第 5 章：癌症中的细胞迁移；2D 与 3D 中的细胞迁移（Cell Migration in Cancer; Cell Migration in 2D and 3D）
5.1 肿瘤细胞迁移的机制与上皮-间充质转化（Mechanisms of Tumour Cell Migration and EMT）
本章由 A. Brüning-Richardson 和 C. Kirby（哈德斯菲尔德大学生物与地理科学系）撰写。作者开宗明义指出：癌症的核心特征之一是单个肿瘤细胞能够迁移——它们从原发肿瘤脱离、获得运动能力、并转移到远端部位，这一能力是肿瘤进展的中心环节，也是肿瘤扩散进入转移阶段的关键。癌细胞主要采用三种迁移模式：(a) 间充质（mesenchymal，爬行）迁移——由间充质来源的细胞或已经发生间充质表型转换的细胞所采用；(b) 变形虫样（amoeboid）迁移——通常由白细胞和胚胎祖细胞展示；(c) 集体细胞迁移（collective cell migration）——保留细胞-细胞连接的上皮细胞作为多细胞群协调运动。重要的是，这三种模式具有可塑性（plastic），并非固定，迁移中的肿瘤细胞会根据外部或内部条件的变化在不同模式间切换。
上皮-间充质转化（EMT）是一个高度保守的过程，分子层面的改变使极化的、不动的上皮细胞通过失去紧密连接（tight junctions）和细胞粘附而改变其极性，并转变为可迁移的间充质细胞。这种形态变化在源文图 1 中得到直观展示：上皮细胞呈现顶端-基底极性（apical-basal polarity），即顶端膜（朝向腔道或表面的膜）与基底外侧膜（basolateral membrane）在位置、结构和组成上不同，并通过紧密连接（也称 zonula occludens）分隔。紧密连接不仅是相邻细胞膜之间的屏障、调节细胞间物质扩散，还决定顶端与基底外侧膜的组成，因而在细胞极性的确立中同样关键；丧失紧密连接即意味着上皮细胞无法维持分隔区室并丧失极性。EMT 在胚胎发育中扮演关键角色，是原肠胚形成（gastrulation，胚胎从一维上皮层 blastula 转变为多层多维结构的 gastrula）、神经嵴细胞形成（从神经管迁移到胚胎各处分化为周围神经系统并促成其他组织）、心脏/肌肉骨骼系统及颅面结构形成等发育过程的必要环节。侵袭性、转移性癌细胞中观察到类似过程，提示肿瘤细胞利用了发育期的 EMT 程序来实现转移扩散：上皮来源的肿瘤细胞由此获得侵袭和迁移表型，离开原发位点并建立远处病灶。细胞-细胞间相互作用由 E-cadherin 等粘附分子介导——它存在于紧密连接、粘附带（adherens junctions）、桥粒（desmosomes）和间隙连接（gap junctions）中；catenin 等胞质蛋白连接 E-cadherin 复合物到肌动蛋白细胞骨架。EMT 导致上皮连接蛋白编码基因被下调，使连接被拆解、上皮完整性被削弱、顶端-基底极性丧失；与此同时，间充质基因（如 N-cadherin、fibronectin 和 vimentin）被上调，细胞获得迁移和侵袭表型。Scribble 极性蛋白被报道通过稳定 E-cadherin 与 catenin 的耦合参与调节上皮细胞粘附和迁移，耗竭 Scrib 会破坏 MDCK 上皮细胞的 E-cadherin 介导的细胞-细胞粘附，提示 E-cadherin 经 Scrib 调控起到肿瘤和侵袭抑制因子的作用。要离开原发肿瘤进入周围结缔组织基质，细胞必须借助基质金属蛋白酶（MMPs）的蛋白水解消化基底膜；进入血管的过程称为 intravasation，部分循环肿瘤细胞和小细胞簇存活下来后通过 extravasation 离开血管进入远端器官；这些播散的肿瘤细胞最终可经历反向的间充质-上皮转化（MET），从而在远处重新增殖形成转移灶。源文图 2 展示了上皮卵巢癌细胞 1847 在亚汇合度下显示部分 EMT，并通过 Bio-Indirubin 处理使 EMT 发生逆转。
EMT 发生在胚胎正常发育期，因此发育期相关的信号通路很可能参与了肿瘤细胞运动性和侵袭性的增强。多个进化保守的信号通路参与 EMT：TGF-β 介导一系列涉及分化、增殖及细胞/组织特异性运动控制的信号功能；Wnt 信号通路在胚胎形态建成中起作用，其失调与人类多种疾病强相关；Notch 通路调控胚胎中的细胞增殖、命运决定、分化与死亡，通过与 Delta（人称 Delta-like）和 Serrate（人称 Jagged）等跨膜配体相互作用转导短程信号。此外，EGF、FGF 等通过受体酪氨酸激酶发挥作用的生长因子也是细胞-细胞通讯信号转导途径的关键组分，在细胞生长、分化、代谢和运动中扮演重要角色。TGF-β 是 EMT 的强效刺激因子，由肿瘤细胞及肿瘤周围基质中的成纤维细胞（即肿瘤微环境）分泌。缺氧（hypoxia，氧化应激）也起重要作用——肿瘤块中血液供应不足导致缺氧，缺氧引起转录因子 HIF-1α 过表达进而刺激 EMT；研究显示缺氧或 HIF-1α 通过直接结合 Twist 基因近端启动子中的缺氧反应元件（HRE）调控 Twist 表达。炎症细胞因子（如肿瘤相关巨噬细胞 TAMS 分泌的 TNFα）激活主要的炎症转录因子 NF-κB 通路，使得炎症与 EMT 之间存在相似性；HIF-1α 与 NF-κB 之间存在串扰（crosstalk）——炎症激活 HIF、缺氧调节 NF-κB。密集胶原纤维使 ECM 硬度增加，与乳腺癌不良预后相关；尽管机械信号如何转化为转录因子改变尚未完全清楚，但 Twist 已被识别在力转导中起作用，促成 EMT。源文指出，该清单虽不完整但涵盖了参与刺激 EMT 的主要候选通路。
细胞对多种胞外和胞内信号作出反应的方式之一称为转录调控；癌症以转录失调为特征，因为多数信号通路最终作用于转录机器。已被识别的 EMT 分子开关包括转录因子 Snail、Slug（Snail 2）、Twist 和 Zeb，它们均下调 E-cadherin 表达、诱导 EMT 并促进肿瘤侵袭。Snail 家族转录抑制因子具有相似结构和特定的锌指序列，可与靶基因启动子区的 E-box 增强子盒结合；Snail 可通过与抑制蛋白相互作用或与表观遗传重塑复合物相互作用来改变 E-cadherin 基因（CDH1）表达，从而降低 CDH1 转录；E-cadherin 表达下调与上皮细胞迁移和侵袭性质相关，可与肿瘤分级和分期关联。Slug 也被表征为强 E-cadherin 抑制因子和主要 EMT 诱导因子，与远端肿瘤转移相关；Slug 与另一个转录调控因子 Twist 协同促进 EMT 和转移——Slug 介导 Twist 诱导的 EMT、Twist 是 Slug 诱导 EMT 抑制所必需。Twist 也属于进化保守的碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）家族，在胚胎发育和肿瘤转移中起关键作用；与 Snail 类似，Twist 与 E-cadherin 基因启动子区 E-box 元件结合抑制其活性、减少 E-cadherin 转录；后续 EMT 诱导增强了肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移。Twist 已在乳腺癌、肺癌和前列腺癌等多种侵袭性癌症中被报道。在 Snail 和 Slug 可能在肿瘤扩散不同阶段各自扮演不同但重要角色——包括肿瘤细胞扩散、内渗、远端运输、外渗或适应已定居肿瘤细胞生长等过程。TGF-β 信号分子家族被提出在 EMT 细胞迁移中起作用，涉及多个 EMT 相关转录因子的上调包括 Snail 和 Slug；TGF-β 依赖的 Snail 和 Slug 激活被认为是互相排斥的——当 Snail 由 TGF-β 激活时 Slug 不被激活，反之亦然，且这种激活依赖于所涉及的上皮细胞类型。Zeb1（也称 δEF1）和 Zeb2（也称 Sip1）通过直接结合各种基因启动子中的 5′-CACCT 序列抑制转录；缺氧条件下 HIF-1α 依赖性的 E-cadherin 下调涉及 Zeb1/δEF1 和 Zeb2/Sip1，机制上据推测贡献于 von Hippel-Lindau（VHL）阴性肾透明细胞癌（RCC）的侵袭性。Zeb2/Sip1 也参与间充质标志物（包括 vimentin 和 N-cadherin）的上调；vimentin 是一种 III 型中间丝，正常表达于间充质来源细胞中，因此其表达增加指示 EMT。Snail 和 Zeb2/Sip1 不仅与 E-cadherin 抑制相关，还与加速癌症侵袭相关；MMP（负责 ECM 蛋白降解的酶）的表达增加与分化丧失、组织侵袭、转移及肿瘤复发相关。Snail/Zeb2/Sip1 在肝细胞癌（HCC）细胞系进展中的作用被认为源自对 E-cadherin 基因的转录抑制和对 MMP 基因家族的上调，从而促进肿瘤侵袭。
5.2 细胞迁移模式：间充质、变形虫样与集体（Modes of Cell Migration: Mesenchymal, Amoeboid, Collective）
细胞需要能够改变形状并与周围 ECM 相互作用才能获得运动能力。细胞骨架重组并适应周围 ECM 变化的能力决定了其迁移能力。影响细胞运动性的三个关键过程是：肌动蛋白动态、细胞-底物粘附和 ECM 重塑。细胞骨架由三种结构组成：(a) 微管——由 α-和 β-tubulin 蛋白组成；(b) 中间丝——包括 keratin、lamin、neurofilament、desmin 和 vimentin；(c) 微丝——细胞骨架最小组分，由肌动蛋白聚合物和相关肌动蛋白结合蛋白组成的动态网络，形成肌动蛋白细胞骨架。肌动蛋白细胞骨架可与 myosin 形成横桥产生力，导致细胞内运动并改变其形状；细胞形状变化可在细胞与周围环境相互作用时转化为运动。跨膜受体（如 integrin 和生长因子受体）聚簇并招募信号分子（如小 Rho GTPase 和激酶）以组装细胞与 ECM 的粘附连接，这些细胞粘附可提供摩擦力或牵引力以促进细胞运动；当细胞试图在其环境中移动时需要为 ECM 制造空间——MMP 能够消化和重塑 ECM。这些关键特征共同决定了细胞迁移的模式：单细胞可经间充质和变形虫样迁移；集体细胞迁移涉及完整细胞群。
间充质细胞迁移的特征是发育良好的细胞突起和细胞粘附。侵袭细胞呈细长纺锤形，与基质有很强的粘附并具有降解 ECM 的能力。细胞要能够移动必须附着于 ECM 并用前端向前移动、施力形成突起；细胞后部必须与 ECM 脱离以允许尾缘回缩，从而细胞向前移动。细胞通过重复的"突起和前端附着"循环继之以"后端脱离和回缩"循环而移动。肌动蛋白聚合在细胞前缘质膜下产生力推动质膜延伸，由 formin 等蛋白介导、由 Rac1 和 Cdc42 等小 Rho GTPase 家族调控；F-actin 从带刺端（barbed end）聚合，形成的肌动蛋白索为片状伪足区域提供支撑；回缩由 myosin 分子马达在细胞尾端拉动肌动蛋白丝所产生的收缩力驱动。间充质细胞迁移需要强烈的细胞粘附以及通过 integrin-细胞粘附实现的细胞与 ECM 的及时附着和脱离。间充质细胞迁移中发生两种细胞突起：丝状伪足（filopodia）和片状伪足（lamellipodia）。Filopodia 是细小的突起，延伸至细胞边缘之外，存在于成纤维细胞等迁移细胞的前缘或神经元等延伸长突起的细胞中，作用是伸展和感知靶点；肌动蛋白丝在 filopodia 中组织成平行束，可通过从聚合物后端持续释放单体以供前端循环使用来突出。Lamellipodia 是二维（2D）平面扇形突起，由分支状肌动蛋白组成，负责前缘推进所需的大推动力；它们还在细胞导航、感知和探测细胞环境中起作用。Lamellipodia 已在 2D 平面固体表面上培养的细胞中被广泛研究，但也在更接近生理条件的 3D 基质中迁移的细胞中被识别。
肌动蛋白聚合和 myosin 马达产生推动和收缩力，要将这些力转化为运动，细胞需要牵引力。牵引力由细胞粘附分子提供——它们赋予细胞对 ECM 的"抓握"以将能量转化为运动。这通常涉及与 integrin 家族细胞粘附受体的相互作用，根据 integrin 特异性与特定类型的 ECM 相互作用；cadherin 家族的细胞粘附受体介导细胞-细胞相互作用，整合素和钙粘蛋白粘附受体的胞内结构域均与肌动蛋白细胞骨架连接。肿瘤细胞中降解 ECM 的酶被上调和激活——间充质细胞在前缘招募 MMP 等蛋白酶促进 ECM 中运动；前缘表面 MMP 引起 ECM 蛋白水解降解，切割 collagen、fibronectin 和 laminin 等成分，局部 ECM 降解为迁移细胞创造物理化学路径。经历间充质迁移的肿瘤细胞通常来源于结缔组织肿瘤（如肉瘤），也可在 EMT 后来源于其他肿瘤类型。源文图 3 展示了胶质母细胞瘤细胞系 U251 显示间充质表型、Bio-Indirubin 处理可使间充质表型发生逆转。
低细胞粘附和/或高肌动球蛋白介导的收缩力的细胞对基质抓握较弱，可呈球形并采用变形虫样细胞迁移。变形虫样细胞迁移以单细胞生物变形虫（Dictyostelium discoideum）的运动类型命名。变形虫样细胞能够改变形状以穿过周围 ECM 中可窄至 3 μm 的间隙；运动迅速，细胞速度可达 2–30 μm/min。细胞膜与周围 ECM 之间存在间歇性相互作用或粘附，使细胞能够"爬行"或蠕动。变形虫样运动源自细胞细胞骨架变化产生的球形突起（称为 blebs），它们松散附着于 ECM。bleb 在细胞膜扩张和收缩时形成——这一过程不涉及肌动蛋白聚合（如间充质细胞迁移），而涉及肌动蛋白丝与非肌肉肌球蛋白 II（NMII）的横桥循环（即收缩性肌动球蛋白皮层）的收缩。在 bleb 形成过程中，质膜与肌动球蛋白皮层分离，NMII 在其中起关键作用；扩张后，收缩性肌动球蛋白皮层在膜下重新组装以实现 bleb 回缩；如有足够牵引力或与 ECM 的相互作用，回缩可推动细胞前进。变形虫样细胞迁移依赖于细胞改变形状并与底层 ECM 形成弱相互作用的能力；运动通过 ECM 不需要降解和重组，因此不依赖于 MMP 的蛋白水解；变形虫样运动不被 integrin 抑制所阻止，因此独立于细胞 integrin 粘附。变形虫样迁移的肿瘤细胞通常源自造血细胞（如白血病、淋巴瘤和小细胞肺癌）；然而变形虫样细胞迁移也可见于多种肿瘤中的细胞亚群。
在集体细胞迁移中，众多细胞可以作为群体一起移动，例如作为细胞片、细胞条或细胞簇。Friedl 等的研究显示 5 到 100 多个细胞的成簇细胞群可在 3D 胶原晶格中脱离原发肿瘤并迁移到邻近 ECM 中。细胞间的强连接对于细胞作为内聚群体移动是必需的。这种细胞迁移类型在胚胎发生、伤口愈合中很重要，也在癌细胞迁移中起作用。细胞保持层级结构和极性，具有明显的前缘前导和后缘尾随；据推测，前导细胞可感知并响应外部信号梯度迁移，相邻细胞因强细胞-细胞接触而跟随。这种细胞运动也依赖于肌动蛋白动态、integrin 依赖的 ECM 粘附和 MMP 介导的蛋白水解与周围 ECM 重塑。集体迁移存在于大多数上皮和间充质肿瘤类型中。
5.3 癌细胞迁移模式的转换与分子开关（Transition Between Migration Modes and the Molecular Switch）
癌症细胞中的迁移模式不是固定的，细胞可根据不同的环境挑战和线索从一种模式过渡到另一种。MAT（mesenchymal–amoeboid transition，间充质-变形虫样转化）解释了单个间充质癌细胞如何获得变形虫样特征并通过周围 ECM 的狭窄空间迁移，从而促进肿瘤细胞转移。从一种迁移模式到另一种的转变由跨膜受体（如 integrin 和生长因子受体）的激活引发；这些受体招募胞内信号分子（如 Rho GTPase）调节肌动蛋白细胞骨架的活性并在细胞-ECM 相互作用位点组装粘附复合物，从而允许细胞改变其特征。Rho GTPase 作为胞内分子开关——结合 GTP 时激活、结合 GDP 时失活（详见源文图 4）：鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）引起 GDP 释放并促进 GTP 结合以激活 Rho GTPase；GTPase 激活蛋白（GAP）刺激 GTP 水解使 Rho GTPase 失活；失活的 Rho GTPase 因鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子（GDI）的活性而留在细胞质中。
Rho 家族小 GTPase 成员已与间充质和变形虫样细胞运动相联系。Rac1 GTPase 刺激肌动蛋白丝形成以驱动细胞运动——促进片状伪足形成——并与间充质细胞迁移相关。纤维肉瘤和癌细胞表现出间充质型迁移，包括 integrin 和 MMP 在纤维结合位点的聚集以及管状蛋白水解降解轨迹的生成；这种 MMP 对 ECM 的蛋白水解使得肌动蛋白突起能够被推过 ECM 中的通道。Rac1 过表达已知诱导细胞内活性氧（ROS）增加；ROS 本身导致包括 SNAIL 在内的转录因子表达，SNAIL 又诱导 MMP 表达上调。有趣的是，Rac1 也促进"侵袭足"（invadopodia）的形成——富含 F-actin 的结构，其特征是存在 cortactin、cofilin、N-WASP 和 Arp2/3，并被整合蛋白、talin、vinculin 和 paxillin 等肌动蛋白调节和粘附分子环包围。经 Rac1 驱动的肌动蛋白聚合、微管与中间丝的招募以及蛋白酶的分泌与招募实现了这些复合物的延伸、成熟与稳定。与侵袭足相关的 MMP 组群包括 MMP-2、MMP-9、MT1-MMP、ADAM 家族成员、膜结合丝氨酸蛋白酶和尿激酶纤溶酶原激活物受体（uPAR）。抑制 MMP 诱导从间充质到变形虫样表型的转变，允许在缺乏蛋白水解和 ECM 降解情况下的侵袭。相比之下，RhoA 信号传导至 ROCK 激酶，刺激肌动蛋白纤维形成并产生变形虫样细胞运动所需的肌动球蛋白收缩力。这种运动依赖于 ROCK 但独立于 MMP——由于 ROCK 依赖性 MLC（myosin light chain）激活产生的力足以使 ECM 变形，从而促进变形虫样细胞运动。在人纤维肉瘤细胞中，间充质-变形虫样转变与 integrin 依赖粘附减弱相关，这也是变形虫样细胞迁移的典型特征。Rho 和 Rac 之间的紧密相互作用决定了肿瘤细胞运动的不同模式，并揭示了肿瘤细胞如何在间充质和变形虫样运动之间过渡。
依赖于 β-integrin-细胞粘附以维持细胞簇内聚的集体细胞迁移在使用 β-integrin 抗体时受损；细胞粘附被破坏，单个变形虫样细胞发生脱离和扩散，表明从集体细胞迁移到变形虫样细胞迁移的转变。这强调了依赖于不同环境挑战和线索的肿瘤细胞迁移的可塑性。向变形虫样细胞迁移的转变与肿瘤进展和转移相关，但它也可以在肿瘤逃避治疗中起作用——通过使肿瘤细胞能够采用替代机制进行细胞迁移，从而绕过针对某一种特定迁移模式设计的治疗干预。源文指出，研究者已经利用这一可塑性概念在体外和体内系统中测试了不同迁移模式之间的相互转换，并指出确定调节此转变及允许迁移可塑性的机制对于设计不依赖于细胞采取何种特定迁移模式即可抑制转移的广谱抗转移疗法至关重要。
5.4 二维（2D）细胞迁移：培养技术、迁移特征与局限（Two-Dimensional Cell Migration: Culture, Migration, Limitations）
细胞培养是在自然环境外的受控环境中培养细胞的过程。2D 细胞培养自 1900 年代初就得到实践，至今仍被广泛使用。其优点包括廉价、细胞生长和下游分析技术成熟以及比较文献丰富。细胞通常在平面玻璃或塑料表面上以单层形式生长和扩展；可能需要涂覆塑料表面以促进细胞粘附。
2D 间充质细胞迁移的特征是建立细胞突起——filopodia（薄膜突起）和 lamellipodia（宽阔平坦的细胞延伸）突起（详见源文图 5）。细胞推进主要由 lamellipodia 驱动，前缘含有通过肌动蛋白聚合形成的分支状 F-actin 复合物；这种聚合由信号分子控制，特别是小 GTPase Rac1。在 filopodia 中，肌动蛋白丝平行向尖端运行，允许诸如非常规肌球蛋白 X（MYO10）等分子马达沿其移动并积聚在尖端；这些马达被认为将包括整合蛋白在内的多种蛋白质沿肌动蛋白丝运输到 filopodia 尖端；integrin-粘附复合物将 filopodia 系于 ECM。新生的粘附在推进的片状伪足中成熟为更大的 focal adhesion 结构，形成胞内肌动蛋白复合物与 ECM 之间的机械连接。Filopodia 在 lamellipodia 进展中起作用并从 lamellipodia 中突出；它们在底部、轴和尖端位置具有粘附位点。底部粘附与 focal adhesion 相关联并在 filopodia 发育中起作用；轴粘附控制 lamellipodia 的推进但不与 focal adhesion 关联；尖端粘附在运动性中起作用并影响 lamellipodia 的推进。尖端和轴粘附位点都由 integrin 介导，肌动蛋白尖峰（actin spikes）也可存在于某些 filopodia 上。Filopodia 还在感知环境中起作用；它们是引导成纤维细胞沿外部化学梯度（称为趋化性）迁移所必需的，提示其在探测 ECM 中起作用。在此情形下，filopodia 被认为具有刚性感知机制，使其能够在前缘 lamellipodia 推进过程中探测基质硬度。在血小板中，filopodia 被认为在细胞扩散期间作为感知和粘附局部环境的天线起关键作用。
侵袭足（invadopodia）与 filopodia 相似，并且与基于肌动蛋白的质膜动态突起具有共同机制；它们定位于细胞体下方，在 2D 细胞培养中的进展将受到限制，因为它们不能侵入塑料组织培养表面；因此研究它们时通常在盖玻片上涂覆一层人工 ECM，并且增加 ECM 刚性会增加侵袭足的形成（详见源文图 5）。它们在 2D 细胞培养中的存在与侵袭特性相关，因为它们含有 MMP 等蛋白酶，有助于降解 ECM，因此会有助于细胞在体内的侵袭性。一些细胞类型（包括癌细胞）可采用变形虫样细胞迁移——在这种迁移中，细胞不依赖通过生成细胞突起产生运动，而是通过增强的收缩性来移动。ROCK 依赖性肌球蛋白轻链磷酸化和通过 GTPase RhoA 的肌球蛋白 II 激活驱动圆形或变形虫样表型的采用；这与细胞 bleb 的发生同时发生，bleb 由肌球蛋白 II 活性引起，是局部静水压力升高的效应。结果是，皮层肌动蛋白网络可能破裂或质膜可能从皮层细胞骨架脱离；细胞质可自由流动以诱导质膜中 bleb 的形成；Bleb 回缩发生在 F-actin 和肌动蛋白结合蛋白被招募到 bleb 中并伴随肌球蛋白 II 活性后。
2D 细胞培养系统的局限性在于细胞在固体平面上生长，因此扩张仅限于侧向方向。这不能代表体内细胞环境，因为细胞无法在第三维度扩展——细胞被其他细胞包围和影响。由于在 2D 中生长受限，细胞膜极性被强制为顶端和基底表面。细胞-细胞间通讯很少，整合素-粘附配体复合物分布异常，且固体表面提供高基质硬度影响细胞生长（详见源文图 5）。基于 lamellipodia 的 2D 迁移模式仅代表 3D 环境中细胞运动的几种机制之一。2D 和 3D 培养的细胞都会消耗培养基、耗尽营养并产生废物，从而损害细胞所处的环境。然而，2D 细胞培养仍提供了关于细胞突起、趋化性和细胞极性机制的重要见解。尽管 2D 平坦培养占主导地位，最近的研究已转向使用三维（3D）结构的培养，特别是认识到 ECM 在调节细胞行为中的重要作用。
5.5 三维（3D）细胞迁移：培养方法与迁移模式（Three-Dimensional Cell Migration: Culture Methods and Migration Modes）
细胞培养系统已发展到在 3D 中培养细胞。该方法使用 ECM 作为支持支架，允许细胞扩展并彼此以及与支架相互作用（详见源文图 5）。3D 细胞培养的优点是基质可以更灵活，细胞可以生长与基质和其他细胞建立周围连接。癌细胞从原发肿瘤迁移并转移到远端部位的能力在患者癌症进展中起作用。鉴于此，体内细胞迁移对于阐明信号机制和迁移期间细胞发生的结构变化很重要。缺点是更昂贵且细胞培养技术更复杂；模拟体内环境也可能困难，然而体内技术一直在进步。2D 细胞培养中的细胞扁平化并具有被强制赋予的顶端-基底极性，但通常在放回适当的 3D 培养条件时恢复其特征。上皮细胞可以恢复其天然顶端-基底极性，腺细胞能够形成允许分泌的管腔。3D 迁移的不同模式依赖于 ECM 的物理性质。
3D 培养的具体方法有三类。其一是完整组织切片：体外培养的完整组织切片将保留其原始 3D 结构，限制因素是切片厚度必须小于 0.3 mm 以允许充足的氧气和营养输送；或模拟肿瘤内部因缺乏营养和氧而常见的缺氧条件的模型，可能有助于理解这些因素如何促成新血管生成（angiogenesis）以及可能的化疗耐药性。其二是无支架技术：无支架环境中的细胞生长涉及细胞自发聚集成称为球体的细胞团块。球体是多层 3D 聚集体，其细胞结构重演原始肿瘤的结构特征；它们由不同层组成，包括内部缺氧和/或坏死区、一层非增殖细胞以及朝向边缘的高度增殖细胞区域。这种多细胞球体允许在更具肿瘤相关性的环境中研究肿瘤微环境、细胞-细胞相互作用、增殖和营养吸收；它们还具有扩散梯度（包括营养、废物和氧气）。将 3D 球体应用于细胞毒性或抗迁移药物的开发和测试允许在临床前药物筛选中验证细胞反应或浸润的效果，这优于通常使用的 2D 单层测试（后者缺乏 3D 结构，仅具有有限的细胞-细胞接触且不存在扩散梯度）。其三是基于支架的技术：细胞生长由锚定细胞并复制 ECM 的结构支持。水凝胶（hydrogels）含水量大，可被设计为向细胞提供更真实的微环境；它们可以具有类似于许多软组织的力学特性，并支持细胞粘附和蛋白质隔离。水凝胶可大致分为天然或合成材料——三种天然衍生的水凝胶是 collagen、fibrin 和 alginate；两种合成水凝胶是聚丙烯酰胺（PA）和聚乙二醇（PEG）；还有两种结合合成和天然聚合物元素的混合材料——透明质酸和多肽。源文图 6 和图 7 展示了作为球体生长并嵌入胶原基质的癌细胞的不同迁移活动示例。
3D 中细胞迁移的特征由细胞穿过的 3D 结构所决定。在体内，上皮和内皮细胞由基底膜支持——基底膜形成薄片状支撑结构提供细胞锚定并与下层间质基质形成边界。间质组织由密集的胶原纤维网络组成，产生许多大小不同的孔隙，可允许迁移细胞通过。这种变化多端的微环境将确保迁移细胞采用多种模式以推进自己穿过这种变化的景观。此外，细胞也能够根据来自微环境的线索在一种迁移模式与另一种之间过渡。
肿瘤细胞可在 3D 中呈现变形虫样细胞运动特征——这种运动独立于蛋白酶并涉及由于肌动球蛋白皮层的收缩性而形成膜 bleb。通过形成 bleb，肿瘤细胞可挤过 3D-ECM 中的间隙。迁移细胞后部的收缩性产生静水压力并引起细胞质向前流动；这是变形虫样迁移的一个特征，促进细胞向前运动，已在人乳腺癌细胞中观察到。Lobopodia（叶状伪足）是另一种可在 3D 细胞迁移中观察到的钝突起。叶状伪足迁移可被视为变形虫样和间充质迁移的混合；它使用不对称的胞内压力在前缘产生称为叶状伪足的 bleb 样突起。与间充质迁移一样，细胞紧密粘附于 ECM 以施加牵引力并产生运动。细胞核能够以"活塞"方式向前移动，以在前半部分细胞中产生压力，推动细胞向前移动。为了形成叶状伪足，细胞核在物理上将细胞质分为两部分——后部隔室和前部隔室。前部隔室（位于细胞核与前缘之间）静水压力的增加驱动叶状伪足的形成。连接核骨架和细胞骨架的蛋白质位于核膜中并使细胞核能够像活塞一样起作用，确定迁移细胞前缘的迁移。通过这种机制，在 3D-ECM 中迁移的细胞可响应周围 3D 基质从低压到高压突起的切换；这通常在原代人成纤维细胞和癌性纤维肉瘤细胞中观察到。叶状伪足的形成也以类似于变形虫样运输中 bleb 的方式通过肌动球蛋白收缩性发生。
Filopodia 也常见于在体内模型中生长的迁移细胞，并可能在定向细胞迁移中起作用。Filopodia 在血管生成（新血管从现有血管生长）中起作用——这已在斑马鱼胚胎中研究：血管内皮生长因子（VEGF）在内皮尖端细胞中诱导丝状突起，这些突起侵入周围 ECM。然而，在斑马鱼胚胎中抑制丝状突起似乎降低迁移速度但不改变内皮尖端细胞的方向。这些数据提示丝状突起可能不是定向迁移或趋化性所必需的，但起着探测 ECM 的作用。Filopodia 存在于迁移上皮细胞片的边缘，并在伤口愈合和胚胎发育中这些结构的融合中起作用。小 GTPase Rac1 引导丝状突起和片状伪足的组装，识别出 Rac 在这些前缘突起的肌动蛋白组织中的关键作用。在果蝇胚胎中，背侧上皮中的孔沿中线在胚胎发育后期被拉链式封闭；这里丝状突起在相对上皮边缘中细胞的正确匹配中起作用，维持中线接缝处细胞的正确对齐。在癌细胞中已观察到富肌动蛋白的丝状突起样结构，因为它们侵入 3D 微环境；在卵巢癌细胞中，由小 GTPase RhoA 激活诱导增加的这些丝状突起样结构（称为肌动蛋白尖峰，actin spikes）出现在细胞前部并引导向前运动，而非片状伪足突起。肌动蛋白尖峰与卵巢癌的侵袭性相关。
在 3D ECM 上培养的侵袭性癌细胞形成从细胞前腹侧膜垂直延伸的富肌动蛋白膜突起。这些是侵袭足（invadopodia），它们可以垂直延伸穿过 3D-ECM。这与它们在 2D 细胞培养中观察到的有限侵袭性形成对比。这些突起在癌症侵袭性中起重要作用，并且它们具有重塑和降解 ECM 的能力。它们含有肌动蛋白调节蛋白和粘附分子。乳腺癌肿瘤中癌细胞在 2D 和 3D 中的迁移被描述为涉及间充质样迁移。所描述的细胞突起为片状伪足和侵袭足/足体（invadopodia/podosomes）。足体（podosomes）是动态的富肌动蛋白粘附结构，其结构与侵袭足具有显著相似性。这两种结构之间的精确关系令人困惑，因为大多数研究足体的实验是在玻璃或塑料硬表面的 2D 上进行的。3D 上的研究将侵袭足识别为所涉及的结构，这些研究在厚的 3D ECM 上进行。这两种结构之间的区别可能是因为使用了不同的培养策略。已有人提出足体可能是成熟为某些生理条件下的侵袭足的前体结构，特别是因为足体的寿命为分钟级别，而侵袭足持续从分钟到小时。
胶质母细胞瘤细胞通过 3D 基质的侵袭依赖于 MMP，因此表明间充质样迁移。用 MMP 抑制剂（MMPI）Ilomastat 处理诱导胶质瘤细胞具有变形虫样形态和侵袭能力。已发现 ROCK/MLC 信号参与 MMPI 诱导的向变形虫样形态的转变。MMPI 处理的胶质瘤细胞能够通过发展变形虫样样迁移来补偿其侵袭性间充质蛋白水解依赖迁移能力的丧失。有人建议 MMP 抑制剂（抑制蛋白水解）和 ROCK 抑制剂（抑制变形虫样运动）的组合可用作治疗胶质母细胞瘤的有吸引力的抗肿瘤候选药物。仅用 MMPI 治疗胶质母细胞瘤不太成功，因为肿瘤细胞能够进行 MAT 并采用变形虫样样迁移。
ECM 中存在的致密胶原纤维可为细胞迁移提供显著障碍。细胞质是柔韧的，但细胞核通过受限空间的通过是显著的物理挑战。细胞核是一个大、硬且呈椭圆形的细胞器，必须由于胶原纤维在 ECM 中的结构排列而变形和操纵通过小空间。然而，细胞核也可以主动参与驱动 3D-ECM 中的迁移，如前所述的叶状伪足形成中。必须防止细胞核的过度弯曲和形状变形以避免核膜破裂和随后的细胞死亡。Wolf 等显示 3D 基质中的细胞运动受限于孔径大小，这是由于细胞核的尺寸。通常极限是核横截面积的 10%。中性粒细胞具有可变形核，可由于柔性 laminin 网络变形为细长索状，并且它们可以移动穿过 ECM 中小至 2 μm² 的孔。然而，侵袭性肿瘤细胞的核由于 laminin 的不同特性而柔韧性较差。肿瘤细胞可以穿孔通过极限为 7 μm² 的孔，超过此尺寸，肿瘤细胞必须消化 ECM 才能迁移。
5.6 结论（Conclusions）
EMT 程序是上皮细胞能够变得能动、失去细胞粘附和顶端-基底极性并迁移到远处部位的重要过程。所产生的间充质细胞使用肌动蛋白聚合在 3D 中形成丝状突起和侵袭足。这些结构也见于 2D 细胞培养中。扇形平坦的片状伪足也是 2D 中的典型特征，尽管这可能是 2D 细胞培养塑料特性的结果——其呈现硬表面，防止侵袭性侵袭足并促进细胞铺展和片状伪足的存在。这些突起的作用是帮助细胞在其环境中推进，尽管丝状突起也可能有"感觉"作用。在间充质细胞迁移中，细胞具有强烈的细胞粘附（通常依赖于整合蛋白）并且具有消化 ECM 的能力以实现在环境中移动。迁移模式具有灵活性，从间充质到变形虫样迁移的转变涉及由于肌动球蛋白收缩而形成的膜 bleb。在这种模式下，细胞与其环境弱相互作用并且可以挤过 ECM 中的间隙，因此不需要用 MMP 进行 ECM 的蛋白水解消化。迁移过程中的细胞-细胞相互作用对于细胞的进展至关重要，因为肌动蛋白聚合或肌动球蛋白收缩性产生的收缩力只有在能与 ECM 产生牵引力时才会产生细胞运动。此外，3D 和体内 ECM 的组成由于致密胶原纤维网络给迁移细胞带来许多障碍。因此间充质迁移依赖于 MMP 对 ECM 的蛋白水解消化，其中变形虫样迁移需要细胞挤过 ECM 中胶原纤维之间的间隙。集体细胞迁移涉及完整细胞群的迁移，其中该群在其前缘显示出强烈的细胞-细胞相互作用和蛋白水解能力，并且转变到其他模式（例如变形虫样）是可能的。
细胞核在细胞迁移期间的行为是需要考虑的重要因素，并且它可以成为限制因素。在间充质迁移中这不那么重要，因为细胞在 ECM 中为细胞运动创造空间，但在变形虫样迁移中固体核的大小可能是限制因素。然而，一些细胞已经发展出细胞核可参与迁移的机制，这在前缘细胞核可由于细胞前部力的产生而以"活塞"方式被迫移动的叶状伪足形成中是显而易见的。在某些细胞类型（例如白细胞）中，细胞核天生具有更柔韧的特性。两种机制将提供关于肿瘤细胞用于克服此障碍的可能方法的信息。迁移模式之间的转变是可塑性的，并在肿瘤细胞扩散和癌症进展中起重要作用。Rho GTPase 在细胞迁移和迁移模式之间的转变中起重要作用，Rho 和 Rac 之间在决定肿瘤细胞运动不同模式时的相互作用已得到识别。
一旦细胞从组织限制中逃逸，则细胞迁移模式具有可塑性并且细胞可以在间充质和变形虫样迁移之间过渡。ECM 的组成在决定细胞可以迁移的模式方面起重要作用。因此，用于研究迁移的细胞培养技术对于确定结果很重要。多年来细胞迁移已在 2D 细胞培养中得到广泛研究，随着研究进入 3D，已导致对细胞迁移及其决定因素的更好理解。最终，这将有助于确定生理组织中细胞迁移的机制；突起、细胞-细胞粘附和 ECM 的蛋白水解降解所起的作用。
本章个人批注
本章作为 edited volume 框架内的"癌症中的细胞迁移"主题章，在内容组织上明显是教科书式的——从 EMT 概念入手、过渡到三种迁移模式、再到 2D vs 3D 实验体系的对比，最后给出 take-home message。结构清晰、信息密度大，但作为 edited volume 的一章，它没有自己的原创数据，所有论断都通过大量引用（93 条参考文献）来支撑，这意味着我读到的实际上是一个整理性的、教科书化的综述。EMT、间充质迁移、变形虫样迁移、collective migration 这四个核心概念在前两章（发育、伤口愈合、免疫应答）中已经反复出现过，本章的特殊贡献在于把"迁移模式"作为一个独立变量系统化，并强调模式之间的可塑性（MAT 和反向 collective→amoeboid 转换）。另一个真正打动我的新内容是 3D 迁移中的细胞核限制问题——Wolf 等关于孔径 7 μm²（肿瘤细胞）与 2 μm²（白细胞）的对比，第一次让我直观看到为什么肿瘤转移时细胞核会成为机械瓶颈，以及 lobopodia 形成的"活塞"机制是怎样利用细胞核本身作为力发生器的。2D vs 3D 部分则给我留下了方法论上的提醒：以前以为"lamellipodia 主要在 2D 培养中观察到的"是 2D 限制下的人工产物（硬底面强制细胞铺展），现在知道 3D 中也能观察到 lamellipodia，但 lamellipodia 形态本身确实受 2D 表面性质影响——这在设计自己的迁移实验时是必须谨慎的。Rho/Rac GTPase 在模式切换中的"分子开关"角色是一个反复出现的主题，本章把 mesenchymal→amoeboid 与 Rac（高活性间充质）→RhoA（高活性变形虫样）这一对应关系讲得很清楚；mesenchymal→collective 的转换则涉及 β1-integrin 与细胞间粘附的耦合。最后源文中提到的"podosomes 是侵袭足的前体结构，寿命仅分钟，侵袭足持续分钟到小时"这一细节为我自己正在做的侵袭足定量实验提供重要参考——必须区分二者，否则寿命测量的对比会被混淆。本章对 3D 培养方法学（tissue slice、球体、水凝胶）的系统归类也很实用，特别是关于"球体作为天然缺氧梯度和扩散梯度系统"的论述，让我想起类器官（organoid）领域已经把这套思路推到了极致——是否可以把球体-胶原侵袭实验与 organoid-on-chip 结合起来用于药物筛选，是值得思考的方法学问题。
与上下章的衔接（一段话）
本章在全书组织中位于第 5 章，承接第 4 章免疫应答中免疫细胞迁移的论述（也是讨论 amoeboid 与 mesenchymal 模式的章节），并向后续章节过渡。从全书的章节顺序来看，前 4 章依次介绍引言、发育、伤口愈合和免疫应答四种生理/病理语境下的细胞迁移——但这些语境都聚焦于"正常"或"有益"的迁移过程；本章首次系统性地引入"病理性"迁移作为对象（癌细胞），并把 EMT 这个在前面几章被零散提到的程序提升为整章的核心机制（5.1 节）。同时，本章明确从 2D vs 3D 实验范式这一方法论维度切入，为后续第 6–11 章的方法论章节（生物物理化学基础、研究方法、3D 生物打印、高分辨率成像、计算建模、软件分析）奠定实验平台基础——本章 3D 节中提到的水凝胶、球体、tissue slice 等具体技术，将在后续方法学章节中获得详细操作流程。本章末尾关于 Rho/Rac 分子开关对迁移模式切换的论述也直接服务于第 12 章"靶向癌细胞迁移与侵袭的药理学策略"——理解 MAT 是设计 MMP 抑制剂+ROCK 抑制剂联合方案的前提。总体而言，本章在全书结构中扮演双重桥梁角色：从"生理语境下的迁移"过渡到"病理语境下的迁移"，并从"现象描述"过渡到"方法学与治疗学"。