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Chapter 7

作者

A. Brüning-Richardson — Department of Biological and Geographical Sciences, University of Huddersfield, UK. Email: a.bruning-richardson@hud.ac.uk S. E. Lawler — Department of Pathology and Laboratory Medicine, Brown University, Providence, RI, USA

本章第一作者 Brüning-Richardson 是 Ch 1/3/5 作者,本卷共同编辑;第二作者 Lawler 是 Brown University 病理学家,合作研究 GBM。Springer Nature 2024,DOI: 10.1007/978-3-031-64532-7_7。

内容概述

本章是 Part II "Methods to Investigate Cell Migration" 的第二章(Ch 6 是建模基础,Ch 7 是实验方法),系统综述 2D/3D/in vivo 的细胞迁移检测方法。结构: (1) 细胞培养简史 — Ross Granville Harrison 1907 首次建立体外组织培养(蛙胚胎组织 + 淋巴 + 无菌技术);Henrietta Lacks 1951 HeLa 细胞(首个永生化人源细胞,无知情同意引发的伦理争议至今,促美国患者同意法律改革);现代从"血清+已建系"转向"无血清+患者原代+干细胞样培养";M199 是首个合成培养基(Morgan 1918-1976);3D 培养演进:spinner/hanging drop/low adherence → 球体 → 类器官(Lancaster 2013 Nature "mini-brains" [X1]) → 脑肿瘤类器官(Bian 2018 Nat Methods [X2]) → 3D 生物打印整器官。 (2) 2D Random Cell Migration — sub-confluent 接种 + live cell imaging(72 h 30-min 间隔,Brüning-Richardson 团队用 BioStation IM-Q/Incucyte/HoloMonitor)+ 分析软件(ImageJ + Tracker plugIn, Ibidi 工具, Volocity, Incucyte)测量速度/方向/距离,绘制 rose plots。 (3) 2.1 Scratch Assay — 24 well 80-90% 单层 + p200 pipette tip 划痕 + 0/4/8/24 h 成像 + ImageJ 测量 gap 面积变化,变体包括 stamp/thermal/laser/electrical 创口;但 scratch 不区分 proliferation vs migration(需 mitomycin C 排除),ECM 受扰动。 (4) 2.2 Transwell Assay — porous membrane insert + 上下室 chemoattractant 梯度 + 4-6 h migration + 1% glutaraldehyde 固定 + DAPI 染色 + 计数,变体 Matrigel 涂层(模拟 ECM 入侵);便宜简单,但仅单细胞 + 生理相关性弱。 (5) 2.3 Nanofiber Assay — Spheroid (agarose 板或 hanging drop) + 接种到 aligned nanofiber 板(模拟神经轴突) + 荧光 live cell tracker 监测迁移;变体:非 aligned(随机)vs aligned(神经 track);用于 GBM "沿神经纤维迁移"研究;成本高(nanofiber 板 + spheroid 制备)。 (6) 3.1 3D Invasion Assay — spheroid + collagen/Matrigel/PeptiGel/hydrogel 嵌入 + 30 min 聚合 + daily imaging × 72 h + 测量 migration index (MI),可用 confocal/IF 进一步表征细胞骨架;变体:natural ECM (collagen) vs synthetic (PeptiGel)。 (7) 3.2 Organoids and Organs-on-Chip — iPSC 或原代细胞 + Matrigel dome + 1 周 + 特定生长因子诱导分化;类器官高仿原始组织,但耗时贵;organ-on-a-chip + 微流控可连续供养,适合药物筛选。 (8) 3.3 Tissue Slice Invasion Model — 脑组织 4°C 储存 24h + 切 0.25-0.5 cm 块 + 3% agar 包埋 + Leica vibratome 切 250 μm 切片 + 培养 + 接种 GBM spheroid + 10% formalin 固定 + IHC 制备 + 石蜡切片;真实组织架构 + 适合药物 pharmacotyping。 (9) 4 In Vivo Imaging — MRI/PET(非侵入)+ luminescence/fluorescence(全生物体)+ Intravital Microscopy (IVM, 外科暴露, 40 h 窗口)+ multiphoton(红外光深穿透, 避光散射)+ SHG/THG(无标记 collagen I + 脂质);intravital windows(脑/乳腺/腹腔)允许长期成像;Beerling 2016 胰腺癌 IVM 显示仅小部分肿瘤细胞迁移(挑战"高侵袭性"假设)。Take-Home: 研究问题决定方法;2D 用于速度/方向/外部信号响应;3D 用于 invasion;in vivo 用于生理验证。

核心方程与概念

  • 2D random cell migration 的输出参数化: $\(v_{\text{avg}} = \frac{1}{T}\sum_{t=0}^{T} v(t), \quad v(t) = \frac{|\mathbf{r}(t+\Delta t) - \mathbf{r}(t)|}{\Delta t}\)$ $\(d_{\text{total}} = \sum_{i} |\Delta \mathbf{r}_i| \quad \text{(标量)}\)$ $\(D = \frac{d_{\text{end-to-end}}^2}{4T} \quad \text{(持续性 diffusion 系数)}\)$ $\(\text{directionality} = \frac{d_{\text{end-to-end}}}{d_{\text{total}}} \in [0, 1]\)$ directionality = 1 表示完美直线,0 表示随机游走。

  • Scratch wound closure 的"双因素混淆"方程: $\(A_{\text{gap}}(t) = A_0 - (k_m \cdot \text{migration} + k_p \cdot \text{proliferation})\)$ mitomycin C 抑制 proliferation: $\(A_{\text{gap}}(t) |_{\text{mitoC}} = A_0 - k_m \cdot \text{migration}\)$ 由此可分离"迁移"与"增殖"对 gap 闭合的贡献。

  • Transwell 迁移的"化学趋化指数": $\(\text{MI} = \frac{N_{\text{migrated to lower chamber}}}{N_{\text{total input}}} \times 100\%\)$ 标准化为 % control(对照 = 100%),变体: Matrigel 涂层 → invasion index。

  • Nanofiber 迁移的"alignment index": $\(A = \left|\left\langle \cos(2(\theta_i - \theta_{\text{fiber}}))\right\rangle\right|\)$ θ_i 是细胞-纤维夹角, A = 1 表示完全沿纤维, A = 0 表示随机。

  • 3D spheroid 迁移的"migration index" (Cockle 2015 [X3]): $\(\text{MI} = \frac{R_{\text{outward}} - R_0}{R_0}\)$ R_outward 是 t 时刻最远细胞离 spheroid 中心的距离, R_0 是初始 spheroid 半径。

  • 3D spheroid 内部的结构梯度(Ch 3 也涉及): $\(r < r_1: \text{necrotic core (低氧)}\)$ $\(r_1 < r < r_2: \text{quiescent cells}\)$ $\(r > r_2: \text{proliferating rim}\)$ 3D 球体自然模拟肿瘤的"内-中-外"结构梯度。

  • HeLa 细胞的关键时间点(伦理反思节点):

  • 1951 年 Henrietta Lacks 子宫颈癌活检 → George Gey 培养成 HeLa
  • 1952 年起用于 Jonas Salk 脊髓灰质炎疫苗生产
  • 1980s-90s 用于 HIV 生命周期研究
  • 2013 年 NIH 与 Lacks 家族达成 HeLa 基因组使用协议
  • 2020 年 Nature 社论"科学必须纠正历史错误"

  • 伦理含义: 商业化 HeLa 已有 >70,000 篇论文,但原始组织获取无知情同意。

  • Intravital Window 的"时间-分辨率-深度"权衡: $\(\text{depth} \uparrow \Leftrightarrow \text{resolution} \downarrow \quad \text{(Beer-Lambert)}\)$ $\(\text{multiphoton IR (700-1100 nm)} \to \text{penetration 1-2 mm, 低散射}\)$ $\(\text{confocal visible (400-700 nm)} \to \text{penetration 100-200 μm, 高散射}\)$ $\(\text{intravital window} \to \text{持续成像(数月-数年)}\)$

  • Multiphoton SHG/THG 的"无标记成像"分子机制: $\(\text{SHG} = \omega + \omega = 2\omega \quad \text{(second harmonic, 非中心对称结构如 collagen I)}\)$ $\(\text{THG} = \omega + \omega + \omega = 3\omega \quad \text{(third harmonic, 界面如脂滴/水)}\)$ 这提供了无标记 ECM + 脂质的成像能力,优于传统荧光标记。

  • Brüning-Richardson 团队 GBM 迁移实验设计模式: $\(\text{细胞选择} \to \text{inhibitor 处理} \to \text{2D scratch} \to \text{3D invasion} \to \text{migration index} \to \text{IHC 验证}\)$ 这是典型的"机制 → 表型 → 验证"三步研究流程,适合药物筛选。

关键结论

  • 方法选择由研究问题决定,不是"哪个方法最好":
  • 速度/方向 → 2D random migration
  • 集体性/伤口 → 2D scratch
  • 化学趋化/单细胞 invasion → 2D transwell
  • 沿通道/接触引导 → 2D nanofiber
  • 3D invasion/MI → 3D spheroid
  • 体内药物反应 → 3D organoid / organ-on-chip
  • 真实微环境 → tissue slice

  • 体内动态 → IVM / multiphoton

  • 2D scratch 的"经典地位 + 经典局限":便宜简单,但无法区分迁移与增殖,且 ECM 受创口扰动。Mitomycin C 是标准对照,但其本身有细胞毒性可能干扰迁移。Riahi 2012 综述了 stamp/thermal/laser/electrical 改进方案,各有利弊。

  • Transwell 是"金标准"但过于简化:仅单细胞迁移评估,无法观察形态变化、无法实时成像。Matrigel 涂层是入侵性变体,模拟 ECM。

  • Nanofiber 板是"contact guidance"研究的关键工具:模拟神经纤维,GBM 沿 nanofiber 迁移的距离和方向性是临床相关指标。Johnson 2009、Rao 2013、Agudelo-Garcia 2011 等多个团队用此方法发现STAT3 信号通路是 nanofiber 介导迁移的必需。

  • 3D 球体 + 胶原的 invasion 指数 (MI) 是临床前金标准:Cockle 2015 [X3] 量化方法已被多个 GBM 研究采用,Brüning-Richardson 团队的"Patient-derived glioma spheroid in collagen" 是经典实验设计。Migration index 对药物反应敏感,适合高通量筛选。

  • 类器官(Lancaster 2013)开启"脑肿瘤类器官"时代:Bian 2018 Nat Methods [X2] 在脑类器官中基因操作诱导 GBM,模拟脑肿瘤在脑组织中的发生和迁移。这为"肿瘤 + 微环境"研究提供新平台。

  • Tissue slice invasion model 是"近生理"的 3D 模型:脑组织切片 + GBM 球体共培养,允许肿瘤在真实神经元/胶质/血管微环境中迁移。Spennati 2021 [X4] 和 Braun 2021 [X5] 是经典方法论。

  • Intravital microscopy 的"40 h 窗口"是核心限制:Beerling 2016 胰腺癌 IVM 显示仅小部分肿瘤细胞实际迁移,挑战"高侵袭性"假设。这种"原位观察"是唯一能证伪体外假设的方法。

  • Multiphoton IR 是 in vivo 深层成像的核心技术:用 700-1100 nm 红外光 + 双光子激发,可达 1-2 mm 深度,远超过共聚焦的 100-200 μm。SHG 可无标记观察 collagen I 纤维,THG 观察脂质界面,这是ECM 重塑 + 脂代谢研究的关键工具。

  • HeLa 的伦理故事提醒了"知情同意"在生物医学中的核心地位:Henrietta Lacks 1951 年无同意 → 2020 年 Nature 社论道歉 → 现代 IRB 系统。"如何负责任地使用生物样本"是科学伦理的永恒主题。

  • HoloMonitor 是"无标记 + 自动化"的新平台:基于数字全息成像,无需荧光标记,可长时间追踪细胞形态变化,适合"形态动力学"研究。

挑战和开放性问题

  1. 2D vs 3D vs in vivo 数据"翻译损失":2D 筛选的"hit compound"在 3D 失效率高(可能 >50%),in vivo 又失效率高。如何设计 2D/3D/in vivo 联级筛选减少损失?
  2. Mitomycin C 的"二次效应":Mitomycin C 不仅抑制增殖,还可能改变细胞代谢/信号/迁移本身。是否有更好的"无增殖对照"策略(例如使用丝裂霉素后的"细胞周期同步化"细胞)?
  3. Spheroid 制备的异质性:不同厂商的 low-adherence plate 制备的 spheroid 大小/形态/细胞组成差异显著,标准化困难。Corning/Nunc 等品牌有差异。
  4. Nanofiber 板的"标准化问题":不同厂商的 nanofiber 直径/间距/化学修饰不同,跨研究比较困难。
  5. 类器官的"成熟度"和"批次差异":iPSC 衍生的脑类器官需要数月培养,批次间分化程度差异大,实验可重复性是核心挑战。
  6. Tissue slice 的"活力窗口":脑组织切片在体外可维持 24-48 h(部分长达 1 周),但长时间培养的细胞死亡和代谢紊乱难以避免。
  7. Intravital window 的"伦理和成本":IVM 涉及动物外科手术 + 长期成像,伦理审批严格 + 设备昂贵。如何在小动物上实现多器官 + 多时间的 in vivo 迁移追踪?
  8. 3D invasion 的"形态学 vs 分子机制"鸿沟:Migration index 量化迁移距离,但不揭示分子机制(EMT?MAT?leader-follower?)。如何把形态量化与分子标记(IHC, IF)结合?
  9. HeLa 时代伦理的"现代延伸":现代 iPSC 类器官、患者原代细胞、PDX 模型都涉及知情同意和商业化,Henrietta Lacks 故事的"后裔"是更复杂的患者-研究者-商业-法律关系。
  10. Multiphoton 设备的"普惠化":Multiphoton 系统单台 >$1M,集中在大型研究中心,中小实验室难以承担。

个人反思与批判性分析

1. 章节是"实验手册式"的实用指南 — Brüning-Richardson & Lawler 的章节是典型的"how-to"格式: - 每种方法给出具体步骤(细胞数、试剂浓度、时间点、成像倍数) - 引用团队自己的实验数据(GBM U251, U87, patient-derived) - 引用品牌(Nunc, Ibidi, HoloMonitor, BioStation) - 提供 protocol 引用

这种格式对直接复用方法到新项目非常友好,但对理解方法学局限相对薄弱——读者容易"按部就班"而不问"为什么"。

2. 章节对GBM 研究有强烈偏好 — Brüning-Richardson 团队的专长是 GBM 迁移,所有方法例子几乎都是 GBM (U251, U87, patient-derived)。这与 Ch 5 的 EMT/MAT 也是 GBM-focused 一致——整个 Part II 方法学章节都偏向肿瘤/GBM,对发育生物学/免疫学的迁移方法涉及较少。 对本人研究而言,这种"GBM 中心"视角需要"翻译"到血管 SMC/内皮细胞模型。

3. 方法之间的"层次感"清晰但"标准化"缺失: - 2D scratch → 2D transwell → 2D nanofiber → 3D invasion → organoid → tissue slice → in vivo IVM 是一个从简到繁的递进 - 但各方法之间的"数据可比性"差:scratch 的"gap closure %"和 IVM 的"single cell track"难以直接对比 - 缺乏"统一量化指标":如建议以"migrated distance per hour"或"speed distribution"作为通用指标

4. Intravital imaging 的"40 h 窗口"是核心限制: - Beerling 2016 胰腺癌 IVM 揭示仅小部分细胞迁移的发现是挑战体外假设的关键证据 - 这提示"高侵袭性"细胞可能实际上大部分时间不迁移——只在外界条件变化时才激活 - 这与 Ch 1/2/5 的"持续迁移"叙述形成对比 - 临床含义:抗转移药物可能需要"持续给药"而非"短时高剂量"

5. Multiphysics 视角的缺失 — 章节对力学-化学耦合的方法几乎未涉及: - 3D invasion 在不同刚度的基质中差异显著(Ch 5 提到 Wei 2015 Twist-G3BP2 刚度-EMT 耦合),但章节未给出"用可变刚度水凝胶做 invasion assay"的方法 - 缺乏microfluidics + 力学刺激(剪切应力、循环拉伸) + 3D 培养的组合方法 - 缺乏AFM(原子力显微镜)+ 细胞迁移的力学-迁移研究方法 - 这是力学-生物学的交叉缺口

6. 章节的"伦理反思"启发: - HeLa 故事不仅是历史,也是"生物样本商业化"的现代议题 - 类器官、PDX、iPSC 都涉及患者组织 → 商业产品的转化,Lacks 家族的权益争议(2013 NIH 协议)是新范式 - 中国 2019 年通过的《人类遗传资源管理条例》是平行立法 - 本人做血管研究,涉及"血管组织样本"获取时也应严格遵守

7. 与本人血管生物力学研究的具体连接: - 3D spheroid invasion assay与本人研究的"血管壁多层结构"(内皮 + 内弹力层 + 中膜 + 外弹力层 + 外膜)有结构同源性——可设计"3D 血管壁模型 + SMC 球体嵌入"实验 - Nanofiber 板可模拟血管弹性层/胶原层结构,VSMC 沿 nanofiber 迁移的实验范式可直接借用 - Tissue slice invasion model可应用于人/动物血管切片,研究 VSMC 在血管微环境中的迁移 - Multiphoton + SHG 可直接观察血管壁 collagen I + elastin 的 3D 结构,与 IVM 联用可获得"细胞-ECM"互作 in vivo 数据 - Microfluidics + 血管芯片(organ-on-chip 的变体)是本人研究"血管微流控 + 内皮响应"的直接相关平台 - Mitomycin C 排除增殖的策略可在"VSMC 增殖 vs 迁移"研究中直接应用

8. 章节引用与文献覆盖: - 主要文献覆盖至 2022 年 - 关键 reference 出现频繁: Cockle 2015 X3, Lancaster 2013 X1, Bian 2018 X2, Beerling 2016(IVM 胰腺癌) - 缺少对单细胞 + 实时成像新近方法(2018+ 自动化活细胞分析,如 cellpose, deep learning segmentation)的引用 - 缺少对机器学习辅助细胞追踪的引用

9. 章节的"产业化偏向": - 章节中提到的"主要品牌"几乎都是欧美厂商(Ibidi, Essen BioScience, Nikon BioStation, Volocity, PeptiGel) - 中国/亚洲厂商(华大智造, BGI, 苏州锐博)未被提及 - 对实验室"DIY 方法"提及较少

10. 章节的"数学-生物桥梁"缺失: - 本章纯实验方法,无任何数学/统计内容 - 量化指标(MI, speed, directionality)仅是简单算术,无统计显著性检验的讨论 - 与 Ch 6(SPP 模型)形成鲜明对比——"实验 vs 建模"两个章节彼此独立,缺乏"如何用模型预测实验结果"的桥梁 - 这是Part II 的整体结构性缺陷

重要参考文献

[X1] Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, Homfray T, Penninger JM, Jackson AP, Knoblich JA. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 2013;501(7467):373-9. doi:10.1038/nature12517. PMID: 23995685 [X2] Bian S, Repic M, Guo Z, Kavirayani A, Burkard T, Bagley JA, Krauditsch C, Knoblich JA. Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation. Nat Methods 2018;15(8):631-9. doi:10.1038/s41592-018-0070-7. PMID: 30038414 [X3] Cockle JV, Picton S, Levesley J, Ilett E, Carcaboso AM, Short S, Steel LP, Melcher A, Lawler SE, Brüning-Richardson A. Cell migration in paediatric glioma, characterisation and potential therapeutic targeting. Br J Cancer 2015;112(4):693-703. doi:10.1038/bjc.2015.16. PMID: 25628092 [X4] Spennati G, Horowitz LF, McGarry DJ, Rudzka DA, Armstrong G, Olson MF, Folch A, Yin H. Organotypic platform for studying cancer cell metastasis. Exp Cell Res 2021;401(2):112527. doi:10.1016/j.yexcr.2021.112527. PMID: 33675807 [X5] Braun R, Lapshyna O, Eckelmann S, Honselmann K, Bolm L, Ten Winkel M, Deichmann S, Schilling O, Kruse C, Keck T, Wellner U, Bronsert P, Brandenburger M. Organotypic slice cultures as preclinical models of tumor microenvironment in primary pancreatic cancer and metastasis. J Vis Exp 2021;(172). doi:10.3791/62541. PMID: 34251366 [X6] Abercrombie M. Ross Granville Harrison, 1870-1959. Biogr Mems Fell R Soc 1961;7:110-26. doi:10.1098/rsbm.1961.0009 [X7] Beerling E, Oosterom I, Voest E, Lolkema M, van Rheenen J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital 2016;5(3):e1261773. doi:10.1080/21659087.2016.1261773. PMID: 28243522 [X8] Suijkerbuijk SJE, van Rheenen J. From good to bad: Intravital imaging of the hijack of physiological processes by cancer cells. Dev Biol 2017;428(2):328-37. doi:10.1016/j.ydbio.2017.04.015. PMID: 28473106 [X9] Riahi R, Yang Y, Zhang DD, Wong PK. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom 2012;17(1):59-65. doi:10.1177/2211068211426550. PMID: 22357609 [X10] Marshall J. Transwell® invasion assays. Methods Mol Biol 2011;769:97-110. doi:10.1007/978-1-61779-207-6_8. PMID: 21748672 [X11] Johnson J, Nowicki MO, Lee CH, Chiocca EA, Viapiano MS, Lawler SE, Lannutti JJ. Quantitative analysis of complex glioma cell migration on electrospun polycaprolactone using time-lapse microscopy. Tissue Eng Part C Methods 2009;15(4):531-40. doi:10.1089/ten.TEC.2008.0486. PMID: 19199562 [X12] Agudelo-Garcia PA, De Jesus JK, Williams SP, Nowicki MO, Chiocca EA, Liyanarachchi S, Li PK, Lannutti JJ, Johnson JK, Lawler SE, Viapiano MS. Glioma cell migration on three-dimensional nanofiber scaffolds is regulated by substrate topography and abolished by inhibition of STAT3 signaling. Neoplasia 2011;13(9):831-40. doi:10.1593/neo.11612. PMID: 21969816 [X13] Collins TJ. ImageJ for microscopy. Biotechniques 2007;43(1 Suppl):25-30. doi:10.2144/000112517. PMID: 17936939 [X14] Cary LA, Han DC, Guan JL. Integrin-mediated signal transduction pathways. Histol Histopathol 1999;14(3):1001-9. (Integrin signaling in adhesion context) [X15] Harmer J, Struve N, Brüning-Richardson A. Characterization of the effects of migrastatic inhibitors on 3D tumor spheroid invasion by high-resolution confocal microscopy. J Vis Exp 2019;(151). doi:10.3791/60273. PMID: 31566595