更倾向于将近期从患者获得的癌细胞以其干细胞样状态培养——使用无血清、且含特定生长因子的限定培养基 [6]。生长培养基的选择对培养成功至关重要，其源头可追溯到 J.F. Morgan（1918–1976）开发的第一种用于哺乳动物细胞培养的合成培养基 M199 [6]。在二维（2D）单层细胞培养的基础上，近年来的进展包括通过搅拌法、悬滴法或使用低粘附板从细胞悬液生成细胞球（spheroids）。球体是三维（3D）结构，类似于其原始器官/肿瘤，因此在结构上能够再现原始组织。该球体技术的进一步进展是类器官（organoid）的产生——如 Lancaster [7] 描述的，由人多能干细胞在 3D 基质与旋转生物反应器的支持下生成迷你大脑。由于所形成的结构包含多种神经细胞，因此其结构类似于人脑。该模型随后被进一步发展为经基因操作的脑肿瘤模型 [8]。技术甚至发展到可以 3D 生物打印整个器官 [9, 10]。

随着对不同细胞可获得性的提升，过去 15 年里用于分析细胞迁移/侵袭能力的检测方法也取得了长足进步。根据科学问题的不同，可以从以下几个维度分析细胞的迁移能力：迁移速度或方向性迁移（随机细胞迁移）；跟随外部信号（如趋化因子轨迹）的能力（趋化性）；侵入三维环境的能力（侵袭）。对于每一个这样的兴趣点，都有相应的实验装置可供探索。因此，定义明确的研究问题对于选择最合适的实验装置至关重要。

2 二维（2D）随机细胞迁移（Two-Dimensional (2D) Random Cell Migration）

分析细胞迁移的一种最基础方式是研究随机细胞迁移。具体做法是：将待研究的细胞以亚汇合度接种到专用成像皿中，然后在一定时间窗口内允许其迁移。活细胞成像（live cell imaging）是记录迁移能力的首选方法；作者所在实验室常规进行这类实验以测定胶质瘤细胞的速度与方向性。细胞可以暴露于药物、过表达感兴趣基因或沉默感兴趣基因。通过与对照组对比，即可分析细胞在速度、迁移距离、迁移方向性或可视的形态学变化方面的差异。以下方案基于作者自身的经验，但可根据个体需求以及可用的设备与设施进行调整。

对于该实验方案，所选细胞被胰酶消化并计数。根据细胞的增殖速率与实验的时间窗口，将细胞稀释至亚汇合水平，然后加入专用的、最好为玻璃底的成像皿（如 Ibidi 出品的玻璃底皿）。作者常规使用被分成四个象限的圆形皿，以便同时设置四种不同的实验条件。细胞按预设密度加入皿中，随后使用 BioStation IM-Q（Nikon）或 Incucyte（Essen BioScience）等活细胞成像系统在一定时间间隔下进行成像。作者最近还获得了 Phase Holographic Imaging PHI AB 公司的 HoloMonitor 的良好结果。这些系统均能在维持细胞最适生长条件的同时对活细胞进行成像。成像时间间隔可再次根据细胞的迁移能力与特定的科学问题来确定。在作者自身的随机细胞迁移研究中，允许胶质瘤细胞在 30 分钟的时间间隔下迁移共 72 小时。所得的影像可以使用 ImageJ [11] 配合 Tracker 插件、Ibidi 的细胞迁移分析工具等免费软件，或使用 Volocity（Perkin Elmer）或 Incucyte（Essen BioScience）系统等全自动软件工具进行分析。可以测定细胞速度、方向、迁移距离等参数，并可绘制细胞轨迹以便直接比较不同细胞群。最新进展也支持 3D 成像，因此随机细胞迁移研究可在 3D 下进行评估，这对基础迁移特征的比较以及研究特定抗迁移抑制剂的作用都具有极强的信息量。活细胞迁移成像是实验设计与装置方面最直接的检测方法之一，但它需要获得可能非常昂贵的成像设备与软件工具；此外，专用塑料皿也可能很昂贵。详细方法可参见文献 [12, 13]。图 1 给出了随机细胞迁移与分析的概览。

2.1 划痕检测/伤口愈合检测（Scratch Assay (Wound Healing)）

研究伤口愈合或细胞以集体方式彼此向对方迁移的能力，使用伤口愈合检测或划痕检测。该检测在科学文献中有多种变体，但基本原理都是在细胞单层中人工制造一个伤口，然后评估细胞向该伤口迁移的能力。例如抗迁移抑制剂的作用，可以通过细胞重新填充所引入空白区域的能力来评估。间隙的百分比变化可以被测定并用于分析细胞迁移。这里只是众多划痕检测设置与解读示例之一。

细胞以预设密度接种于 24 孔板，使 24 小时的培养后达到单层 80–90% 的密度。接种前，在每孔底面用细记号笔沿中央划一条线。24 小时孵育后（时间点取决于所用细胞类型），用 p200 枪头沿细胞单层中央、与记号线垂直的方向轻柔、缓慢地划出一道划痕。然后用培养基洗孔两次以去除脱落的细胞，并替换为含或不含（例如）药物或抑制剂的新鲜培养基。划痕处的细胞迁移通过 EVOS（ThermoFisher Scientific）等成像系统或 HoloMonitor（Phase Holographic Imaging PHI AB）等自动化活细胞成像仪在 ×4 放大倍数下于 0、4、8 与 24 小时成像测定。细胞迁移的定量可以通过 ImageJ 软件 [11] 的手动分析（测量间隙面积、计算随时间的百分比变化）或借助自动化成像系统自带的辅助分析软件工具完成。该方法简洁、低成本、易于在最优细胞密度与检测条件确定后重复。然而，关于细胞增殖在覆盖伤口中的作用、细胞外基质（ECM）的重要性、引入伤口时可能造成的细胞损伤以及细胞位移等方面，仍可能存在不确定性。该技术已有进展——目前已有可用的检测通过压印（借助固体或液体屏障）、化学液滴、微流控、电刺激或激光消融（伤口检测）等方法制造伤口 [15]。详细方法请参见文献 [16–19]。图 2 给出了划痕伤口检测的概览，展示了包括接种细胞、引入划痕以及细胞向划痕内迁移的图像与图表。

2.2 Transwell 检测（Transwell Assay）

在划痕检测的基础上，还可以评估细胞向趋化因子迁移的能力，即评估它们跟随或迁移向外部信号（如化学"轨迹"）的能力。这通过所谓的"Transwell 检测"建立——细胞被接种到含多孔膜（可选用不同孔径）的塑料内插物中，然后将内插物放入例如 12 孔或 24 孔平底塑料孔板中。在含膜的内插物中，加入感兴趣的细胞（可选择不添加 FCS 或某种刺激迁移活性的配体）；而在孔板的孔中加入趋化因子，使其包绕并润湿内插物。细胞将开始向趋化因子迁移，并且必须穿过膜。因此，迁移活性可以通过固定与染色膜、计数已穿过膜的细胞数来评估。该技术在癌症研究中的一个优势是细胞必须穿过 transwell 膜，这很好地代表了体内细胞必须穿过的有漏内皮。在侵袭实验中，可以向内插物中加入基质以模拟跨 ECM 的迁移，也可以直接用 transwell 膜本身。该检测廉价、简单、易于设置与执行。另一方面，该检测仅允许评估单细胞的迁移，且其生理相关性不足。

下文展示了一种测定细胞趋化迁移能力的常用协议。为获得有意义的结果，应以三复孔进行实验并在不同日期重复三次。该检测需要准备工作，因为 transwell insert（有不同孔径）在使用前可以用 ECM（如纤连蛋白）预包被。再经过孵育步骤与若干次 PBS 洗。若进行抑制研究，应预先用抑制剂孵育细胞至少一小时。开始检测时，向孔板外侧（即内插物外的孔）中加入含趋化因子的培养基，例如 FCS。在 insert 内侧加入不含趋化因子的生长培养基。细胞被胰酶消化并计数，本例中约 50,000 个细胞加 50 μl 培养基被加入 transwell insert。然后将孔板放回培养箱，让细胞在 4–6 小时内向趋化因子迁移，时间取决于所研究的特定细胞类型/系。检测结束时，将 insert 浸入 PBS 中清洗。用棉签将 insert 内侧的剩余细胞刮除。再将 transwell insert 浸入 PBS 中清洗掉任何剩余未贴附的细胞。将 PBS 从 insert 中吸出并替换为每孔 1% 戊二醛/PBS。膜固定 10 分钟（若使用甲醇/醋酸则为 2 分钟）。将 insert 放入蒸馏水中 1 分钟，再放入按 1:500 稀释于 PBS 的 DAPI 中孵育 5–10 分钟。孵育后，insert 用 PBS 洗一次、再用水洗两次。可以将 insert 保存在原板中、最后一次水洗后用铝箔包裹于 4 ℃ 直至分析。分析膜时，通过显微镜在 insert 中随机选取的 3–4 个视野（每条件 3 个 insert）进行细胞计数；可以使用 Velocity 等自动化软件完成。为测定迁移，将所有计数平均后以相对于对照组的百分比表示。详细方法请参见文献 [20–23]。图 3 描绘了 transwell 检测的概览：图示展示了 transwell insert 的实物图及其放入 24 孔板内的情形；细胞被加入 insert 中并在数小时内向趋化因子迁移；蓝色（DAPI）染色的细胞核可以在固定与染色穿过膜的细胞后计数，并以图形表示结果。

2.3 跟随空间线索（Following Spatial Clues）

分析癌细胞跟随外部空间线索能力的另一种方法是使用专门的孔板——孔板中含对齐或非对齐的纳米纤维。这类孔板的一个应用是研究胶质瘤细胞能否作为其迁移活动的一部分而跟随神经元轨迹。因此，这些孔板提供了模拟神经地形学的支架。它们相比非特异性的随机细胞迁移能更好地再现原生细胞运动与拉长的形态。对齐的纳米纤维模拟神经元轨迹，因此应能支持细胞沿对齐纤维的轨迹迁移。可将细胞球接种到这些轨迹上，并通过使用荧光活细胞示踪剂来通过成像追踪迁移信号。为测定迁移活性，可以测量随时间被迁移细胞覆盖的面积，或测定距接种到纳米纤维板上的原始球体几何中心最远的迁移细胞所移动的距离。作者已成功使用该检测评估细胞的此类跟随外部线索的能力。该技术的缺点在于纳米纤维板的成本、生成球体时如使用专门孔板的成本，以及显微镜系统的可及性。

2.3.1 纳米纤维检测（Nanofibre Assay）

进行该检测时，应生成待研究细胞的球体。这可以通过多种方法实现。生成细胞聚集体时可以使用多种方法。本方案中，使用一种基于琼脂的方法。琼脂糖溶解于高葡萄糖培养基中。将琼脂糖放入沸水浴中直至完全溶解。然后将琼脂糖冷却，并在无菌条件下过滤灭菌或高压灭菌，之后可加入抗生素。在琼脂糖凝固之前将其加入 35 mm 培养皿中。在组织培养通风橱中使皿凝固以保持无菌。用石蜡膜封口，并于 4 ℃ 保存。可保存至 3 周。

使用时，将琼脂板于 37 ℃ 在合适的培养基中孵育 1 小时。移除培养基以清除琼脂板上的碎屑，并加入新培养基。胰酶消化并计数细胞后，按所需细胞数加入琼脂板。为促进聚集体形成，应轻轻摇动琼脂板，并每隔数小时持续如此。形成的聚集体在正常生长条件下孵育至少 24 小时。为便于可视化，可以用预定浓度的 CellTRacker 等荧光标记对形成的聚集体进行染色 1 小时。优选 Green CellTRacker——已显示其他颜色会影响细胞运动性。用移液器将聚集体轻柔转移至两个 35 mm 皿中，依次转移以洗去多余染料，并在最终皿中加入培养基。对于该检测，市售的纳米纤维板用无菌水或 PBS 轻柔洗涤 3 次以去除孔中的碎屑。板自然晾干，然后可以预包被纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原或透明质酸等底物以促进贴附。预包被时，将预定浓度的底物加入孔中并在室温下孵育 2 小时。孵育后，用无菌 PBS 洗两次并加入生长培养基。

在体视显微镜下从皿中挑选聚集体。操作必须在组织培养通风橱中以无菌方式进行；所有设备在使用前必须用乙醇擦拭。用 10 μl 移液器挑取聚集体，然后转移至纳米纤维板的孔中央。注意不要让移液器吸头损伤板表面的对齐纳米纤维。然后盖上板盖，让其在组织培养通风橱中静置最多 25 分钟以促进聚集体贴附。最后向板中加入生长培养基（含或不含感兴趣的抑制剂），并通过在预定时间窗（例如 24 小时）内多个时间点、以低放大倍数（如 ×4 或 ×10）成像荧光信号记录细胞迁移。成像可通过延时成像或用荧光显微镜拍摄快照实现。

除了使用源自琼脂板的细胞聚集体外，球体还可以通过悬滴法生成。具体做法为：胰酶消化、计数并以预定的细胞密度制备细胞悬液。在无菌条件下，准备培养皿——取下皿盖，在盖内侧用 20 μl 移液器滴加 20 μl 细胞悬液。细胞溶液的液滴被小心地滴到盖子上，每个液滴之间留出一定间距。在皿底部加入 10 ml 无菌 PBS，然后将带有悬滴的盖小心地放回原位。将皿小心地转移至培养箱。球体形成在 72 小时内即可完成，根据细胞性质也可能需要长达 1 周。用于纳米纤维时，将皿盖小心取下并翻转使液滴朝上，然后用 2 μl 移液器从原始液滴中挑取球体。球体通常因外观不透明而可识别。为了球体大小均匀一致，建议使用低粘附板等其他生成球体的方法，但会使该检测因低粘附板的成本而变得昂贵。详细方法请参见文献 [24–27]。

图 4 给出了纳米纤维检测的示意概览：使用专门的纳米纤维板将球体加入对齐纤维上。癌细胞从原始球体出发沿纤维轨迹迁移，可通过添加荧光标记进行可视化。加入抗迁移药物后对细胞迁移的影响可以通过荧光信号与细胞迁移距离来评估。

3 三维侵袭（Invasion in 3D）

细胞向周围基质的侵袭可通过引入细胞可侵入的细胞外基质来评估。常用基质包括 Matrigel、胶原以及合成基质（如 PeptiGels（Manchester BioGel）与水凝胶等）。在使用 Matrigel 时，作者成功将其与 transwell 检测结合使用——在 transwell 膜上方加入一层 Matrigel，以促进所观察细胞的侵袭活性。然后可以通过共聚焦显微镜在荧光标记侵入基质的突起后，计数从细胞或细胞聚集体发出的突起与细胞延伸。

在上述示例的基础上，作者还常规使用基于胶原的侵袭检测评估抗迁移抑制剂对 3D 胶质瘤球体迁移/侵袭的影响。该方法中，球体被嵌入胶原支持的基质中，迁移细胞被允许侵入周围环境。侵袭通过显微镜随时间评估，数据可以通过为待研究细胞建立个体迁移指数来分析。以下给出作者标准的迁移检测协议。

在开始检测前，使用前述低粘附 96 孔板生成球体。作者测试过不同厂家生产的孔板，发现 Nunc 低粘附板在球体均匀性以及不同类型和范围的癌细胞测试中结果最为一致。建议获取不同厂家的多种孔板，并对哪种孔板类型最适合特定细胞类型做初步评估。细胞再次被胰酶消化、计数，然后按预定密度加入孔板孔中，并孵育至少 72 小时以使细胞形成可见的球体。作者的经验是，使用患者来源的细胞系时该过程可能需要更长时间。一旦球体形成，即可进行侵袭检测。为此，准备要使用的基质——如上所述，可以是动物来源的产品如胶原，或者同样适用且在作者经验中更优的合成基质如 PeptiGel 或水凝胶。将所选基质与生长培养基和一种聚合剂混合。就在加入该混合液之前，先小心地吸除 96 孔板中的生长培养基，同时避免吸走球体。一旦将聚合剂混入基质，立即将其加入已去除生长培养基的球体中。该操作必须既迅速又仔细，以避免在基质开始聚合时形成气泡。然后将板放入培养箱以促进聚合，通常在 30 分钟内完成。向基质块中加入含或不含抑制剂的生长培养基，并通过显微镜按一定间隔（即 72 小时内每日一次）对单个球体成像。图像可以手动分析，也可以使用所生成的图像和 ImageJ 等软件工具自动记录，以确定迁移细胞相对原始球体的迁移指数，或使用 Holomonitor（Phase Holographic Imaging PHI AB）等成像分析仪。相比手动分析，成像系统的优势在于避免使用者偏倚、数分钟内生成数据、并以图表与读数形式输出。然而，此类系统昂贵且需要较大的初始预算。

作者的经验是，嵌入于天然或合成基质中的球体与迁移细胞还可以通过免疫组织化学或免疫荧光进一步分析。作者能够获得关于（例如）新型抗迁移抑制剂对迁移细胞骨架组分影响的有价值信息。为此，球体在其基质块中被固定并染色相关过程，仍在原板中进行 [28]，使得这些初始处理步骤非常简便。详细方法请参见文献 [12, 13, 29]。图 5 给出了 3D 侵袭检测的示意概览，突出了在孔板中生成球体、细胞侵入胶原基质、通过免疫荧光显微镜可视化细胞侵袭以及结果的图表表示等不同步骤。

3.1 类器官与器官芯片（Organoids and Organs on a Chip）

类器官是从原代细胞或诱导多能干细胞衍生而来的三维结构。干细胞能够分化并共同生长形成各种特化的类器官。要启动类器官的生产，干细胞与 Matrigel 等基质混合，并将液滴在室温下加入 24 孔板。然后将板转入培养箱以促进拱形液滴的形成。至少形成 1 周后，加入培养基以促进增殖并分化为特定组织，如脑或肺。培养基由与 ECM 相关的蛋白质和各种生长因子组成，这些组分经过精细调整与配方化以构建特定组织。培养类器官是一个多步骤且耗时的过程，必须通过监测确认其含有正确的组织与分化状态。这可以通过高内涵成像分析生长与分化实现。此外，还需要将所形成结构的 3D 重现与细胞形态学以及特定生物标志物的表达结合分析，以确认类器官的完整性。因此，该技术可能既昂贵又耗时，然而已知类器官能够再现其衍生来源的原始组织与器官。

类器官的另一个方面是器官芯片（organ-on-a-chip）检测。该方法通过在支持性的 3D 基质中共培养细胞，并借助微流控系统让营养物与反应物持续流过正在形成的细胞结构，从而模拟器官的生理学方面。这种模型的生物学相关性使其对药物筛选或毒性测试特别有吸引力。

3.2 组织切片侵袭模型（Tissue Slice Invasion Model）

组织也可直接用于分析细胞迁移。该方法的基础是采集待研究的组织，例如脑组织，储存在含抗生素与抗真菌剂的预定生长培养基中。组织在采集后可在 4 ℃ 保存至 24 小时。然后将组织切成 0.25 至 0.5 cm 的片段，并以相同培养基保存。之后将其包埋于用 PBS 稀释的 3% 琼脂中；模具置于冰箱中。

设置 Leica 振动切片机，切出 250 μm 的切片。速度设置可能因组织而异。然后将切片转入含生长培养基的 6 孔板中，于培养箱内 37 ℃ 与 5% CO2 下培养。

更换生长培养基后，可将球体放置在切片上，使其贴附并迁移进入组织。实验结束后，将组织切片固定。方法是去除上清液（上清也可保留，离心后储存于 –80 ℃ 供后续分析），然后用 DPBS 洗切片两次；最后一次 PBS 洗替换为 10% 福尔马林，孵育 2 小时。去除福尔马林，并重复洗涤两次。在切片仍处于洗涤液的状态下获取用于后续免疫组化样品制备的 cassettes，并将切片转入 cassette 以进行后续处理。处理可以按常规免疫组化（IHC）程序手工完成，或使用处理机完成。然后样品即可准备进行石蜡包埋与切片。详细方法请参见文献 [30–33]。图 6 给出了组织切片检测的示意概览，突出了待研究组织的切割、切片制备、在培养基中培养以及加入感兴趣的球体进行组织侵袭检测。

4 体内成像（In Vivo Imaging）

细胞迁移也可以在体内进行成像，但是否选择该方法必须仔细考虑伦理问题、成本以及用于饲养动物与成像的合适设施。在体内成像中，可对动物使用非侵入性技术，包括磁共振成像（MRI）与正电子发射断层成像（PET）。更常用的技术包括发光/荧光成像的应用，这允许在整个生物体内观察过程。活体成像（intra-vital imaging, IVM）允许在活体生物体内对细胞过程进行连续监测。该方法聚焦于某些器官或组织，是一种高度侵入性的方法，涉及所观察部位的外科外露化。其基础是荧光探针与荧光显微镜的开发——后者利用可在特定波长被激发并发射可被检测光子的荧光团。肿瘤可通过基因操作进行荧光标记，并已有人尝试在原位检测此类被标记的肿瘤。很快人们意识到，组织因其对可见光的扭曲、散射与吸收而成为成像的屏障。因此，荧光图像难以检测，且还存在光毒性与信号损失等其他挑战。为克服这些问题，多光子显微镜已被成功应用于活体成像——这是因为该方法使用特定荧光团被低能红外光激发，从而避免了与可见光吸收相关的上述问题。根据肿瘤部位、实验设计与组织厚度，IVT 可用于实现良好对比度的高分辨率成像。该过程的另一个优点是红外光能够产生额外的无标记信号，即二次谐波产生（second harmonic generation, SHG），借此可以测定分子结构的额外特征，包括 I 型胶原纤维 [34]。最后，还可能发生三次谐波产生（THG），从而使某些在不同折射率界面处的结构也可被可视化，包括水环境中的脂质体。尽管多光子激发能够检测到位于体内一定深度的信号，但大多数部位仍因其所处深度而无法成像。为规避这一问题，可以通过手术暴露肿瘤，在约 40 小时的时间窗内对肿瘤细胞的迁移行为进行成像。为进一步延长此类肿瘤行为的成像时间，可以在动物身上建立活体窗口，使成像可在较长时间内（可达数年）进行，这已在脑、乳腺以及腹部器官等部位实现。因此，已可以在原始部位、生理条件下研究癌细胞，并描述了多种癌症类型的迁移行为；然而，此类实验装置需要昂贵的成像设备与设施、动物设施，并且鉴于此类侵入性操作中动物使用所涉及的伦理问题，应慎重考虑。此类工作的一个示例是 Beerling 等人 [35] 所描述的对胰腺癌细胞迁移行为的研究。尽管这些细胞被认为具有高度侵袭性与运动性，但研究显示只有一小部分肿瘤细胞能够从肿瘤叶迁移出去，并采用了与其他体内小鼠模型中所观察到的相似的迁移策略。研究结果表明，从集体流动到单细胞迁移的各种迁移模式依赖于微环境。因此，可以推断微环境会影响细胞的迁移能力，并可能成为确定癌细胞迁移关键调控因子的一种新途径，而这些关键调控因子可用于靶向细胞迁移与癌症的扩散。

本章个人批注

本章由 A. Brüning-Richardson 与 S. E. Lawler 合写，是一本方法学导向章节，结构很"教科书式"——前 4 节（Cell Migration Assays / 2D Random Cell Migration / Invasion in 3D / In Vivo Imaging）大体按"维度递进"的逻辑组织：先讲 2D 平面上的随机迁移（划痕、Transwell、纳米纤维），再讲 3D 球体与基质中的侵袭（球体、类器官、组织切片），最后讲活体成像（IVM、多光子、活体窗口）。这种"2D → 3D → in vivo"的递进结构其实在第 5 章讲癌细胞迁移模式时（间充质、变形虫样、集体）就埋下了伏笔——本章本质上是把第 5 章讲的"模式"翻译成"用什么实验看得到"。作者很清楚地区分了"speed / directionality / chemotaxis / invasion"四种科学问题（开篇 1 节就明说），然后在每一节里提供"那种科学问题对应哪种实验方案"的回答。这种"问题驱动"的方法学结构在生物医学方法学书中很典型，但在写作上意味着本章的"内容点"密度并不均匀——第 1 节有大段细胞培养史（Harrison、HeLa、M199、类器官），2.x 节是大量"如何做"的具体步骤（细胞数、孔板、试剂浓度、时间点），3.x 节是 3D 检测的具体 protocol，4 节则是 IVM 的原理性介绍——读者拿到的是"实验方案 + 一些历史注脚 + 一些原理"混合体，而不是一条统一的论证链。

我读到这章最值得反思的几点：第一，作者把 HeLa 细胞的伦理故事专门写进了"方法学"章节——这其实是比较少见的处理。大部分方法学章节只讲 protocol，但本章开篇用将近一页篇幅讲 Harrison 的青蛙淋巴、HeLa 与 Henrietta Lacks 的知情同意问题、Morgan 的 M199。这种"伦理史 + 技术史"的并置可能是本书编辑（Brüning-Richardson & Knipp）的取向——把方法学的合法性建立在知情同意与患者权益的基础上，而不仅仅是"我能用什么细胞"。第二，划痕检测中作者特别强调"伤口愈合 ≠ 细胞迁移"——间隙百分比变化里混着细胞增殖、ECM 角色、细胞损伤与位移等多个非迁移变量。作者没有把划痕检测当作"金标准"，而是明确列出其局限性，并通过"压印/液滴/微流控/电刺激/激光消融"等替代造伤方式来回应这些不确定性——这种"老方法有边界、新方法补足"的写作很有方法学教科书的精神。第三，IVM 部分作者把单光子/多光子/二次谐波产生/三次谐波产生/活体窗口一连串技术串起来，并以 Beerling 等关于胰腺癌的工作作为具体例子（胰腺癌被认为侵袭性强、但活体观察发现只有小比例细胞能迁出）——这个例子本身是一个值得记住的实证发现："侵袭性"在体外与体内的表现可能不一致，因为微环境本身对迁移能力有调节作用。

本章在全书中的定位承接第 6 章末尾的"分子机制注脚"（actin、focal adhesion、myosin II），把"用什么方法看到这些分子"这一问题系统化；也为第 9 章（高分辨率成像）与第 14 章（活体模型）这两章方法学更专门化的展开做了铺垫。从全书的连贯性看，本章是"方法学章节组"的入口——但与第 6 章那种"建模 + 分子"双重侧重不同，本章是纯方法学，没有任何建模成分，建模相关的内容被完全留给了第 10 章与第 15 章。

与上下章的衔接（一段话）

本章在全书结构中是"方法学章节组"的入口——上承第 6 章末尾（6.1–6.4 节）关于 actin 动力学、lamellipodia/filopodia、黏着斑形成与拆解、myosin II 的分子机制注脚，但视角从"分子机器"切换到"实验装置"：用什么样的细胞、什么样的皿、什么样的膜、什么样的成像系统，能够在体外或体内观察到这些分子所驱动的迁移行为。这一方法学视角的转向，标志着全书从"按生理/病理语境"组织（第 1–5 章：发育、伤口愈合、免疫、癌症、生物物理与生化基础）切换到"按方法学"组织（第 7、9、10、11、14、15 章）的开始。从内部结构看，本章也建立了一种"2D → 3D → in vivo"的递进节奏：2D 维度关注速度、方向性、趋化（划痕、Transwell、纳米纤维），3D 维度引入球体、类器官、组织切片，以更接近原始组织/肿瘤结构的方式重现侵袭，in vivo 维度则把迁移行为放回原始微环境中观察。这一递进既回应了第 5 章关于癌细胞迁移模式（间充质、变形虫样、集体）的分类（不同模式需要不同维度的实验），也为后续方法学专门章节做了铺垫——第 9 章专门讨论高分辨率成像在体外研究中的应用、第 10 章转向计算建模、第 11 章讨论软件分析、第 14 章专门讨论 in vivo 模型、第 15 章专门讨论免疫细胞响应的数学建模。本章在全书"方法学链条"中的位置是"全景式概览"——既不是某一专门技术的深度展开，也不引入任何计算成分，而是把整套方法学词汇铺陈一遍，为读者进入后续专门章节做铺垫。从内容厚度上看，本章是"方法学 + 历史 + 伦理"的混合体——这是 edited volume 在方法学入门章节中一种常见的处理方式，让读者既能上手实验，也能理解方法的来源与边界。