第 49 章：心脏再生的化学遗传学（Chemical Genetics of Cardiac Regeneration）

引言

作者开门见山地把心肌梗死（MI）放在进化论的坐标系里：哺乳动物心脏在漫长演化中只面对过妊娠、运动这一类的压力/容量超负荷，并因此演化出了"通过肥大来适应"这样一套机制（引 Hill & Olson 2008 N Engl J Med）；而 MI 这种"人为制造的现代病"在任何其他自然物种身上都不发生（引 Gaziano 2001 Heart Disease 教科书），所以心脏在演化意义上被"打了个措手不及"，并没有为"替换丢失的几十亿心肌细胞"准备现成的再生程序。尽管如此，作者指出当前的共识（曾有争议）是：成年哺乳动物心肌仍能以极低水平产生新的心肌细胞，至少够维持稳态更新（引 Hsieh et al. 2007 Nat Med 遗传谱系示踪；引 Bergmann et al. 2009 Science 用冷战时代大气 ¹⁴C 测人类心肌更新）。问题就变成：如何把这种"低水平"机制放大成"robust"的心肌修复——是重建肌肉替代瘢痕，还是在两者之间取得功能性的折中——这是再生医学最大的挑战之一（图 49.1）。成年心脏能把梗死区迅速转成能承受高压的纤维化瘢痕以避免致命的室壁破裂（引 Weber et al. 2008 J Am Coll Cardiol），但这层纤维化对真正的肌肉再生也可能是一道障碍；而修复性成纤维细胞的来源、成年心脏驻留的祖细胞样群体在纤维化/修复/肥大中的具体角色都还是未解的题目（引 Castellani et al. 2005 Cardiol Young），尤其在"想用药物偏向肌肉再生而抑制纤维化"时，这些知识空缺必须先填上。在细胞层面，作者赞叹早期发育期的心肌细胞即便已经功能分化仍能持续分裂、能在细胞分裂的同时拆装肌节和其他细胞结构（引 Von Harsdorf 2001 Heart）——这种能力如果能被借用，对修复大面积 MI 所需的几亿乃至几十亿新心肌细胞至关重要；但困难在于梗死心脏不能"停工"等着修复，反而要更努力代偿损失；并且新生成的心肌细胞必须和已有肌肉整合，否则无论来自内源还是外源都会带来致命心律失常的风险（引 Chen et al. 2010 Circulation 关于细胞治疗电生理挑战）。第二个核心概念是：真正有用的修复不只是造出新的心肌细胞（心肌的"主力细胞"），还要给新组织供血。心肌是体内血管最密集的组织之一，按正常生理每个心肌细胞对应 3-4 根毛细血管来满足代谢需求，缺血的心肌细胞哪怕是新生的，也比成纤维细胞更危险——因为它们的致心律失常潜力更大；所以"angiogenesis 必须和 cardiogenesis 同步进行"。作者顺笔提到大脑里有一个 angiogenic niche 用于成年海马齿状回的神经发生（引 Palmer et al. 2000 J Comp Neurol），神经干细胞在萌芽中的微血管旁分化、成熟；相应地，成年哺乳动物心脏如果要真正实现肌肉重建，也需要一个 angiogenic niche 把心肌生成和血管床形成耦合起来。再生心脏病学的核心困难就是：我们其实对"如何造出心肌细胞"还不够懂。增强祖细胞的分化/扩增、修复损伤后的微环境、刺激新生细胞的功能整合，听起来都顺理成章；但是当前对"可药性靶点"的认识仍很有限——这和"心肌分化转录调控层级已经画得极为精细"（引 Olson 2006 Science）的鲜明对比是个尖锐的对照。最先进的定向分化工作例如 Takeuchi & Bruneau 2009 Nature 用 GATA4+Tbx5+染色质重塑蛋白 BAF60c 在小鼠胚胎中诱发出异位心肌分化，以及 Ieda et al. 2010 Cell 用 GATA4+TBX5+MEF2c 三因子从出生后心脏和真皮成纤维细胞诱导出心肌样细胞，证明"从有能力的细胞确实可以引导出心肌"，但发育研究的焦点几乎全在转录因子（引 Mercola et al. 2011 Genes Dev；引 Noseda et al. 2011 Circ Res）——而转录因子通常不被认为有药；类似地，后基因组时代基因、蛋白、非编码 RNA 测序加计算建模已经列出了"可能参与心肌再生"的蛋白长名单（引 Arrell et al. 2007 Clin Pharmacol Ther 提出的 pharmacoproteomics），但如何从中筛出真正可药的目标仍是悬而未决的问题。因此作者说：尽管分子元件和心肌发生的遗传机制不断被阐明，但"找到能驱动治疗性再生的药物靶点"仍然是一个令人生畏的挑战。在他们看来，生物学家相信对干细胞模型做高通量实验操控可以揭示再生机制的深层逻辑；因此他们下面要讨论小分子筛选和靶点鉴定策略如何被用于探索心脏干/祖细胞生物学、目前方法的成就与局限、以及更新现有"化学遗传学"范式的潜在路径。核心论点是：化学手段调控心脏修复和再生将成为心衰治疗的新前沿，它将提供一种系统层面的再生理解，从而为新药开发带来新靶点。

小分子与干细胞：不完备世界里的完美搭档

作者回顾过去半个世纪制药业产出了大量对寿命和生活质量影响巨大的新药（引 Kaye & Krum 2007 Nat Rev Drug Discov 提到"心衰药物发现是否走到了尽头"的反思），这一过程的副产物是产出了大量筛选技术、专业知识和化合物库，加速了生物活性小分子作为复杂细胞生物学探针的长期应用。事实上在 NIH 院长 Elias Zerhouni 推动下，NIH 资助了 Multiple Libraries Probe Centers Network（MLPCN）——一个专门开发小分子探针的学术中心联盟。针对心脏再生设计的"新"筛选大多数是表型筛选（phenotypic screening），即读出细胞或整只动物（斑马鱼、果蝇）的形态、行为或生理。在这类筛选中，小分子可以作用于许多蛋白中的某一个（或多个）来诱发期望的表型；表型筛选加上去卷积（deconvoluting）以确定细胞内靶标，被称为"化学遗传学"（chemical genetics，图 49.2），是借类比经典"正向"遗传学通过诱变来无偏评估基因组（引 Stockwell 2000 Nat Rev Genet）。化学遗传学原理上既能揭示复杂表型背后的关键蛋白，又能规避经典遗传学"两个结构相似的同源蛋白可以逃过单基因突变"的问题；它和制药业常规的药物发现也不同——后者通常针对已知靶点、用超大库筛，而化学遗传学用更复杂的表型实验对较小化合物集合做筛选，目的是破解基本生物学机制，并预期为传统药物发现过程贡献靶点信息和机制洞见（图 49.3）。表型筛选成功的例子很多：斑马鱼背腹轴形成筛选发现 dorsomorphin，能抑制 BMP I 型受体 ALK2/3/6（同时强效抑制 AMPK）（引 Yu et al. 2008 Nat Chem Biol）；细胞层面对有丝分裂异常的筛选发现 monastrol，针对马达蛋白 Eg5，是有前景的抗肿瘤候选（引 Sachinidis et al. 2008 Comb Chem High Throughput Screen；引 Wheeler & Brandli 2009 Dev Dyn）。这些都说明小分子可以在器官或细胞层面调控关键发育通路并被开发为机制探针。然而从筛选命中走向"意料之外的靶点"的鉴定，目前仍高度依赖运气，原因有二：其一，找出与生物活性小分子结合并介导其效应的细胞蛋白极难；其二，现有库实际能靶向的蛋白组只占很小一部分。化学空间虽然本质上无限大，但只有一小部分既可合成又有可能成为好药（引 Lipinski & Hopkins 2004 Nature）；在这个宇宙尺度的化学空间里，药物化学家只关注"ADME 性质和类药性"与"和高亲和力功能性结合特定靶点类别"两者的交集，筛选库因此集中在针对酶、GPCR、激酶、核受体、离子通道等有"拓扑定义结合口袋"蛋白的类药化合物上（引 Overington et al. 2006 Nat Rev Drug Discov），结果许多生物上极有意思的信号蛋白和结构蛋白仍无法被探及（引 Stockwell 2004 Nature；引 Crews 2010 Chem Biol）。人类蛋白总数（含剪接变体、翻译后修饰和体细胞突变）估计超过 100 万（引 Jensen 2004 Curr Opin Chem Biol），其中估计可药靶 3,000–10,000 个虽然仍远多于目前药典覆盖的约 500 个靶点（引 Overington et al. 2006；引 Meisner et al. 2004 Curr Opin Chem Biol），说明扩展可药蛋白空间可行且值得追求。筛选库大致分两类：多样性库（diversity-oriented）意图结合多种蛋白类别、用于靶点未知的筛选，缺点是每个分子命中的概率低（Stockwell 综述有详尽讨论）；聚焦库（focused）则针对特定可药靶点类别、按"能结合特定蛋白的化学拓扑"知识构建，例如激酶抑制剂库就被用于心肌分化的化学遗传学研究（引 Willems et al. 2011 Circ Res），缺点是能结合的蛋白范围天然受限。应对传统库局限的策略包括：通过小分子把目标蛋白送到细胞自身的蛋白处理系统（溶酶体或蛋白酶体）来选择性灭活大量单个蛋白（引 Schneekloth & Crews 2005 Chembiochem）；以及构建针对特定表型活性的"生物活性空间"库——结构和活性的相关性已经在 60 个肿瘤细胞系表型抗增殖筛选中被关联起来（引 Weinstein et al. 1997 Science），把这种思路用在诱导干细胞分化或改变心肌细胞生理上显然很有意义。细胞靶点去卷积最常通过生化亲和纯化（把化合物挂在固相基质上）来实现，敏感性常受限；新质谱技术（引 Rix & Superti-Furga 2009 Nat Chem Biol）使得"显著超越现有能力"成为可能，配合库的重新设计，"对蛋白组做完整化学遗传学筛选"这一难以企及的目标或许能逼近。还有一层更难的挑战：作为一类细胞，干/祖细胞"不喜欢药"——它们的一个标志性特征就是表达 Abcg2 这类多药外排泵（引 Zhou et al. 2001 Nat Med），把荧光小分子如 Hoechst 33342 外排后用 FACS 分选可以富集"侧群"（SP）细胞，涵盖来自多种组织、能在心脏中形成心肌细胞的干/祖细胞（引 Hierlihy et al. 2002 FEBS Lett；引 Martin et al. 2004 Dev Biol；引 Oyama et al. 2007 J Cell Biol）；"癌干细胞"概念也指出这类原始细胞对化疗耐药（引 Moitra et al. 2011 Clin Pharmacol Ther）。这些性质都提示需要为调控干/祖细胞专门生成一套"小分子工具箱"。

体外生物学系统用于心肌分化

心脏发育的化学遗传学需要一种生理相关、又对高通量/高内涵筛选（HTS/HCS）足够稳健的检测系统：HTS 用酶标仪对生化活性或基于细胞的读数（luciferase、eGFP）取单孔单值，HCS 基于高通量显微成像做图像分析，既可简单到只跑一个报告基因报告实验，也可以复杂到记录细胞对化合物的多种生理响应（图 49.2）。对分化或疾病特异性检测来说，干细胞分化体系对两种筛选都能做到稳健——对分化检测而言，拆解发育进程的每一步都很重要，原因不仅是聚焦于"驱动所需终点的分子"，还因为作者团队经验显示分化检测对"作用于检测窗口早期"的化合物最敏感。Sadek et al. 2008 Proc Natl Acad Sci USA 用带 Nkx2.5-luciferase 报告的 P19Cl6 胚胎癌细胞筛了约 15 万小分子，得到一类磺酰腙（sulfonyl hydrazone）能增强中胚层诱导——即心肌分化的起始步骤。两个研究组则基于 α-肌球蛋白重链（MYH6）启动子驱动荧光蛋白的体系在小鼠（引 Takahashi et al. 2003 Circulation）和人（引 Willems et al. 2011 Circ Res）ESC 中筛选：mESC 筛出抗坏血酸，因为其他抗氧化剂都无活性而它有，可能机制是选择性效应；hESC 筛聚焦于通路调节因子，发现低水平 Wnt 信号促进心肌细胞形成而对其他谱系无影响，阻断其他多个通路则不影响分化；Wnt 调节在筛选窗口的前 12 小时作用最大，晚期加入抑制剂则无效。这些例子说明"仅靠延长检测窗口"来找晚作用化合物大概不奏效，因为不先促进起始分化，到延长窗口的后段时 competent 细胞会越来越少；所以稳健的检测必须在窗口起始时把目标祖细胞群体放到尽量充足。表 49.1 总结了"诱导干细胞心肌发生"的代表性化合物，作者强调对成年心脏祖细胞——心脏再生筛选的"圣杯"——目前唯一的解决办法是从组织里纯化，还没有用过原代成年心脏细胞做筛选的先例。Qyang et al. 2007 Cell Stem Cell 筛了 1.5 万化合物对小鼠新生期 Isl1⁺ 心脏祖细胞（先在体外分离扩增）的作用比例，找到了两个未知化合物和 BIO（6-bromoindirubin-3′-oxime），后者是 GSK3α/β 的强抑制剂，模拟经典 Wnt 信号、稳定 β-catenin 并增强下游基因转录——和早期胚胎学指出的"Wnt/β-catenin 维持 Isl1⁺ 祖细胞处于增殖态直到它们被调用来构建右室和流出道"的结论一致（引 Lin et al. 2007 PNAS；引 Cohen et al. 2007 J Clin Invest；引 Klaus et al. 2007 PNAS；引 Ai et al. 2007 PNAS）。更晚期 hESC 和 hiPSC 祖细胞或心肌细胞作为起始材料高度理想，因为它们在结构与功能上类似成年心脏细胞，可视为再生所用的种子；可以用发育学、筛选或别的先验知识来设计祖细胞的大批量分化方案，再把分化产物送入筛选。表 49.1 详细罗列了丁酸/视黄酸透明质酸混合酯（glycoconjugate，机制未知）、BMP（P19 EC 诱导分化）、bFGF（P19 EC 受体激活）、淫羊藿苷（icariin，机制未知，在 mESC 和脂肪源干细胞中分化）、cAMP（次级信使，mESC 分化）、一氧化氮（次级信使，mESC 中促进心肌发生，Kanno et al. 2004 PNAS）、XAV939（Wnt/β-catenin 抑制剂，Wang/Hao 2011 ACS Chem Biol；Willems/Ren 等多组同时报告）、IWR（Wnt 抑制剂，人 ESC）、5-氮杂胞苷（DNA 甲基化阻断剂，P19 EC）和 5-氮杂-2′-脱氧胞苷（人 ESC）、Cardiogenol-C（P19 EC，可诱导毛囊隆起祖细胞转分化为心肌样细胞，机制未知）、抗坏血酸（必需营养素/维生素，Takahashi et al. 2003 Circulation，Xu et al. 2002 Circ Res 同步工作）、isoxazolyl-serine（结构上与 PPAR 激动剂相关，Wei et al. 2004 J Am Chem Soc）、丁酸钠（HDAC 抑制剂，P19 EC）、环孢素 A（calcineurin 抑制剂，诱导并增强小鼠和人 iPSC 心肌分化，Fujiwara et al. 2011 PLoS One）、Dorsomorphin（BMP 信号抑制剂，Hao et al. 2008 PLoS One）、视黄酸（受体激动剂，加速 mESC 心肌分化并促进心室肌细胞发育，Wobus et al. 1997 J Mol Cell Cardiol）、ITD-1（二氢吡啶类化合物，介导 II 型 TGFβ 受体降解促进 ESC 心肌发生，Willems et al. 2012 Cell Stem Cell 已接收）、催产素及其 Gly-Lys-Arg 衍生肽（受体激动剂，Paquin et al. 2002 PNAS；Fathi et al. 2009 Int J Cardiol；Danalache et al. 2010 PLoS One）、强啡肽 B（核内阿片受体激动剂，耦合核内 PKC 激活与心肌基因转录，Ventura et al. 2003 Circ Res）、Geum japonicum 提取物（机制未知，作用于 C2C12 成肌细胞分化和心肌修复，Li et al. 2006 Clin Chem，具有促血管生成和成肌双重效应）、DMSO（P19 EC 诱导分化，机制未知）；以及 GATA4/Tbx5/BAF60c（三因子在小鼠中胚层转分化为心脏组织，Takeuchi & Bruneau 2009 Nature）、GATA4/Tbx5/Mef2c（在小鼠成纤维细胞中直接重编程为功能心肌细胞，Ieda et al. 2010 Cell）、Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc（在小鼠成纤维细胞中，Efe et al. 2011 Nat Cell Biol）等基因手段。作者强调表 49.1 实质上囊括了从糖结合物、生长因子、cAMP/NO 等第二信使、表观重塑剂、受体激动剂/抑制剂到转录因子组合的"全谱"——这一清单本身就是"化学遗传学在心脏分化领域 20 年积累的体现"。

生理学筛选

作者指出，在细胞身份和形态之外，"细胞生理行为"——包括心肌细胞行为——也已开始可被直接筛选，一个近期最可能的应用是筛选药物的心脏毒性和致心律失常效应。药物诱发的心脏毒性难以预测（引 Hoffmann & Warner 2006 J Pharmacol Toxicol Methods 综述）：上市后撤市估计每年要花 25 亿美元，开发过程中的失败同样推高药物开发成本（引 Qian & Guo 2010 Toxicol in Vitro；引 Denning & Anderson 2008 Drug Discov Today）。近年大多数失败和致命性室性快速心律失常相关，包括罕见的尖端扭转型室速（TdP）。TdP 通常与 QT 延长、延迟整流钾电流（IKr）抑制相关，由 hERG（KCNH2）和 KCNE2 通道介导（引 Hoffmann & Warner 2006；引 Redfern et al. 2003 Cardiovasc Res）。早期发现中唯一足够高通量的检测聚焦于单通道（典型即 hERG），用肿瘤细胞系如表达 hERG 的 CHO 做自动膜片钳记录（引 Guth 2007 Toxicol Sci）；但心律失常的发生依赖多通道、细胞内信号乃至心室壁内不同区域的电生理差异（引 Hoffmann & Warner 2006；引 Antzelevitch 2004 J Electrocardiol），因此昂贵、低通量的组织或整体动物实验仍是安全药理学的标准。此外还有诸如某些抗癌药诱发心肌病等其他心脏毒性负担（引 Menna et al. 2008 Chem Res Toxicol）。若能自动化地使用人源干细胞分化的心肌细胞检测，则能以细胞检测的通量获得人源心肌细胞情境、推动开发早期化合物的评估（引 Braam & Mummery 2010 Stem Cell Res）。为克服非心肌细胞缺乏"心肌情境"的问题，作者们提出用新生大鼠心室肌细胞和人 ESC 来源的心肌细胞做细胞外场电位记录（引 Braam & Mummery 2010）；替代方法包括用荧光探针或 ICa 膜片钳测细胞内钙（[Ca²⁺]i）（引 Takahashi et al. 1999 Physiol Rev；引 Mattheakis & Ohler 2000 Drug Discov Today；引 Monteith & Bird 2005 Trends Pharmacol Sci；引 Komukai et al. 2010 Am J Physiol Heart Circ Physiol），或者直接可视化心肌细胞中的 Ca²⁺ 动力学——钙信号整合了通向肌肉收缩的电生理和信号事件（引 Clapham 2007 Cell；引 Gwathmey et al. 2009 Expert Opin Drug Metabol），作为评估药物诱发心脏毒性的理想体外模型。Cerignoli et al. 2011（J Pharm Toxicol Methods 已投稿）描述了一个高通量筛选平台，对 hESC/hiPSC 来源的搏动心肌细胞用荧光报告分子自动采集并分析 Ca²⁺ 动力学，达到早期药物测试和初筛所需的通量——它在每个视野内对所有细胞同时记录，并以细胞为单位分析结果，从而可以按动力学参数把单细胞或亚群门控出来做细节分析。在模型生物中成功建模再生、复杂生理和心血管病为"全生物体化学筛选"打开了门。果蝇幼虫甚至成虫长期被用于探索复杂生理和行为性状，例如最近一个遗传筛选把染色质表观修饰蛋白与心脏功能联系起来（引 Neely et al. 2010 Cell）；给药能模拟基因突变对心脏功能的影响，因此用果蝇建模心血管病并做化学筛选有吸引力，尽管其解剖和生理与人差异很大（引 Akasaka & Ocorr 2009 Method Mol Biol；引 Pandey & Nichols 2011 Pharmacol Rev）。斑马鱼则特别适合做全生物体化学遗传学筛选来探索心血管病和再生（引 Peal et al. 2010 J Cardiovasc Transl Res；引 Zon & Peterson 2005 Nat Rev Drug Discov）：一次产卵量大、胚胎对类药分子通透、幼体透明，对筛选有可观的实际好处。早期一个斑马鱼化学遗传学例子是发现两个化合物能抑制 gridlock 突变——后者造成背主动脉异常发育、类似主动脉缩窄并限制血流（引 Hong et al. 2006 Curr Biol；引 Peterson et al. 2004 Nat Biotechnol）。斑马鱼胚胎适合用生理读数做筛选——最近 KCNH2 突变斑马鱼被用于筛选小分子抑制剂（引 Peal et al. 2011 Circulation），该突变模拟人心脏动作电位时程延长等遗传性长 QT 综合征（LQT）特征，因此筛出的化合物对人类 LQT 治疗有相关性。1,200 个小分子的筛选中鉴定出 flurandrenolide 和 2-MMB；flurandrenolide 机制上通过激活糖皮质激素信号起作用，缺失糖皮质激素受体时挽救 QT 间期延长的能力被削弱。这些结果显示了全生物体筛选的潜力，但自动化程度不足使通量只到二级筛选或聚焦库初筛的水平。一个潜在障碍是胚胎/幼体到成人的转化；除了疾病模型的保真度外，"拯救疾病表型"可能反映的是发育期校正反应，而不是成熟细胞类型中的治疗反应。一个面向未来的挑战是把斑马鱼或其他模式生物用在筛选中探测基本再生机制。斑马鱼心脏再生已被深入研究（引 Poss et al. 2002 Science；引 Raya et al. 2003 PNAS）：过去以为它类似肢体再生——由"去分化的细胞形成芽基再分化"重塑组织（引 Lepilina et al. 2006 Cell）；但最近谱系标记研究给出强证据，斑马鱼再生心脏中的新心肌细胞来源于已有的成年心肌细胞自身、靠重激活细胞周期（引 Kikuchi et al. 2010 Nature；引 Jopling et al. 2010 Nature）。这意味着"较简单的鳍再生筛选结果不能直接外推到心脏"，必须直接筛选心肌更新。在哺乳动物中心肌细胞复制作为更新机制可能更不占主导，哺乳动物心脏更新主要被认为靠未成熟祖细胞的扩增和分化，证据来自小鼠 Cre-lox 脉冲追踪（引 Hsieh et al. 2007 Nat Med）和人 ¹⁴C 标记（引 Bergmann et al. 2009 Science）。因此除自动化损伤和再生检测的技术问题外，斑马鱼筛选可能并不探测"祖细胞介导的更新"这一更相关的过程。往哺乳类靠拢、其中驻留祖细胞可能发挥更大作用，新近工作提示新生小鼠可以研究心脏再生（引 Porrello et al. 2011 Science），可以动用遗传模型工具箱但也可能探测的是出生后成熟机制而非成年组织再生。

体外应用

作者强调小分子诱导剂的一个重要应用是"在体外可靠地生产替代生物材料和组织的来源"。原则上，体外来源可以是病人特异性的，并预期能克服供-受体不相容和随之而来的免疫抑制剂风险（器官和组织移植中必需）。这包括用生物活性小分子"预激"（priming）干/祖细胞，作为移植后疗效增强的辅助手段。原则上小分子可以被鉴定用来调控细胞治疗的多个关键方面：提高细胞存活、改善归巢和植入效率、诱导谱系特异的分化、或者限制干/祖细胞向不希望的（甚至危险的）方向分化的能力——这构成"小分子辅助细胞治疗"的核心作用面。代表性进展是 Fate Therapeutics 的 FT1050（16,16-二甲基前列腺素 E2）——在早期临床试验中用于促进脐带血造血干细胞在非清髓预处理后（治疗淋巴瘤、白血病等血液恶性肿瘤）植入成人患者体内（引 Cutler et al. 2011 Biol Blood Marrow Transplant）。这并非心脏临床试验，但作者特意在此节举出，意在说明"用一个小分子预激细胞再回输"的范式在造血领域已经先于心脏领域到达了临床——这给心脏再生小分子的"预激 + 细胞"组合疗法提供了一条已被验证的临床转化路径。

体内靶向生态位

如果治疗目标是动员内源干/祖细胞、扩增其数量并增强其功能以用于再生修复，那么用生物活性小分子药物靶向它们居住的特化生态位或微环境，至少在概念上是非常诱人的。这一思路最初在骨髓造血干细胞生态位（引 Scadden 2006 Nature）和癌干细胞生态位（引 LaBarge 2010 Clin Cancer Res）的背景下被利用；现在普遍认为针对生态位内维持干细胞更新和功能的机制有优势、即便具有挑战，并且已有一批生态位靶向的干/祖细胞治疗进入临床试验（见下）。然而成年心脏对生态位靶向治疗处于很大劣势，因为内源干/祖细胞生态位的身份和功能仍了解很少且高度争议。成年脑在这方面是"冠军"——它有明确解剖结构如海马齿状回，神经干细胞在那里定居并每天产生数万个新生神经元（引 Miller & Gauthier-Fisher 2009 Cell Stem Cell）。在心脏，间质小岛（引 Urbanek et al. 2006 PNAS）和损伤激活的心外膜（引 Smart et al. 2011 Nature；引 Popescu et al. 2009 J Cell Mol Med）是功能性干/祖细胞生态位最有希望的候选；心外膜在损伤反应中细胞数量和复杂度都大幅上升，因此可能成为选择性药物靶向的理想组织。几个针对小分子和生物性干细胞调节剂的人体临床试验正在进行：仅举一例，Brain Cells Inc.（www.braincellsinc.com）正在加拿大对 BCI-540（coluracetam）开展针对重性抑郁和焦虑障碍的 II 期临床试验（Clinicaltrials.gov NCT00621270），其化学结构和机制未公开，在体外对人神经干细胞有神经源性活性、在体内直接增加海马神经发生——这被认为是其治疗作用。增加海马神经发生之所以是稳健的靶点，是因为成体神经发生每天都在持续、且在动物模型中容易量化。最近一项大胆的"在体"发现实验通过活体小鼠化学筛选来识别小分子干细胞调节剂——Pieper、McKnight 等人在该标志性研究中用 Alzet 微量泵把 1000 多个有机化合物以池的形式直接输入脑脊液，找能增强成年小鼠海马神经元形成的化合物（引 Pieper et al. 2010 Cell）；领头分子 P7C3 被证明能增强成年海马神经发生、预防老化伴随的认知能力下降，机制是保护新生神经元免于凋亡。截至目前只有一个分子——高分子量化合物"丁酸和视黄酸透明质酸混合酯"——被报道能在体内增强成年心肌发生、在大鼠心梗模型中介导心脏修复（引 Lionetti et al. 2010 J Biol Chem）。另一方面，两个候选的再生性重组生长因子已经进入心衰临床试验。基质细胞衍生因子 1（SDF-1，又称 ACRX-100）由 Juventas（www.juventasinc.com；NCT01082094）做 I 期临床试验，通过心内膜导管注射给药，作用机制是招募内源干/祖细胞到受损器官、促进血管新生、增强受威胁心肌细胞存活。重组神经调节蛋白（neuregulin，ErbB 受体酪氨酸激酶配体，能促进早期心肌细胞增殖，引 Bersell et al. 2009 Cell）在中国由 Zensun Sci. Tech. Co. Ltd. 进入心衰临床试验（NCT01214096）。作者指出，增加海马神经发生之所以是稳健的靶点，正是因为成体神经发生每天持续、且能在动物模型中直接量化——这种"可量化、持续发生"正是成年心脏再生目前所缺乏的。最后作者强调，这是基础科学和临床研究中重要而令人激动的方向，但正如引言所述，对"把哺乳动物心脏正常强健的纤维化-修复反应压向肌肉重建"必须保持现实预期。

展望

作者对把干/祖细胞生物学和合成小分子发现结合抱有高预期，认为这一结合将带来关于内源心肌再生的基本新洞见，并最终带来新一代"干细胞调节型"小分子药物以动员内源细胞恢复心脏结构和功能。细胞治疗的临床试验显示的获益都很"温和"、字面上就在检测极限的边缘（引 Wollert & Drexler 2010 Nat Rev Cardiol 综述）；可以说移植的细胞在通过旁分泌效应支持内源细胞存活、血管新生、可能的心肌细胞更新，而终究没有造出临床意义上足量的新肌肉。在他们看来，掌控内源干/祖细胞、并通过小分子药物促进组织再生，正契合人类对"不老"的执着追求；但让公众的感知和预期与科学现实对齐至关重要。心肌梗死下在跳动的心脏或中风下的脑中实现再生修复是项"里程碑"式任务、是遥远的临床目标；然而完全再生式修复未必是显著改善损伤器官功能和心衰患者预后所必需——小分子作为主要或辅助于细胞治疗的手段，预期将在未来治疗中扮演角色。再生是高度复杂的过程，我们对干/祖细胞中"运转着使其感受并响应局部微环境/生态位信号"的转录和表观调控机制仍有基本空缺；化学遗传学通过指向可药靶点，提供了一种"发现关于再生基本机制知识"的途径，可能作为进入传统制药管道的入口。

本章个人批注

这一章把"再生心脏病学"放到了一个非常清晰的化学-生物学框架里来定位：转录因子级别的发育遗传学（chapter 47 已经提过 Bmp/Wnt 层级）有图谱但转录因子不能药，化学遗传学不去问"哪个蛋白做这件事"而是从"哪个小分子能让细胞做这件事"反向回溯；它的优势是"蛋白去卷积仍依赖运气但范式本身可推广"。我特别注意到作者反复强调"成年心脏驻留祖细胞生态位的身份和功能仍未确定"——这与 chapter 39（mammalian myocardial regeneration）、chapter 48（cell therapy for cardiac disease）对 c-kit⁺/Sca-1⁺/Isl1⁺/cardiosphere 等群体的反复讨论形成对照：他们已经做了一轮临床试验（如 SCIPIO c-kit、CADUCEUS cardiosphere），但作者仍然说"我们真的不懂"——这等于在章节内对前面各章的"可成药祖细胞"叙事打了折扣。同时作者对"斑马鱼筛选"在心脏上的局限性有清楚认识——鳍再生和心脏再生的细胞来源根本不同（鳍的去分化芽基 vs 心脏已有心肌细胞重入细胞周期），筛选终点的对应物要选对；这是给"全生物体筛选时代"一个很好的提醒：模型系统的表型方便不等于其机制可外推到目标器官。表 49.1 是一个非常实用的"小分子-通路"对应表，XAV939/IWR 之于 Wnt、dorsomorphin 之于 BMP、5-氮杂胞苷之于表观重置、cyclosporin-A 之于 calcineurin/NFAT、视黄酸之于 RA 受体，构成一个可用于任何体外人源 iPSC 心肌分化方案的"工具箱"——它和 chapter 39 里讨论的内源再生机制形成内外对照。Ca²⁺ 成像做 hERG-TdP 安全性筛选那条线（Cerignoli 平台）我认为是这章最有产业应用前景的一节：把"心律失常源性"做成可高通量人源 iPSC 心肌检测能直接降低临床开发成本。整体感觉是"机制创新走在临床转化前面很远"，作者本人也反复强调公众预期要管理（"relentless hope for immortality"一句几乎是直白的科学传播劝诫）。

与上下章的衔接（一段话）

Chapter 48 走的是"细胞治疗"路线（把外源细胞打进去，c-kit⁺/BM-MNC/CD34⁺/cardiosphere/骨骼肌成纤维等），并坦承获益在检测极限边缘；Chapter 49 走的是"小分子药物"路线，目的是不引入外源细胞而是用化合物去调动内源再生或修复机制——这是同一根"再生医学"线索在干预方式上的一个根本性切换。作者在 chapter 49 的"展望"里也明确把 cell therapy 的"小但显著"获益和小分子辅助/替代治疗的角色联系在一起，作为延续同一未竟事业的另一种尝试。在位置上 Chapter 49 位于 cardiac regeneration（39）、cardiac fibrosis（29）、cell therapy for cardiac disease（48）之后、化学/药物发现语境之中，向后则衔接到 chapter 50 的"device therapy for systolic ventricular failure"——后者代表的是心衰治疗中"机械辅助"这一截然不同的传统路径，把"再生-药物-器械"三套治疗思路在这一节集中到了一起：再生追求"长出新肌肉"、药物追求"调控/动员", 器械追求"在不修复的前提下补偿功能"。作者对这种"把哺乳动物心脏强健的纤维化修复反应压向肌肉再生"的难度有清醒认识，这与 chapter 39 里 Beltrami、Oh、Messina 等论文讨论的内源再生证据共同构成 book 对"再生是否可达"这个问题的两极化叙述。