第 12 章：整合基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学及其他组学（Integrating genomics, transcriptomics, proteomics, metabolomics, and other omics）
引言（Introduction）
随着高通量 DNA 与 RNA 测序(RNASeq)、大规模蛋白质组学与代谢组学测量技术的成熟,将不同组学层级数据联合分析以获得更完整生物学图景的研究范式逐渐形成。每一组学层级可产出多种类型的数据:基因组数据可刻画单核苷酸变异(SNV)、插入缺失(Indel)、DNA 甲基化、结构变异与拷贝数变异;转录组数据涵盖 mRNA 与非编码 RNA(包括 lncRNA、miRNA 等)、可变剪接转录本以及基因融合事件;蛋白质组学能识别并定量蛋白质,并可检测翻译后修饰(PTMs)——一类在蛋白质合成后发生的化学修饰,深刻影响蛋白功能、定位、稳定性与互作;代谢组学则测量代谢通路产生的小分子,其本身亦可调控 PTM 过程。综合起来,PTMs 及其调控为蛋白功能与调控提供了全景视角。最初的分析通常是非靶向的,当候选分子被收窄后再以靶向方法提升识别与定量精度。
近年来另一个层次的进展是单细胞分辨率的多组学测量。由于不同细胞类型对整体组织 RNA 水平的贡献各异,scRNA 等单细胞技术可分细胞成分获取信息;这类测量现已扩展至染色质可及性、空间位置,以及最近出现的单细胞蛋白质组、代谢状态与细胞表面蛋白水平,从而在每个细胞上同时获得多个层级。结合多组学分析的目标可以包括:将病例按分子特征分型、识别疾病因果通路、寻找候选药物靶点、发现用于风险评估/疾病进展/疗效监测的生物标志物。在像动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)这样复杂的领域,多组学研究仍处于相对早期阶段,在同一研究中同时涵盖所有或多个层级的情形仍属少见。
从基因到 mRNA、蛋白、代谢物,越是靠近疾病末端表型的层级,越同时承载遗传与环境双重影响——这也部分解释了为何代谢物、脂质与蛋白测量在历史上更易形成较好的生物标志物(如 Lp(a)、hsCRP、血脂谱)。基因组序列本身在生命周期内基本保持稳定(肿瘤等体细胞疾病例外);而其他层级乃至表观基因组均受环境左右,会随昼夜节律、季节变化以及生活方式和环境暴露而波动。对于 ASCVD 这种复杂疾病,多组学分析有望成为揭示病因、寻找预防/治疗/监测方案的资产;进一步纳入生活方式、临床参数乃至影像数据,可能形成更大优势。
多组学数据整合的挑战（Challenges in integrating multiomic data）
尽管多组学分析前景广阔,该领域仍面临一系列挑战。基因组序列在生命周期内相对稳定,可在动脉粥样硬化等疾病中测量一次;而表观基因组、转录组、蛋白质组、代谢组均随时间变化,反映遗传与环境双重影响。一般而言,一个基因对其编码的 RNA 与蛋白水平有相当贡献,但遗传与环境因素可修饰该表达及下游代谢物层面的效应,这些改变既可能源于昼夜节律、衰老等正常生理变异,也可能源于动脉粥样硬化进展或糖尿病等危险因素造成的异常修饰;多种环境损伤可加速心血管老化与动脉粥样硬化进程。然而,鉴于高昂的成本与人力,实际检测通常仅实施一次。
获取与疾病最相关的组织在可行性上也并非易事。对动脉粥样硬化而言,动脉粥样硬化斑块是主要病变组织,肝脏、脑、肾脏、骨髓亦受累及,但因取材困难,大多数研究仍以血液或血液成分为系统样本。组织处理可引入人为误差,前分析变量(preanalytical variables)需特别关注。
每一组学技术均有其自身的挑战与局限。代谢组学与蛋白质组学中的分子识别尤为困难——例如蛋白质组学中蛋白变体可干扰鉴定,若能获得基因组数据则可借由蛋白差异由基因组预测来辅助解决。高丰度分子的存在亦会影响结果:在蛋白质组学中,去除高丰度蛋白时可能随机损失其他待测蛋白。在转录组学中,"未取到计数"既可能代表无表达,也可能代表表达低于检测限;而在非靶向蛋白质组学中,这可能意味着蛋白未被高置信度鉴定。基因组数据方面,结构变异与拷贝数变异的检测技术仍在改进中,大样本量研究受限于成本;短读测序虽可用于此类分析,但假阳性率偏高。转录组学则面临比对、可变剪接转录本处理以及参考基因组/转录组版本变更等问题;对可变剪接转录本表达的解析至今仍是挑战,常用的"以最长转录本推断遗传变异对蛋白序列的影响"的假设,在疾病相关组织中可能与真实情形脱节。
并非所有分子都会在 RNA 与蛋白水平同时被检测到。RNA 测序可涵盖数以千计的基因,而蛋白质组与代谢组的高置信度测量通常仅覆盖数百个分子;通路分析可辅助识别受扰的生物过程。数据缺失也是常见问题:基因组数据有时可借助连锁不平衡模式进行填补,但伴随错误填补的风险。处理缺失数据的三种主要方法各有挑战:(i) 直接剔除含缺失的样本或变量——操作简单,适用于任何机器学习方法,但引入选择偏差并加剧样本量本就偏小的医学难题;(ii) 仅采用允许缺失值的模型——最强大但方法选择受限;(iii) 以 k 近邻(k-NN)或生成对抗网络等算法填补缺失——保留样本量并给出无偏均值估计,但可能引入异方差性,使填补组的方差被低估,从而引发假阳性。
不平衡数据集或完全分离的情形也需特别留意——例如在家族性高胆固醇血症等强遗传效应情形下,某些变异可能仅出现在病例组。对此可使用 Firth 逻辑回归、Lasso/Ridge 惩罚方法或精确逻辑回归;在小样本场景下,决策树、随机森林与支持向量机等方法也是选项。
出乎直觉的是,不同组学层级之间的相关性往往较差——例如 mRNA 与对应蛋白水平之间常不呈强相关,其原因既包括转录后与翻译后调控步骤,也包括测量灵敏度与精度的差异;蛋白的翻译后修饰还会影响其功能及代谢物水平。直觉上收集更多层级数据会带来独立信息,但 Li 等人对癌症生存预测的多组学整合研究显示,仅 mRNA 或 mRNA 联合 miRNA 已足以达到良好预测;纳入更多数据类型往往导致性能下降,提示多组学整合策略需慎重设计。
用药也是一个常被忽视的关键因素。在动脉粥样硬化研究中,相当比例的病例在使用他汀类药物降胆固醇,这不仅影响代谢物水平,也影响基因表达;但当前在转录组学研究中通常并未纳入这一变量,合适的处理方法仍属欠缺——若做亚组分析,样本量将进一步缩小。问题更复杂之处在于,遗传变异可影响他汀的效应,故同一用药人群的转录组变化也并不一致。
多组学数据本质上属于高维数据,测量数通常远超样本数,即所谓"维数灾难":机器学习模型易过度拟合噪声、泛化能力下降;在高维空间中数据点趋于稀疏,使依赖距离度量的算法(如 k-NN、聚类)效能受损,需要谨慎选择距离度量。
样本的代表性是确保结论可外推的关键。两类重要因素是生物性别与族群——二者已被证明对疾病发病率、生存率、药物反应、分子通路与表观遗传等方面均有影响。男性与女性在动脉粥样硬化病因及对传统危险因素的反应上确存差异,有必要在分析中纳入性别因素并按性别分别呈现结果。然而,大型数据分析中对此关注仍显不足——Ramirez 与 Hibbert(2018)对 2006–2016 年间发表在美国心脏协会旗下期刊的 771 篇动脉粥样硬化及其他血管病学前临床文章的统计显示,10 年间不到 25% 的研究同时纳入了雌雄两性;动脉硬化、血栓与血管生物学杂志(ATVB)编委对 2017、2018 年发表文章的回顾进一步证实,纳入两性研究比例分别为 21% 与 28%。
族群方面,尽管基因组序列相对稳定,其变异仍随族群而异,并影响其他组学层级。若不校正人群分层,将引入偏倚——不同族群间在复杂疾病患病率与药物反应上存在差异,该现象在癌症中已得到充分证明,在心血管疾病中亦观察到跨族群差异,即使校正了社会人口学、生活方式、环境与临床因素后仍然存在。族裔多样性的重要性早被认可,但许多组学数据库中族群代表性仍显不足,大多数组学研究仍以欧洲血统人群为主:例如 Fatumo 等人发现超过 85% 的基因组学研究是在欧洲血统个体中开展;Breeze 等对国际人类表观基因组联盟(IHEC)公开数据集的分析显示,仅 42.7% 的实验报告了任何种族或族群信息,其中 87% 被标记为"欧洲"。
单细胞数据的多组学分析亦有其自身复杂性。数据整合方法因同细胞(matched)或异细胞(unmatched)数据而异;尽管可借助上千乃至百万级细胞来降低单细胞组学的噪声与稀疏性,识别疾病相关细胞类型与状态的挑战依然存在。除技术层面的挑战外,基因组与转录组数据具可识别性,带来隐私顾虑,影响数据共享,而共享对复杂疾病研究至关重要。
总体概念（General concepts）
高通量测序与微阵列等先进技术的进展,为包括动脉粥样硬化在内的复杂疾病研究带来了"大数据"。一个组学层级的数据可与另一层级的整合程度与方式多样。低层级整合上,例如转录组数据的 eQTL 分析常与 GWAS 的基因信息叠加,考察两类信号是否存在共定位;染色质状态或可及性数据亦有助于解释遗传变异的功能性。
多组学整合分析方法大致分为三大类(详见 Ch13):早期整合(将各层级拼接为单一大矩阵)、中期整合(对每层独立或联合进行变换)与晚期整合(对每层单独建模后将预测合并)。整合过程中通常需要考虑批次效应并进行归一化(如 RNASeq 中按基因长度归一化)。常用的统计整合方法包括相关分析、典型相关分析(CCA)、稀疏多组典型相关分析(SMCA)、多因子分析(MFA)与偏最小二乘(PLS)等多变量方法、贝叶斯模型、矩阵分解、iCluster 等聚类方法,以及联合主成分分析等降维方法。
基于网络的方法是另一重要类别。生物分子作为节点、相互作用作为边,构建出基因调控网络、转录调控网络、蛋白-蛋白互作网络、信号转导网络、代谢网络与共表达网络等图谱;这一系统生物学方法正在被应用于心血管疾病领域,以揭示疾病的发展机制。机器学习方法可辅助应对多组学分析的复杂性。
稀疏多组典型相关分析（Sparse multiple canonical correlation analysis, SMCCA）
CCA 类整合方法因能在不同组学层级间寻找最大化相关的线性组合而广受欢迎。SMCCA 是 CCA 的扩展,专为高维数据设计,通过稀疏解仅保留最相关特征,便于解释并降低噪声。在 Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis(MESA)与 Jackson Heart Study(JHS)的蛋白与甲基化数据上的应用显示,该方法结合 Gram-Schmidt(GS)算法可改善典型变量(CVs)的正交性,减弱多重共线性并增强特征提取;典型变量显示出血细胞计数与蛋白丰度之间的显著关联,并在跨队列间具有可迁移性,使其成为跨族群识别生物学相关关系的强力工具。
稀疏偏最小二乘判别分析（Sparse partial least squares discriminant analysis, sPLS-DA）
sPLS-DA 在 PLS 框架下处理分类任务,继承 PLS 在大样本与共线性方面的稳健性,同时引入变量选择(对 X 数据集的载荷向量施加 lasso 惩罚)以聚焦最预测性特征;通过将响应向量转换为虚拟块矩阵,该方法可由标准 PLS 回归算法直接处理,避免多类场景下构建多个二元分类模型。性能评估通常采用重复交叉验证(5 或 10 折,50–100 次重复),以保证特征选择最优并避免过拟合。Jin 等人将 sPLS-DA 用于颈动脉内膜切除术患者低/高风险斑块段的蛋白与基因组成比较,通过 DIABLO(mixOmics)整合转录组、蛋白组与肽肽组数据,既支持完整多组学整合、亦具备模型内嵌特征选择能力,适合识别疾病特异性新型生物标志物,且能提供清晰的可视化。
核偏最小二乘（Kernel partial least squares, KPLS）
基于核的方法通过"核技巧"将原始数据映射到高维特征空间,以捕获组学层级间的非线性关系;核融合(KF)技术(包括基于 SVM 与 KPLS 的方法)表现尤为突出。融合 KPLS(fKPLS)模型通过遗传算法(GA)优化的方式将多个组学数据源的核组合成复合核,在癌症基因组图谱(TCGA)的三阴性乳腺癌分类任务中超越 SVM、LASSO 与岭回归等传统方法。多核学习(MKL)则为每个组学层分配不同核函数并以加权和整合:Briscik 等提出了两种新 MKL 方法,第一种将无监督整合算法与 SVM 相结合用于监督任务,第二种采用深度学习架构进行核融合;Seoane 等则将 MKL 应用于 METABRIC 乳腺癌数据,使用基因表达阵列、拷贝数变异与雌激素受体等不同数据类型构建基础核。
多组学因子分析（Multiomic factor analysis, MOFA）
MOFA 是一种无监督整合方法,通过潜因子识别跨数据类型的变异来源,将高维数据压缩为可解释的潜因子。Palou-Márquez 等人将 MOFA 应用于 Framingham 后代研究的 DNA 甲基化与基因表达数据,识别出 30 个潜因子,合计解释了两个组学层级中方差的显著比例;其中 4 个因子与心血管事件风险显著相关,大部分贡献特征由 DNA 甲基化驱动——揭示出炎症、内皮稳态与生活方式相关通路;特别是因子 21(仅与女性相关)指向炎症与细胞周期调控通路。将这些 MOFA 因子纳入 Framingham 风险函数等传统风险模型,可提升预测能力,尤其对识别高危女性有意义。
贝叶斯网络模型（Bayesian network models）
贝叶斯网络以概率图结构表示变量间依赖:节点可代表基因、蛋白或代谢物等组学特征,边代表概率依赖,强度由数据学习得到。这类模型擅长建模复杂因果关系与推断基因调控网络。例如在 GLOBAL(Genetic Loci and the Burden of Atherosclerotic Lesions)研究中,贝叶斯网络方法揭示了富甘油三酯 LDL 在动脉粥样硬化发生中的核心作用。
聚类方法（Clustering methods）
聚类方法基于多个组学层级属性的相似性将样本分组,可用于疾病亚型识别与生物标志物发现。iCluster 通过联合潜变量方法实现跨组学层级的聚类,已被应用于 DNA 拷贝数、甲基化与 mRNA 表达数据以识别乳腺与肺癌的分子亚型;iClusterPlus 扩展了可处理的数据类型(包含分类与连续变量),已用于肺腺癌的基因组、表观基因组与转录组整合分子分型与核心基因识别;iClusterBayes 进一步引入贝叶斯框架,提升统计推断与计算效率,用于识别癌症亚型与相关组学特征。
混杂因素（Confounders）
数据驱动分析的核心挑战之一是将与研究真正相关的模式与混杂模式区分开来。外部对照已被证明可有效消除小队列中的实验室间差异。尽管已有多种预处理工具与模型试图消除技术批次效应,若缺乏对照,能去除的实验室与技术差异程度仍受限;部分可通过来自大型医疗系统的、更大规模且无偏倚的队列加以弥补。考虑到多模态训练在其他领域显示出更强的稳健性,在生物医学领域也有望通过联合分析多种分子谱来使不同偏倚部分相互抵消。
病例分层（Stratification of cases）
识别疾病亚型对理解病因与制定针对性疗法或预防措施均至关重要。在癌症领域,基于肿瘤组织的分子检测已被用于指导治疗;在心血管领域,虽然早已识别出 ST 段抬高型心肌梗死(STEMI)与非 ST 段抬高型心肌梗死(NSTEMI)两类心肌梗死亚型(均引起肌钙蛋白等坏死标志物升高,但 ECG 模式与血栓程度不同,且复发倾向于同一亚型,提示存在因果差异),但对 ASCVD 的进一步细分仍属欠缺。多组学分析可基于分子特征识别亚型,提供分子层面的机制洞察,从而支持风险分层、新型生物标志物研发以及针对特定亚型的疗法开发。
传统上,通路内基因的过表达采用 GSEA 等工具评估,但这些方法存在局限:既不考虑生物学效应的方向与大小,也不识别通路内可能相互抵消或加剧的生物差异,且在小通路上易高估效应,当多个基因在不同通路中扮演不同角色时情形更为复杂。
多数用于患者分层的多组学整合方法在癌症领域得到开发与验证,包括一系列概率潜因子模型(部分结合贝叶斯变量选择与稀疏约束),以及低秩近似(对共享潜因子条件下的不同数据类型建立概率模型)、变分独立成分分析等现代降维方法。基于图的方法在患者分层的数据整合任务中持续提供当前最优性能;早期整合领域知识已被证明可显著提升分层的灵敏度与稳健性,尤其在信号噪声比较小的小队列情形下效果突出。
基于患者网络的数据整合（Patient network based data integration）
基于网络或图的方法已成为生物医学数据整合中的一类成功算法,应用范围从识别失调通路到优化生物工艺。其中相似性网络融合(SNF)是典型代表:将患者映射到图中(每个节点代表一名患者,边反映某数据类型下的患者间相似度),通过跨图层的消息传递式交叉扩散,将不同数据类型对应的网络合并,迭代更新以纳入所有层级信息,从而同时利用跨数据类型的互补性与跨患者的相似性,实现垂直与水平整合的结合。
为提升数据驱动方法在小队列中的适用性,需要克服相对偏低的信噪比。ViLoN 算法(Variation of Information fused Layers of Networks,www.vilon.net)引入了一种新型网络式多组学整合方法:从单个分子谱的差异效应分析起步,直接整合来自专家策划源的功能知识(包括 GO 数据库与 KEGG 通路注释),通过跨患者相似性构建多层网络,既可在功能模块层面探索,也可识别网络结构中临床相关的患者分组;在包含基因表达、甲基化与拷贝数的多种数据组合中,早期纳入领域知识提升了稳健性与灵敏度。该方法在 6 种不同疾病的独立队列中均优于既有分子分层方法与临床基线,在较小队列(直肠腺癌 90 例、食管癌 180 例)中尤为关键——其他方法在此类队列上均失败。SNF 类算法已在心衰亚型识别中得到成功应用,期待最新基于图的方法被引入该领域。另一类有用的网络方法是新途径富集:将多个组学层映射到分子互作网络上以识别与特定条件相关的功能模块与通路子网络,与依赖预定义通路列表的传统富集方法相比,因其不偏向研究最充分的疾病、基因与信号通路,更擅长揭示未知的疾病机制。
结论（Conclusion）
多组学数据整合在 ASCVD 领域仍处于早期阶段,目前尚无明确公认路径,但若干方法已显示出良好前景。许多挑战仍有待解决,改进空间显著。值得指出的是,目前大多数分析仍未充分考虑生活方式与环境的影响;未来有望纳入包含此类信息的多层数据,尽管完全覆盖并不现实。
可视化方面也有相当改进空间。即使在同一组学层级内,可视化亦颇为复杂——开源软件 Cytoscape 是常用工具,可通过 STRING 等数据库插件展示生物网络;Omics Visualizer 则允许以彩色饼图或环形格式可视化指向同一节点的多个数据行。但能帮助洞察单层与跨层复杂性的可视化工具仍属欠缺。
随着临床中匹配的分子谱数据日益积累,跨数据类型的整合分析应用正快速增长。然而,真正进行整合分析的研究发表仍是少数,占比甚至在下降——其原因部分在于此类分析的更高复杂性,以及现代数据驱动算法(如概率模型与深度神经网络)对数据集特征的高度敏感性;由此产生的挑战已被识别为"领域偏移(domain shift)"问题:即便成熟方法在与其原始训练队列显著不同的新疾病或队列上也可能失效,凸显了开展全面系统化基准研究的必要性。
多组学研究的样本与数据采集、存储、处理涉及巨大投入,尤其需要重视前分析变量。数据共享对最大化研究潜力至关重要:在心血管领域,大规模数据集向 European Genome-Phenome Archive 与 dbGAP 等中心门户的递交,以及允许对存放在多处敏感数据进行安全分析与查询的联邦式数据分析,将在未来增强共享可能。Federated European Genome-Phenome Archive(FEGA)是这一方向上的里程碑。这些努力对推动领域发展与临床转化至关重要。
本章个人批注
本章是 Ch8(转录组学方法)与 Ch13(AI/ML 多组学)、Ch14(基因调控网络)之间的过渡章节,核心议题为"组学层级的横向整合"——与前面 Ch3–Ch7 偏纵向(特定分子家族)、Ch8 偏方法本身的叙述不同,本章更接近系统生物学视角下"如何在数据层面拼出全景"的元问题。Alexiou 等的写作策略是先抛出整合的"为什么"——ASCVD 复杂表型与多层级病因——然后系统列举挑战(技术、统计、人口学、隐私),再介绍主要整合方法的家族(统计、机器学习、网络),最后回到临床转化语境。
阅读中需要警惕几个源文中隐含的"知识诅咒"。其一,"加入更多层数据提升预测性能"这一直觉被 Li 等人的癌症基准工作明确否定——但作者并未在 ASCVD 上做同等规模基准,直接外推到 ASCVD 略显冒险。其二,关于多组学相关性的"差",Ghazalpour 等的小鼠对比研究虽然经典,但跨物种、跨组织外推到人类动脉粥样硬化斑块时仍属间接。其三,作者将"性别"与"族群"作为代表性的两个维度,但实际上这两类偏倚常被混在一起讨论——混杂的人群分层可能同时影响 eQTL 等层级的解读。
方法部分的一个观察是,SMCCA、sPLS-DA、KPLS、MOFA 这些方法家族都强调"跨族群可迁移性",这与上一节"族群代表性不足"的现实形成对照:工具有跨族群泛化的诉求,但训练数据来源却高度集中于欧洲血统人群,潜在的领域偏移可能影响实际效能。这一点作者在结论段亦承认,但分散在多处,容易让读者低估其影响。
与上下章的衔接（一段话）
本章前承 Ch11"性别偏倚转录组学机制"。Ch11 论证了性别作为关键生物学变量如何渗透至激素、受体、染色体与组织转录组各层面,但其论述以转录组为主、性别单维度为主;Ch12 将视野从单一组学层级(转录组)与单一生物学变量(性别)拓展至多组学整合与多元混杂因素(性别、族群、用药、批次效应),并系统梳理了统计、机器学习与网络三大方法家族。本章后接 Ch13"AI 与机器学习用于多组学"——后者将在本章方法清单的基础上深入展开早期/中期/晚期整合策略与具体的机器学习架构(深度学习、图神经网络等);再之后是 Ch14"基因调控网络"与 Ch17"循环 RNA 生物标志物",前者承接本章的网络整合方法,后者则将多组学策略落到无创诊断标志物的具体应用。整体而言,Ch12 是从"按生物维度纵切"章组(Ch3、Ch7、Ch11)向"按方法/计算维度横切"章组(Ch8、Ch13、Ch14)过渡的桥梁,也是连接上游生物学问题(Ch1–7)与下游临床转化(Ch15–18)的方法论中枢。