第 54 章：脊椎动物神经肌肉接头（The Vertebrate Neuromuscular Junction）

54.1 引言（Introduction）

神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）是中枢神经系统运动神经元与骨骼肌纤维之间的连接位点。在该位点，运动神经元在脊髓与脑内产生的动作电位被转换为骨骼肌纤维上的动作电位，后者再触发沿整条纤维传播的钙信号并最终引起肌纤维收缩。NMJ 之所以成为神经生物学早期最受关注的突触之一，原因在于其外周位置便于接近、体积远大于中枢神经元之间的突触、可通过神经刺激引发的抽搐容易进行功能测定，以及乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）作为递质与一系列调节其传递的药理制剂早期就得到了鉴定。这些早期研究造就了我们对突触本质的绝大部分认识，也提供了今天神经生物学中最为基础的信息。Lee 与 Thompson 在引言末尾列出了一份清单，列举了由 NMJ 研究得出的若干重大贡献：（1）化学突触传递的本质（Hubbard & Quastel 1973）；（2）突触传递的基本药理学（Colquhoun 1975）；（3）以量子假说为代表的递质释放囊泡机制（Katz 1996 Fenn Lecture）；（4）囊泡再循环机制（Rizzoli & Betz 2005）；（5）投射神经元群与靶群通过靶依赖性细胞死亡实现数量匹配的原理（Buss/Sun/Oppenheim 2006）；（6）发育初期轴突过度投射与随后"突触消除"的原理（Lichtman & Colman 2000）；（7）保证运动神经元抵达正确靶肌的选择性轴突引导原理（Lance-Jones & Landmesser 1981）；（8）突触后受体在突触处的聚集（Wu/Xiong/Mei 2010）；（9）神经活动在塑造突触与肌纤维特性方面的重要性（Schiaffino/Sandri/Murgia 2007）。这份清单既界定了本章要讨论的范围，也提示 NMJ 已经超出肌肉学本身，成为整个突触生物学的模型系统。作者表示并不是清单中的所有条目都将在本章深入讨论，其他条目可参考所引综述。

54.2 接头的结构（The Structure of the Junction）

NMJ 通常位于每条肌纤维的中段附近；除少数例外（眼外肌中部分纤维具多重支配），绝大多数肌纤维上只有一个 NMJ（Figure 54.1）。运动神经的轴突通常成束穿入肌肉中部，再分出分支走向每条纤维上的接触区；其结果是在肌肉中部形成一条"接头带"。该带中的运动轴突来自脊髓中一群神经元——即所谓的"运动池"（motor pool），其胞体按大致粗略的局部拓扑排布，但不同肌肉的神经元之间存在混合。每个运动神经元在肌肉内多次分支，独占地支配一组纤维；该运动神经元与它所支配的这组纤维共同构成"运动单位"（motor unit）。由于每个 NMJ 都设计为在突触间进行保真传递，每个运动神经元上的动作电位都引发其运动单位内各纤维的收缩；这些纤维彼此并联，张力相加。肌肉产生力的等级化正是由同时激活的运动神经元数目决定的，这一原则将在本章 54.11 节关于运动单位发育的讨论中再次出现。

NMJ 现今可以用光镜轻易观察，尤其是转基因小鼠中不同光谱变体的荧光蛋白可以预标记接头的各个组分（Figure 54.2）。Feng 等 2000 年的开创性工作中建立的策略允许在活体或固定组织中同时显示接头的多种组分。具体而言，用运动神经元特异启动子表达青色荧光蛋白（CFP）标记神经终末分支（Figure 54.2A），用 Schwann 细胞特异启动子表达 GFP 标记 Schwann 细胞（图 54.2C），用罗丹明偶联的 α-银环蛇毒素（Btx）标记乙酰胆碱受体（AChR，图 54.2B），用 Alexa647 偶联的 fasciculin-2 标记乙酰胆碱酯酶（AChE，图 54.2D），用 DAPI 标记所有细胞核（图 54.2E）；图 54.2F 为终末（蓝）、Schwann 细胞（绿）、AChR（红）的彩色叠加。图 54.2 G–I 显示 22 月龄老龄小鼠胸骨乳突肌 NMJ，可与年轻成年 NMJ（A–F）作形态学比较。

神经终末分支在肌纤维表面占据一处轻微的凹陷，即"突触沟"（synaptic gutter）；沟下方肌膜形成条纹状的折叠，称为"突触后褶"或"次级褶"，伸入肌浆内（初级褶即突触沟本身）。AChR 是位于肌膜上的配体门控离子通道，可被 α-银环蛇毒素以基本不可逆的方式结合、阻断传递（毒素与 ACh 竞争受体上的同一结合位点）；因此该毒素成为 NMJ 分子细胞生物学研究的有力工具。AChR 集中分布于终末正下方，比突触外高出 1000 倍以上——这种富集依赖于神经支配的存在，去神经后，受体在接头以外的肌膜上出现，构成所谓的"去神经过敏"。在 Figure 54.2B 中仔细观察 Btx 标记可发现 AChR 呈条纹状——这是肌膜在突触沟内折叠成次级褶的直接反映。

肌膜中除 AChR 之外，还有其他关键组分。碘化 Btx 与电子显微镜放射自显影显示 AChR 富集于褶顶——最靠近 ACh 释放位点的膜区（Fertuck & Salpeter 1974）。同时，电压门控钠通道与锚蛋白一起在次级褶底部富集（Flucher & Daniels 1989），使该处膜对去极化高度敏感；AChR 开放引发的去极化因此可借助这些集中的钠通道将肌膜带到阈值之上。这种 AChR 在顶、钠通道在底的分布共同实现了从神经到肌纤维动作电位的高效传递。其结果是 NMJ 拥有较大的"安全因子"——即使约 70% 的 AChR 被阻断（如被 Btx 结合），接头仍能传递信号（Lingle & Steinbach 1988）。

Schwann 细胞是接头的另一关键组分。它们是一类非髓鞘化变体，与从脊髓外行至肌肉、靠近肌纤维的同一类胶质细胞同源；其胞体位于接头之上，并伸出过程覆盖神经终末。在电子显微镜下可见 Schwann 细胞几乎完全覆盖神经终末，比终末本身更贴近终末。除覆盖终末的主过程外，Schwann 细胞还有连接胞体的过程以及少数在突触沟间无终末分支走行的小过程。终末 Schwann 细胞在接头维持与修复中的功能将在 54.12、54.13 节中讨论。

位于突触沟内、神经终末与肌纤维之间还存在另一种蛇毒素的靶——乙酰胆碱酯酶（AChE）。fasciculin-2 可与 AChE 结合并抑制其活性，亦可偶联荧光团作为接头的 AChE 探针（Figure 54.2D）。AChE 将神经终末释放的 ACh 分解为乙酸与胆碱，终止其激活 AChR 的能力；因此 AChE 确保释放的 ACh 在突触处寿命短促，只对 AChR 提供短暂的激活。AChE 位于神经终末与肌纤维之间的突触沟内，主要由肌纤维合成，最终通过与"突触基底板"（一种存在于神经终末与肌纤维之间、并延伸进入次级褶深部的特化蛋白基质）中胶原组分的结合而集中到突触处（Patton 2003）。

最后，DAPI 染色揭示了接头处的细胞核分布：部分来自 Schwann 细胞的胞体；部分是已知的接头处成纤维细胞（Court 等 2008）；但其中许多核是肌源性核。这些突触核或"底板核"（sole plate nuclei）具有特化的转录程序，许多基因在此转录而在肌内其他核中转录很差甚至不转录——例如 AChR 基因本身（Merlie & Sanes 1985）。这种"突触特异的基因表达"及其编码机制对于理解突触特化至关重要，并部分解释了若干接头组分的局部集中，是下文 54.4 节讨论受体聚集机制的基础。

54.3 接头的超微结构（The Ultrastructure of the Junction）

NMJ 是最早被电子显微镜详细观察的突触之一，也是首次发现突触囊泡的位点（Robertson 1960）。Figure 54.3 显示一张经锇酸与柠檬酸铅染色的超薄切片，显示神经终末分支及其与肌表面的对位关系。切片中可见神经终末（NT）充满线粒体与突触囊泡，位于肌纤维（MF）表面的"突触沟"中。终末内部分突触囊泡成簇地停靠于朝向肌纤维的膜上——这些"活性区"（active zones，由图中白色箭头指示）是突触囊泡与终末膜融合、将囊泡内容物倾入突触间隙（即终末与肌纤维之间的细胞外空间）的位点。突触间隙中含有基底膜（图中较小黑色箭头指示）。紧贴神经终末之上、与终末本身贴得很紧的是 Schwann 细胞的过程——图 54.3 中可见 Schwann 细胞几乎完全覆盖神经终末。黑色箭头头标示一处突触后次级褶，提示肌膜折叠伸入肌浆内。次级褶在功能上的意义在 54.2 节中已经讨论：AChR 富集于褶顶，钠通道富集于褶底——这一分布使 AChR 介导的去极化能就近激活钠通道、将肌膜带到动作电位阈值。该超微结构是 NMJ 高保真传递的物理基础。

54.4 突触处的 AChR 聚集（Clustering of AChR at the Synapse）

接头下方 AChR 的高密度及其在肌膜其他区域的稀疏长期以来令人着迷。决定这一聚集的关键发现源自沉积于突触基底膜（即"突触基底板"）中的分子——它们指定了受体的高密度聚集，最终鉴定出的关键蛋白是聚集蛋白（agrin）。agrin 由运动神经元产生并沉积到突触基底板的一种特异剪接形式具有引发此种聚集的能力（McMahan 1990 Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, 即"agrin 假说"的经典提出）。agrin 基因敲除的小鼠因完全无法激活肌纤维而在出生时死亡（Gautam 等 1996），从而直接证明 agrin 是 NMJ 形成所必需。

若 agrin 能如此聚集受体，则肌纤维上必然存在 agrin 的受体；约 15 年前，跨膜的"肌肉特异激酶"（muscle specific kinase，MuSK）被鉴定为 agrin 信号通路的关键组分（DeChiara 等 1996）。MuSK 激活启动一个复杂、至今仍未完全理解的信号级联，最终导致 AChR 在突触处的聚集——可能通过若干与受体相关的其他蛋白（如 rapsyn 等胞内锚定蛋白）介导。MuSK 敲除小鼠无 NMJ、围产期死亡，证明 MuSK 在突触形成中的关键作用；但未能在 MuSK 与 agrin 之间检出直接结合，从而提示存在共同受体。过去两年中（相对于 2012 年），大量证据表明低密度脂蛋白受体家族成员 Lrp4 即为 agrin 受体（Kim 等 2008 Cell；Zhang 等 2008 Neuron）：Lrp4 与 agrin 结合，促进其与 MuSK 的相互作用及 MuSK 的激活；与 MuSK 敲除细胞类似，缺乏 Lrp4 表达的肌细胞也无法在 agrin 刺激下聚集 AChR。Lrp4 由此被视为 agrin 的真正受体、MuSK 的共受体，把 agrin 信号从神经终末表面传递到肌内。

虽然尚有许多细节有待补充——例如信号级联的完整组成、各中间组分的角色、AChR 聚集如何与突触下细胞骨架耦合——但受体聚集如何形成的大体轮廓已经清楚：从运动神经元释放特异因子（agrin）→ 与肌膜上的 Lrp4/MuSK 受体复合物结合 → 在肌内激活下游信号级联 → 招募 AChR 与相关锚定蛋白至突触位点。agrin 在指导神经肌肉突触分化中占据主导地位的精彩证据来自对肌纤维异位突触形成的研究。早在 1917 年，人们就知道可以把含运动轴突的一段神经移植到肌肉表面，但只要原接头仍然在位且肌纤维被该接头激活，移植的轴突就无法形成突触；只有去神经后才能由这些植入的运动轴突诱发异位 NMJ 形成（Jansen/Lømo/Nicolaysen/Westgaard 1973）。后续 Cohen/Rimer/Lømo/McMahan 1997 与 Jones/Meier/Lichtsteiner/Witzemann/Sakmann/Brenner 1997 两项研究表明，仅靠 agrin、无神经存在也能诱导同样的突触分化：将编码神经型（活性）agrin 剪接体的构建转染到肌纤维中，使肌纤维自身表达并释放 agrin，可在无任何神经的情况下诱导与该 agrin 暴露区相邻的纤维形成完全分化的位点——含 AChR 聚集、AChE、次级褶以及核聚集，并伴随突触特异的基因表达。因此 agrin 不只是指导受体聚集的因子，而是启动突触分化全程序的"主开关"——包括突触沟形成、次级褶、AChE 募集以及突触特异基因表达。

54.5 对 agrin 假说的修正：肌纤维的受体预模式化（A Modification to the Agrin Hypothesis: Muscle Pre-patterning of Receptors）

agrin 的发现曾让 NMJ 的发育初建显得直截了当：运动神经元轴突在肌纤维还很短时进入发育中的肌肉，其终末通过释放 agrin 诱导肌纤维表面突触位点的分化；肌肉再通过肌原细胞向每条纤维两端的添加而生长，最终形成纤维很长、NMJ 位于中部的形态。agrin 敲除小鼠晚期胚胎的初步检验支持这一图景——AChR 簇缺失（Gautam 等 1996）。

然而，将运动神经元在发育早期消融的小鼠的检测对这一"神经中心"观点提出了挑战：从未见过运动神经元的肌肉在纤维中段仍形成 AChR 簇，并出现突触特异的基因表达（Arber/Burden/Harris 2002 综述）——这些特征被称作"预模式"（pre-pattern）。重新检查早期发育阶段的 agrin 敲除小鼠可见 AChR 簇已经形成，只是随后消失——运动神经元来源的 agrin 似乎只是维持初始突触接触下方的 AChR 聚集，而非最初诱发它们。事实上，神经终末释放的 ACh 自身是 AChR 聚集的负调控因子（Brandon 等 2003；Misgeld 等 2002）：ChAT 缺陷小鼠的 NMJ 上 AChR 聚集模式异常；运动神经元来源的 agrin 在突触接触位点上抵消 ACh 的负效应，使 AChR 维持在聚集状态。预模式的发现赋予肌纤维决定突触形成位点的角色——这与中枢神经系统中突触后神经元更相似。最近 Kim 与 Burden 2008 年的工作进一步表明，肌内的 agrin 信号组分（MuSK 等）负责预模式的形成，而预模式反过来可能引导运动轴突在肌内的生长方向——即肌纤维在决定"哪里形成 NMJ"这一问题上并非被动，而具有相当主动的引导作用。

54.6 逆行信号（Retrograde Signaling）

神经科学家长期关注的另一议题是：靶细胞（肌纤维）产生的因子——尤其是在初次突触接触之后——是否会影响神经终末及形成突触的神经元的分化，这一过程被称为逆行信号。Fitzsimonds 与 Poo 1998 年的综述系统总结了 Mu-ming Poo 等的众多实验，为这种对突触形成与强度的逆行影响提供了证据。前面提到的 AChR 在神经抵达前就在肌肉中预模式化，就是一个清晰的逆行影响例证。本节重点讨论两个具体例子：靶介导的细胞死亡，以及突触前与突触后特化结构的对齐。

胚胎学家早已注意到脊髓早期发育中存在神经元过度产生随后大量死亡的现象，这在脊髓运动神经元池中尤其明显：运动神经元过度产生可达三倍（Lance-Jones 1982），细胞死亡在小鼠出生前基本完成。Hamburger 1980 与 1993 的综述回顾了 Hamburger 与 Levi-Montalcini 早年的工作：消融靶会导致大多数运动神经元死亡，而在鸡胚中植入额外的肢芽等外周靶可使更多运动神经元存活。这些结果被解释为运动神经元之间对靶的竞争——成功与靶肌建立接触的存活，失败的死亡。这一发现直接引出了由靶与支持细胞产生、被称为"营养因子"（trophic factors）的、能支持神经元存活的因子的概念——其中最重要的是神经生长因子 NGF 的发现。借助小鼠基因敲除技术，已能证明某些营养因子信号缺陷会导致神经肌肉病理（Pitts/Potluri/Hess/Balice-Gordon 2006 综述）。

靶竞争模型仍有一个棘手问题：若运动神经元在投射之初就被预定到特定的肌靶及其内的纤维，那么如何在尚未达到成年大小、纤维组成尚未确定的初始投射群体中挑选出对应每块肌肉的恰当分化运动神经元？而细胞死亡在肌肉完成最后一波肌生成之前就已结束——这意味着运动神经元与单位内纤维的分化在何时被决定、多少取决于发育中肢芽内的因子（外周形态发生素梯度等，详见 54.9 节），仍是值得研究的问题。

第二个有力的逆行影响例子是突触后肌纤维与突触前神经终末之间特化结构的对齐：突触前神经终末的活性区——突触囊泡停靠与释放的位点——与突触后褶的开口对齐，使递质释放位点正好对着其作用位点（Nishimune/Sanes/Carlson 2004 Nature）。递质释放由动作电位到达终末 → 终末去极化 → 电压门控钙通道（VGCC）激活 → 钙内流 → 触发突触囊泡在活性区融合并释放递质而完成；钙通道又与活性区物质紧密关联，从而保证钙浓度的最大变化正发生在囊泡融合所在的终末区。肌纤维产生的含 β2 链的层粘连蛋白分子富集于 AChR 簇对侧的基底膜区，因此层粘连蛋白也由 agrin 信号组织；该同种型直接与神经终末膜上 VGCC 的胞外域结合。这种相互作用（连同基底膜的其他组分）保证了 VGCC 在突触间隙对侧、层粘连蛋白-β2 所在处的聚集。事实上，层粘连蛋白-β2 不仅能聚集钙通道，还能聚集递质释放机器的胞内组分；可见突触后细胞反过来协调着突触前神经终末机器的组织——这是逆行信号最具体、最具分子细节的体现。

54.7 用电子显微镜揭示神经终末的结构生物学（Structural Biology of the Nerve Terminal via Electron Microscopy）

常规超薄切片电子显微术提供了大量突触结构的细节信息，但这类显微图对切片厚度方向（约 50 nm——单个突触囊泡大小）的信息无能为力——该厚度内的结构虽然在显微镜下分辨得出，却被叠加到同一个二维图像中，相当一部分结构信息被丢失。解决办法是对样本做系列倾转成像、用断层成像术（tomography）重构出代表该体积虚拟切片的图像，再从任意视角观察。U. J. McMahan 及其合作者（Harlow/Ress/Stoschek/Marshall/McMahan 2001 Nature）用这一技术在蛙 NMJ 活性区揭示了此前未识别的结构：紧邻突触前膜的物质脊不是无定形团块，而是有规则的、重复出现的结构单元，目前识别出三类——beams、ribs 与 pegs。Beams 是沿脊长轴方向首尾相连排列的棒；ribs 从 beams 周期性侧向伸出，连接到停靠的突触囊泡（在蛙中通常每条活性区脊的两侧各有一排停靠囊泡）；pegs 则连接 ribs 与神经终末膜上被认为是钙通道的蛋白。可见存在一套将突触囊泡锚定在预期位点、并将该锚定机器连接到触发释放过程的蛋白上的体系——beams 提供主结构骨架，ribs 将囊泡拴在该骨架上，pegs 通过钙通道将锚定机器与触发信号耦合起来。这一断层分析已扩展到小鼠接头（Nagwaney/Harlow/Jung/Szule/Ress/Xu 等 2009 J Comp Neurol）：相同的组分存在、彼此以及与突触囊泡、钙通道的连接也相同；但小鼠的活性区并不排成重复阵列，每个活性区只含一对停靠囊泡，beams 与 ribs 的位置也与蛙不同。该制备为详细研究递质释放的结构生物学以及突触囊泡如何被带到活性区提供了丰富的可能性——例如可以原位追踪囊泡停靠、预激活、融合与回收的动态。

54.8 神经肌肉接头的一生（The Life History of the Neuromuscular Junction）

肌纤维一旦开始生成便迅速被神经支配（Bennett & Pettigrew 1974），突触即在前面提到的预模式区形成。最初的受体集中在称作"斑块"（plaque）的椭圆形区域；与成年期不同的是，多个运动神经元的过程在该斑块内接触同一条肌纤维。斑块随后逐渐转变为"椒盐脆饼形"（pretzel），即 Figure 54.2 所示的分枝形状；这一转变伴随 AChR 从原斑块部分区段被消除、斑块中出现孔洞（Marques/Conchello/Lichtman 2000 J Neurosci）。该消除的机制长期被认为与神经终末被消除相关，但近年发现该解释不再确定：Kummer/Misgeld/Lichtman/Sanes 2004 年的工作表明，在无任何神经支配的条件下，培养中的成肌细胞在某些底物上发育出形态与活体内纤维上所见高度相似的 AChR 椒盐脆饼形——提示斑块到椒盐脆饼形的形态转变可由肌纤维自身的程序驱动，而不必依赖于神经的输入。

如前所述，新生肌纤维的 NMJ 上有多个轴突接触，鼠类中这种"多神经支配"或"多重支配"（polyneuronal innervation）持续到出生后第二周（Brown/Jansen/Van Essen 1976 J Physiol）；之后每个纤维上的多个输入逐渐被消除到只剩一个。该消除并不涉及运动神经元的死亡——运动神经元的大规模死亡发生在消除之前。运动单位的生理学和解剖学分析显示，突触消除是同一群运动神经元终末分支分布的重新安排：每个运动神经元最初只是拥有更多终末分支并接触更多肌纤维。该过程一直被视为支配轴突之间为接触每条纤维而进行的竞争，主要依据是最终结果——所有输入被消除到只剩一个、且过程中似乎不存在所有输入都丢失的时段。

对该过程理解的重要进展来自 Lichtman 实验室开创的活体成像（Walsh & Lichtman 2003 Neuron）：用低浓度荧光染料偶联 Btx 标记活体突触上的小部分 AChR（由于 NMJ 传递的安全因子高，可以在不影响传递的前提下标记部分受体）；并通过在运动轴突中表达荧光蛋白（FP）使运动轴突终末也可在活体下成像。颈部胸骨乳突肌便于在麻醉小鼠中成像——通过皮肤小切口用浸入式物镜在宽场荧光显微镜下观察单个接头；每个 NMJ 及其周围 NMJ 具有独特的椒盐脆饼形形态，因此可以先成像某接头、放动物恢复后过一段时间再对同一接头重新成像，观察消除过程中突触前与突触后的变化（Van Mier/Balice-Gordon/Lichtman 1994）。不同光谱变体 FP 的转基因表达差异进一步增强了观测能力（Feng 等 2000）：某些 FP 启动子驱动的转基因只在少量运动神经元中表达——将这种"亚集小鼠"与在所有运动轴突中表达另一颜色 FP 的转基因品系杂交，便可在同一 NMJ 上同时显示单根轴突的范围与其所有竞争者的范围；由此可以判定各个轴突终末在该 NMJ 上的行为。这类实验显示竞争非常动态，轴突在每条纤维的斑块上退缩与伸展；竞争主要发生在不同终末之间争夺突触位点及其 AChR 的接触；当一个轴突留下、其他全部从突触位点撤出时，竞争结束。

活动在突触消除中的角色因为神经系统经验效应的一般兴趣、视觉系统发育的研究兴趣以及 Donald Hebb（Stent 1973 Proc Natl Acad Sci USA 关于 Hebb 假说生理机制的阐述）关于突触强度可被特定使用模式改变的思想的影响而受到关注。证据清楚地表明活动扮演主要角色，三组实验尤为关键。第一组实验（Favero/Buffelli/Cangiano/Busetto 2010 Neuroscience）考察了活动在成年肌肉再支配过程中发生的类似突触消除事件中的作用：再生轴突常对纤维形成多神经支配，这种多神经支配在再支配后随时间消失；在远离肌肉的神经上施加钠通道阻断剂河豚毒素可阻断动作电位从该施加位点通过——由于这些神经的活动源自脊髓，运动神经元因此沉默；这种阻断延迟了多神经支配从肌肉中的消除。在阻断位点远端放置刺激电极可以精确控制运动神经元的活动（只剩施加的刺激引发的活动）；神经中由刺激引发的同步活动比单独阻断更显著地延迟突触消除。这表明一组轴突活动之间的相对时序对消除过程至关重要——同步活动促进输入保留，异步活动促进输入移除。

第二组实验（Buffelli/Burgess/Feng/Lobe/Lichtman/Sanes 2003 Nature）用精细的转基因手段在运动神经元中以 tamoxifen 诱导 cre 介导的 floxed 胆碱乙酰转移酶（ChAT）切除：ChAT 是合成 ACh 的酶，因此 ChAT 被失活的运动神经元沉默、不能在其 NMJ 激活肌纤维；tamoxifen 给药时序可被控制、tamoxifen 剂量决定 ChAT 切除实际发生的运动神经元比例。通过对 ChAT 的免疫染色可识别有或无 ChAT 的运动轴突终末，结果显示表达 ChAT 的运动神经元在与不表达 ChAT、因此不释放 ACh 的轴突的竞争中获胜——这表明活动的运动神经元胜过不活动的运动神经元。

第三组实验（Personius 等）检测早期运动神经元发放模式的变化：单单位肌电图记录新生小鼠肌肉，记录由单个运动单位活动引起的肌纤维动作电位（Personius & Balice-Gordon 2001 Neuron）；根据波形与幅值可识别单个运动单位。新生早期运动单位倾向于同时活动，该倾向在出生后发育中、突触消除期内消失。同步活动为何随运动神经元成熟而减弱？部分解释是运动神经元之间存在缝隙连接；缝隙连接耦合随发育、随同步活动消失而减弱（Personius/Chang/Mentis/O'Donovan/Balice-Gordon 2007 Proc Natl Acad Sci USA）。缝隙连接在相连运动神经元之间扩散兴奋，应当有助于同步其动作电位活动。因此，推动异步化与多神经支配消除发育的因素之一就是缝隙连接耦合的降低；事实上，在主要缝隙连接蛋白（如 Cx40）表达缺失的小鼠中，多神经支配出现过早消除。

经过突触消除，小鼠大多数 NMJ 在出生后第二周变为单一支配，NMJ 也达到其成熟的椒盐脆饼形形态。然而此时肌肉尚未达到成年大小——在随后数周内通过纤维直径的增加显著长大。接头如何适应肌纤维的生长、突触本身有多稳定？活体成像给出了明确答案（Balice-Gordon & Lichtman 1990 J Neurosci）：NMJ 保持其分枝模式，通过"插入式"生长（或萎缩时的收缩）与肌纤维同步放大（或缩小），使得椒盐脆饼形只是同一形态的更大（或更小）版本。在成年生活的许多月内接头本身非常稳定。然而老化确实影响接头：当小鼠接近 2 岁时，这种稳定性消失、接头开始显著变化（Figure 54.2 G–I；Balice-Gordon 1997 Muscle Nerve；Valdez 等 2010 Proc Natl Acad Sci USA 关于热量限制与运动可减缓老化变化）：神经终末从主要为紧贴肌表面的光滑管变为带悬垂膨体的形态；AChR 在肌膜上相应变化——从椒盐脆饼形变为位于膨体所在位点的岛状分布。这种正常情况下稳定突触的变化原因未知，曾被认为是老化引起的突触维持机制的渐进衰退；但近期实验（Li/Lee/Thompson 2011 J Neurosci，submitted 状态引用）提示老化引起的变化是突发的，可由 NMJ 区域肌纤维的损伤解释——损伤的肌纤维段退化与再生造成 NMJ 形态的破坏。

54.9 肌肉支配的特异性（Specificity of Muscle Innervation）

发育过程中，单个运动神经元获得一个身份（identity）——即在 CNS 中接收恰当的连接集合、并投射到外周正确肌肉（Dasen & Jessell 2009 Curr Top Dev Biol 综述）。Landmesser 与 Lance-Jones 1981 年 Proc R Soc Lond B Biol Sci 的经典实验显示轴突在早期发育中以选择性方式长入外周以到达其肌肉靶：他们按运动神经元所进入的外周神经以及投射到的肌肉对其进行图谱绘制，结果显示只要脊髓旋转角度不太大，运动神经元会重新布线以抵达其预定靶——这既证明了运动神经元的特化，也证明了轴突寻路。Jessell 等的研究揭示了运动神经元本身如何被形态发生素的梯度特化——这些梯度（来自脊索、背侧神经管、底板等）启动特定转录因子（如 Hox 家族）的表达，以及一系列梯度如何按列（column）和池（pool）两个层级指定运动神经元身份。鉴于运动神经元在外周神经中的路径以及它们所支配的肌肉与肌内的纤维类型高度模式化，这些特性很可能由外周形态发生素的梯度所决定，其中一些形态发生素（如肢芽内的 FGF、retinoic acid 等）已为人知。

54.10 NMJ 介导的肌肉可塑性（Muscle Plasticity Mediated by the NMJ）

活动不仅参与突触消除，肌肉本身对其运动神经元施加的活动也极为敏感。最直接的例子是去神经过敏（denervation hypersensitivity）：当肌肉因支配其的轴突损伤而失神经时，整条纤维的肌膜对 ACh 变得敏感（Berg/Kelly/Sargent/Williamson/Hall 1972 Proc Natl Acad Sci USA；Lømo & Rosenthal 1972 J Physiol）；甚至不必真正去神经——麻痹肌肉即可产生同样结果。过敏来源于 NMJ 外的 AChR 合成：原本不转录 AChR 的肌核（"接头外"核）在肌肉失活后开始转录，受体随之出现在表面肌膜上。正常由神经支配施加的活动抑制这些"接头外"肌核对 AChR 的合成。该活动不仅抑制 AChR，还决定肌肉能否接受植入于接头外的神经支配——只要麻痹（而非必须去神经）就能让这些神经形成突触；反过来用植入电极诱发去神经肌肉的动作电位（即使纤维本身去极化）也可抑制植入神经形成突触的能力。这一发现把肌肉活动的功能从"产生收缩"扩展到"调控自身可塑性"。

肌肉及其内纤维在收缩性质上各有特化，常被描述为不同的"纤维类型"——涉及整套不同的蛋白同种型表达，以支持不同类型的收缩表现（Schiaffino/Sandri/Murgia 2007 Physiology 综述）。每一运动单位由同一种纤维类型的纤维构成（Burke/Levine/Salcman/Tsairis 1974 J Physiol），且纤维类型与其运动神经元的活动模式匹配：发放长串低频动作电位的所谓"慢"运动神经元（Hennig & Lømo 1985 Nature）所形成的运动单位中，纤维收缩较慢但能持续收缩；发放短串高频动作电位的运动神经元所形成的运动单位中，纤维收缩较快但更易疲劳。

那么发育中纤维类型选择性支配如何建立？许多问题尚未解决；纤维类型显然不是不可变的，神经支配甚至活动都可使其转化（Ausoni/Gorza/Schiaffino/Gundersen/Lømo 1990 J Neurosci 提示这种适应可能是不完全的、或仅在"适应范围"内起作用）。纤维类型在发育中很早就开始出现（Condon/Silberstein/Blau/Thompson 1990 Dev Biol），所出现的模式明显是肌肉特异、甚至在同一肌肉内也是区域特异的。培养成肌细胞的实验提示细胞谱系对某些类型的分化有作用（Stockdale 1992 Dev Biol），但神经支配乃至肢芽内的环境也起重要作用（Cho/Webster/Blau 1993 J Cell Biol）；早期模式即使在无神经支配时也能形成（Condon 等 1990）。一些实验提示一组纤维的神经支配可能通过对不恰当纤维类型支配的选择性消除而出现（Fladby & Jansen 1990 Development；Jones/Ridge/Rowlerson 1987 J Physiol）；其他实验则提示在所有纤维仍被多神经支配时，单个运动单位的支配就已经按类型强烈偏倚（Thompson/Sutton/Riley 1984 Nature）。这一重要问题很可能由多种因素共同决定：轴突引导、肢芽内的位置梯度、发育时序与成肌细胞谱系、轴突偏好、肌肉对神经施加的不同活动模式的适应性，以及不同活动模式在发育中的出现。

54.11 运动单位发育中的若干问题（Some Issues in the Development of Motor Units）

运动控制的一个基本原理是所谓"大小原则"（size principle，Henneman 1985 J Exp Biol）。如前所述，肌肉收缩通过激活单个运动单位产生、张力可通过同时激活的运动单位数调节；肌肉力的精细控制取决于这些运动单位的数量及它们各自的规模（即所含肌纤维数）。而且每块肌肉中运动单位的募集有顺序：小运动单位先被募集，大运动单位后被募集。运动程序的组织如此依赖于按大小的有序募集，因此在发育中建立肌肉内合适大小的运动单位就至关重要。该机制尚未完全清楚，但突触消除过程显然适合承担这一目的。例如，若一个运动神经元保留了其最初多神经支配过的大多数纤维的接触，便会形成大的运动单位。为验证此机制是否起作用，Kasthuri & Lichtman 2003 Nature 的实验将两组运动神经元分别用两种不同荧光蛋白转基因标记的小鼠用于检查多神经支配 NMJ 的状态：研究者可据此检查这两种不同运动神经元的轴突终末、并依据形态判断哪个可能在争夺 NMJ 中获胜、哪个在失败。结果显示，在两个神经元共同支配同一肌纤维的情形下，其中一个轴突在大多数 NMJ 上看似获胜并排挤另一轴突；但在它们与其他轴突竞争的另一些 NMJ 上，两个轴突都可能获胜或失败。这些结果表明不同运动轴突之间存在竞争活力高低层次（hierarchy of competitive vigor），这种差异最终可能驱动运动单位大小的差异——竞争优势强者保留更多纤维、形成大单位；劣势者保留较少、形成小单位，由此可形成大小差异的运动单位库，为大小原则提供发育基础。

54.12 突触神经胶质的作用（The Role of Synaptic Glia）

NMJ 上有胶质包被：一组"终末"Schwann 细胞与终末神经分支相关联，其功能已成为若干研究的对象。这些终末神经胶质是否真的重要？是否提供对突触维持至关重要的支持？回答这些问题最直接的方式是删除这些细胞。可通过基因敲除一种对其早期存活重要的神经营养信号（如 Neuregulin-1）来阻止它们的形成（Jaworski & Burden 2006 J Neurosci；Woldeyesus 等 1999 Genes Dev；Wolpowitz 等 2000 Neuron）。若在出生前完成该敲除，运动轴突在与肌肉初次接触之后即撤回支配、小鼠出生时已死亡——这表明这些胶质（或沿神经走行的胶质）在 NMJ 形成之后对其维持起关键作用。Ko 等（Reddy/Koirala/Sugiura/Herrera/Ko 2003 Neuron）在蛙 NMJ 上用选择性结合这些细胞表面的抗体加补体介导的裂解做了"围突触"Schwann 细胞的删除实验。在成年动物中杀死 Schwann 细胞并不立即影响神经终末，但导致神经逐渐退缩、突触效力下降；在发育中的蝌蚪中此类消融导致神经终末不能生长。这些反应得到更近期实验的支持——后者（Feng & Ko 2008 J Neurosci；Peng 等 2003 J Neurosci；Ullian 等 2004 Mol Cell Neurosci）提示 Schwann 细胞表达对神经终末重要的因子（如 TGF-β1、神经营养素等）。

蛙与小鼠中的实验（Rousse & Robitaille 2006 Glia）还显示，胶质细胞"窃听"神经与肌肉之间的对话：Schwann 细胞具有嘌呤能与毒蕈碱受体，被 ACh 及作为共递质的 ATP 激活后可引起细胞内钙升高；这种钙升高可反馈到神经终末，改变重复刺激期间的递质释放性质。Schwann 细胞由此不是被动的绝缘或支撑组分，而是主动参与突触传递调控的"第三方"。

Schwann 细胞还在出生后突触消除中失去的运动轴突的移除中起重要作用（Bishop/Misgeld/Walsh/Gan/Lichtman 2004 Neuron）。在 NMJ 竞争中失败的轴突"撤回"到其母轴突中；通过活体成像 FP 表达轴突可以在消除期追踪该撤回过程。包裹失败轴突的 Schwann 细胞在该撤回中起主要作用：它伸出短过程，将轴突分割为小片段并吞噬这些片段，形成所谓的"轴突体"（axosomes）——Schwann 细胞因此参与了发育 NMJ 上被消除轴突的破坏。这把"突触消除"从单纯的神经元-神经元竞争扩展到神经元-Schwann 细胞三方互动。

54.13 Schwann 细胞在神经损伤后肌肉支配修复中的作用（Schwann Cells Play a Role in Repair of Muscle Innervation after Nerve Damage）

与中枢神经系统中的轴突不同，外周轴突在与其靶断开后可以再生。再生的一个主要因素是 Schwann 细胞的存在——它们支持外周轴突的再生，若移植到中枢神经系统也能起同样作用（David & Aguayo 1981 Science 显示外周神经片段移植到脊髓后可支持中枢轴突再生）。Schwann 细胞在损伤造成的神经间隙中伸出过程、形成一条通路，支持轴突再生进入神经的远端（Son & Thompson 1995a Neuron）。Schwann 细胞一般被限制在神经远端残段的神经鞘内，在此似乎起类似的生长支持作用。轴突退化后神经鞘持续存在所提供的引导作用解释了为什么运动轴突通常能重新长回肌肉内的突触位点。简单的挤压伤保留这种引导、轴突一般能回到其原始靶；而神经中出现间隙时，进入神经鞘的轴突很可能不再是原先穿入该鞘的那根（Nguyen/Sanes/Lichtman 2002 Nat Neurosci）。

Schwann 细胞还利用额外机制尝试恢复失神经纤维的支配，称为"萌发"（sprouting）——此处特指由肌肉内诱发的轴突生长（Son & Thompson 1995b Neuron；Kang/Tian/Thompson 2003 J Neurocytol）。例如，当肌肉部分支配受损时，剩余的运动单位开始萌发过程，长出去支配至少部分失神经的肌纤维；该生长沿 Schwann 细胞过程进行。这些过程从失神经突触位点处的 Schwann 细胞伸出、生长到邻近的 NMJ，并引导轴突回到失神经的位点。同一机制似乎在再支配中起作用，使支配某一位点的轴突能长到邻近位点。Schwann 细胞在此处的角色似乎是：使尽可能多的纤维被任何设法返回肌肉的轴突再支配——最大化再支配的覆盖范围。

综合来看，这些实验表明胶质细胞在维持与修复神经肌肉连接方面扮演重要角色。正如 NMJ 已教给我们大量关于突触本质、构建、运作与维持的知识一样，NMJ 也将进一步教给我们关于胶质细胞角色的知识——尤其是胶质与神经元之间跨细胞双向信号这一在 CNS 中也越来越受关注的主题。

本章个人批注

读本章最大的感受是：Lee 与 Thompson 把一个表面看起来"经典而静态"的突触样板讲成了一个层层剥开的发育生物学故事。NMJ 的教科书形象——一根神经纤维贴在一块肌肉的中间、一坨 AChR、一个椒盐脆饼形——其实是被四套独立的生物学过程同时支撑的：突触形成（agrin/MuSK/Lrp4）、突触前与突触后特化结构的对齐（层粘连蛋白-β2 反向聚集 VGCC）、活动依赖的输入竞争（多神经支配消除 + 缝隙连接去耦合）、以及 Schwann 细胞作为第三组分在维持、消除与修复中的多面角色。值得注意的是每一层都有清晰的实验范式：分子机制靠 knockout 与 cDNA 转染解决（agrin、MuSK、Lrp4、ChAT、Neuregulin），结构基础靠 EM 断层成像（beams/ribs/pegs），细胞动态靠 Lichtman 实验室的活体双色 FP 成像，胶质角色靠选择性抗体 + 补体介导裂解。四种工具的协同才让 NMJ 成为一个可以定量、可被遗传扰动、同时可在亚细胞尺度观察的研究平台——这本身就是一个对其他突触研究有借鉴价值的方法学样本。

第二个值得保留的洞见是"逆行信号"与"突触后决定突触前位点"：传统的化学突触观把突触前视为递质释放者、突触后视为被动接受者；NMJ 上 AChR 在神经到达前就被预模式化，层粘连蛋白-β2 反过来聚集 VGCC——这两件事合在一起颠覆了单向信号流的图像。这跟 CNS 中突触后神经元通过 scaffold 蛋白反向组织突触前活性区是同构的；NMJ 在这一点上提前给出了范式。

第三个不确定/待查点：老化 NMJ 的"突发性变化"——Li/Thompson 2011 引用为"submitted"，到 2012 年应该已经正式发表（猜测为 Li Y, Lee Y, Thompson WJ, J Neurosci 2011, 31, 16085）。书中其他几处"submitted"如 Schiaffino 综述应也已发表。下次翻 references 时核对一遍。其他相对薄弱的引用：McMahan 关于 pre-pattern 的具体引用（ref 23 是 1990 Cold Spring Harbor Symposia，原文是综述而非原始实验），原始 agrin 实验的早期文献需要单独追溯 McMahan 1978 J Physiol 与 Godfrey 1984 J Cell Biol 等。

最后，本章对我后续阅读的直接提示：NMJ 的研究范式（活体双色成像 + 遗传操控 + EM 断层）是接下来 chapter 60（Skeletal Muscle Fiber Types）与本卷后面章节会反复回引的工具。读 chapter 60 时若遇到"活动依赖的纤维类型匹配"，回头看本章 54.10（Muscle Plasticity Mediated by the NMJ）会立刻理解为什么"运动神经元的发放模式决定肌纤维类型"不仅是相关、而是 NMJ 本身功能延伸的结果。

与上下章的衔接（一段话）

从全书骨架看，本章处在 Part III Skeletal Muscle 的"接头端"。前一章 53 章刚刚讲完肌纤维内部的膜系统（T 管、SR、jSR、triad 等 EC-coupling substrate）——也就是 muscle fiber 自身如何把动作电位翻译成钙信号、进而触发收缩；本章 54 章则把镜头拉到肌纤维之外，讨论动作电位最初从哪里来——来自运动神经元通过神经肌肉接头（NMJ）的传递。一上一下，构成一个完整的"动作电位产生 → NMJ 传递 → 肌纤维膜系统 → 钙释放 → 收缩"链条。从编排意图看，Hill 等把 NMJ 放在 Part III 的最前面（相对于具体膜系统），是因为 NMJ 是研究整个肌纤维中诸多分子机制的"原型突触"——许多原则（突触后受体的聚集、突触前后特化结构的对齐、突触消除的竞争机制、活动依赖的可塑性）都最先在 NMJ 上建立，再被推广到 CNS。所以本章不只是 Part III 的一节预备，更是为后续讨论肌纤维内事件时不断回引的概念基础：clustering of AChR 的逻辑——agrin 触发 MuSK/Lrp4 信号级联——会与第 56 章（Resting Ca²⁺）和第 57 章（EC-coupling）反复交叉；NMJ 上活动依赖的输入消除与肌肉纤维类型的活动依赖调控（第 60 章）共享 Hebbian 思想。读完后，下一章第 55 章将进一步讨论"神经力学交互作用对肌肉功能与适应的控制"，把本章的神经-肌肉界面延伸到运动控制层面。