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第 9 章：弥合转录组学差距——从动物到人类动脉粥样硬化研究（Bridging the gap in transcriptomics: From animal to human studies in atherosclerosis）

引言（Introduction）

本章由 Loredan Stefan Niculescu 与 Dimitris Kardassis 撰写,开篇即指出:动物模型在理解动脉粥样硬化的分子病因与病理生理学中曾发挥关键作用。早期研究主要依赖兔类模型,继而小鼠登上舞台,后期扩展到其他物种。但作者将动脉粥样硬化动物研究的"大爆炸"(big-bang)定位到 20 世纪 90 年代初——彼时研究者首次通过胚胎干细胞中的同源重组技术敲除 apoE 基因与 LDL 受体基因,诞生了第一批真正意义上的基因工程小鼠模型。自此,小鼠及其他小型啮齿类(大鼠、仓鼠)主导了该领域,为动脉粥样硬化发生的机制和相关通路提供了大量洞见。

这一"动物模型爆炸"几乎与高通量组学方法(基因组学、转录组学、蛋白质组学、脂质组学、代谢组学)的爆发同步发生。组学方法现已成为生物医学研究的标准手段,与动物模型(尤其是小鼠)的可获得性相结合,催生了大量新生物标志物与致病基因——这些发现用"组学前"传统方法几乎无法获得。

作者明确本章的写作意图:首先概览已被广泛用于研究动脉粥样硬化机制的动物模型,聚焦于在这些模型上开展的转录组学研究;然后论证,虽然这些模型对临床前和机制研究非常有用,但其存在若干固有局限,因此必须建立新的、更可靠、更接近人体生理状况的体内(in vivo)动脉粥样硬化模型,以弥合动物与人类之间的鸿沟。

转录组学研究在动物模型中的应用：小鼠（Transcriptomics studies in mice）

作者系统综述了小鼠作为动脉粥样硬化模式生物的优势:生命周期短、后代数量大、饲养成本低,且易于遗传操作。小鼠是首个成功应用转基因与基因敲除技术的物种,因此被大量改造为具有不同遗传背景和疾病易感性的多品系。然而,作者特别强调一个重要事实:野生型小鼠(Mus musculus)天然对动脉粥样硬化高度抵抗——其血浆脂蛋白谱以 HDL 为主(因缺乏 CETP),VLDL 和 LDL 水平极低,这种"抗动脉粥样硬化"特性使其不直接适用于人类疾病研究。要让野生型小鼠获得类似人类的致动脉粥样硬化脂蛋白谱,必须借助遗传干预(转基因、敲除、敲低、敲入)或饮食干预。

本章重点介绍两个主导动脉粥样硬化研究的小鼠模型:LDLr⁻/⁻ 小鼠 与 apoE⁻/⁻ 小鼠。绝大多数转录组学研究都基于这两种模型之一,或由它们与其它基因敲除鼠杂交得到的双敲除品系。

LDLr⁻/⁻ 小鼠 因 LDL 受体基因全缺失,无法清除血液中含 apoB 或 apoE 的脂蛋白颗粒,导致血浆 LDL 水平显著升高(高胆固醇血症),与人类家族性高胆固醇血症(FH)的遗传缺陷相似。该模型的局限是:在西方饮食(western diet)诱导下,斑块主要在主动脉形成,而不像人类那样出现在冠状动脉;且几乎不发生斑块破裂及继发血栓形成。

针对 LDLr⁻/⁻ 小鼠的转录组学研究有多项代表性工作:

  • Hwang 等 [17]:对高脂饮食的 LDLr⁻/⁻ 小鼠 T 细胞进行 RNA-seq,研究维生素 D 处理对 T 细胞分化与信号通路的影响。结果显示 JAK-STAT、HIF-1 与钙信号通路存在显著差异,1,25(OH)₂D₃ 处理影响 MAPKKK 信号,Th1 细胞群显著减少,提示 1,25(OH)₂D₃ 具有抗炎作用。
  • Zhao 等 [18]:用 scRNA-seq 分析糖尿病动脉粥样硬化中的内皮细胞(EC),在内皮特异性 KLF11 转基因小鼠(背景为 LDLr⁻/⁻)和敲除小鼠中以含胆固醇的致糖尿病饮食(DDC)诱导。结果显示 KLF11 敲除加速动脉粥样硬化,转基因抑制其进展;RNA-seq 揭示 KLF11 缺失在糖尿病条件下促进内皮-间充质转化(EndMT)。
  • Schafer 等 [19]:在已形成动脉粥样硬化病变的 LDLr⁻/⁻ 小鼠中耗竭 CD8⁺ T 细胞,对主动脉平滑肌细胞(SMC)做 scRNA-seq,识别出收缩型 SMC 与一个表达巨噬细胞和成骨细胞相关基因的"调节型" SMC 簇。CD8⁺ T 细胞耗竭后该簇的收缩型基因签名增强,而体外 SMC 与活化 CD8⁺ T 细胞共培养则下调这些基因,提示 CD8⁺ T 细胞是病变进展中的潜在治疗靶点。
  • Hernandez 等 [20]:用 LDLr⁻/⁻ 小鼠研究父代高胆固醇血症对后代动脉粥样硬化的影响,发现父代高胆固醇血症刺激后代(尤其是雌性)内膜中 Ccn1、Ccn2 等促动脉粥样硬化基因;用新开发的 PANDORA-Seq 在高胆固醇喂养后检测到精子 tsRNA/rsRNA 谱改变(传统 RNA-seq 检测不到),提示精子小非编码 RNA(sncRNA)是父系高胆固醇血症跨代诱发后代动脉粥样硬化的关键介质。

apoE⁻/⁻ 小鼠 因内源性 apoE 基因缺失(apoE 由肝脏、巨噬细胞、脑等组织产生,主要功能是经肝脏 LDLR 清除 VLDL/IDL 与乳糜微粒残余),即使饲以标准饲料也出现高胆固醇血症与动脉粥样硬化,高脂饮食下加剧。其局限是:冠状动脉中不出现血栓性闭塞和心肌梗死,斑块破裂罕见,仅在头臂动脉和主动脉可观察到。

针对 apoE⁻/⁻ 小鼠的转录组学工作同样丰富:

  • Yang 等 [22]:对 apoE⁻/⁻ 小鼠早期/晚期、稳定/破裂斑块的表达谱芯片数据集做生物信息学再分析,识别出晚期 vs 早期斑块 96 个 DEG(92 上调、4 下调),破裂 vs 稳定斑块 838 个 DEG(173 上调、665 下调),两组重叠 29 个 DEG,KEGG 富集于趋化因子信号通路与金黄色葡萄球菌感染通路。
  • Zhang 等 [23]:对正常饮食与高脂饮食 apoE⁻/⁻ 小鼠做 scRNA-seq 与 bulk RNA-seq,发现高脂组主动脉弓 T 细胞、成纤维细胞、B 细胞比例下降,单核/巨噬细胞比例显著升高,内皮-平滑肌- T 细胞间相互作用增强;进一步敲低 FSCN1(组织 F-actin 成平行束的肌成束蛋白)可抑制动脉粥样硬化进展,提示 FSCN1 是潜在生物标志物与治疗靶点。
  • Chen 等 [24]:用 scRNA-seq 鉴定出一组新的"不健康"脂肪组织巨噬细胞(ATM,具脂质应激表型),并发现 ApoE⁻/⁻:Cd36⁻/⁻ 小鼠在高脂饮食下脂质相关巨噬细胞(LAM)增加,CD36 缺失通过促进 LAM 蓄积减轻白色脂肪组织炎症并增强脂质代谢。
  • Gutierrez-Munoz 等 [25]:对 apoE⁻/⁻ 小鼠主动脉转录组做 RNA-seq,识别 743 个 DEG(483 上调、260 下调),GO 富集于 T 细胞分化、适应性免疫与炎症反应;Annexin A8(AnxA8)是上调最显著的基因之一,功能实验显示其通过调控内皮-白细胞相互作用促进动脉粥样硬化进展。
  • Horstmann 等 [26]:对人颈动脉粥样硬化斑块做 scRNA-seq,发现 T 细胞系细胞占主导,与人/鼠 7 套血管 scRNA-seq 数据整合后识别出 51 种细胞类型与分化状态,其中部分仅见于人。作者指出小鼠与人类颈动脉粥样硬化的免疫细胞组成存在显著差异,这对标准小鼠模型在适应性免疫研究中的转化价值提出质疑。
  • Kim 等 [27]:用新建立的脂质染色流式分选方案从 apoE⁻/⁻ 与 LDLr⁻/⁻ 小鼠动脉粥样硬化主动脉中分离内膜"泡沫样"与"非泡沫样"巨噬细胞,bulk RNA-seq 显示两者 DEG 数量(580 vs 748)与表达谱(胆固醇/脂肪酸转运、胆固醇摄取、促炎/抗炎反应)不同;Cd36、Mertk、Nr1h3 等胞葬作用相关基因在泡沫样巨噬细胞中升高,Ccl2、Ccr2、Abca7 下调,而消退/回归相关基因在泡沫样巨噬细胞中上调。
  • Winkels 等 [28]:对正常饮食与西方饮食 apoE⁻/⁻、LDLr⁻/⁻ 小鼠主动脉白细胞做 scRNA-seq 与质谱细胞术,构建免疫细胞图谱,识别出 11 个具有不同表型与空间特征的动脉粥样硬化白细胞簇,脂质代谢、增殖与细胞因子分泌通路定位于特定簇;并通过多组学整合识别出 3 个 B 细胞亚群,其表面标志物、功能通路与体外细胞因子分泌发生改变。

转录组学研究在大鼠中的应用（Transcriptomics studies in rats）

作者指出,大鼠(Rattus norvegicus)由于体型大于小鼠,在动脉粥样硬化研究中操作更方便,但其遗传操作难度较高。最近用锌指核酸酶技术已成功构建 LDLr⁻/⁻ 大鼠,但需在 Paigen 饮食喂养 50 周后才能形成广泛动脉粥样硬化;同样技术构建的 apoE⁻/⁻ 大鼠 也需 64 周 Paigen 饮食才发展出广泛病变。Yang 等近期在大鼠大脑中脑动脉闭塞模型中识别了差异表达基因,并构建了与动脉粥样硬化性缺血性脑卒中发病相关的 circRNA-lncRNA-miRNA-mRNA 网络。

转录组学研究在兔中的应用（Transcriptomics studies in rabbits）

兔(Oryctolagus cuniculus)由于缺乏肝脏 apoB mRNA 编辑活性,动脉粥样硬化发展速度快于其他实验动物。野生型兔与 Watanabe 遗传性高脂血症(WHHL)兔均能发展为主动脉与冠状动脉粥样硬化,但两者血浆胆固醇升高的机制完全不同。其主动脉病变以内膜显著增厚、泡沫细胞和纤维成分为特征,组织学表现接近人类。然而,兔动脉粥样硬化病灶并未完全再现人类动脉壁特征,尤其是 WHHL 兔主动脉内膜缺乏 SMC,而人类内膜中存在由不同形态和来源的 SMC 构成的网络。兔模型的其它局限是:成本高、繁殖周期长、所需饲养空间大,且遗传操作比小鼠更困难。

兔模型的转录组学分析已识别出一个由多个 lncRNA 和 miRNA 组成的网络,可作为动脉粥样硬化进展的潜在生物标志物。Zhang 等对高脂饮食诱导兔动脉粥样硬化的 RNA-seq 谱做分析,构建了差异表达的 circRNA-miRNA-mRNA 三元网络,网络中的基因参与细胞黏附、细胞活化与免疫反应。Wu 等近期在兔颈动脉粥样硬化模型中分析了动脉粥样硬化相关的 lncRNA-mRNA 网络,基于 ceRNA(竞争性内源 RNA)机制生成了包含 lncRNA、mRNA、miRNA 的三元互作网络。

转录组学研究在仓鼠中的应用（Transcriptomics studies in hamsters）

金色叙利亚仓鼠(Mesocricetus auratus)的脂质代谢与人类有许多相似性——具备 CETP、PPAR 以及参与脂蛋白与胆汁酸代谢的完整酶系机制。类似于人类动脉粥样硬化斑块,高脂血症(HL)仓鼠晚期冠状动脉病变表现为细胞外未酯化胆固醇逐渐积累、钙沉积和坏死,部分小动脉分支完全闭塞。与主动脉病灶不同,冠状动脉内膜含更多 SMC 来源的泡沫细胞而巨噬细胞来源的较少。HL 仓鼠的其它优势包括:对高脂饮食的反应与人类相似(肝脏 LDL 受体依赖性清除率降低,血浆 LDL 升高),且高脂饮食可能通过提高 CETP 活性、降低粪便排泄损害 RCT;此外,仓鼠与人类在性别相关的血脂异常与动脉粥样硬化易感性方面也存在相似性(雄性更易感)。

与家兔类似,仓鼠基因组数据有限,目前尚未开展动脉粥样硬化病灶的转录组学调查。Barbalata 等近期用 microarray 在高脂饮食 HL 仓鼠组织中做 miRNA 表达谱分析,发现 miRNA 表达失调,在心-肝轴上呈特定分布。然而,HL 仓鼠转录组数据向人类的转化仍受限于脂质代谢在转录与转录后水平调控的知识缺口,这主要归因于目前缺乏完整的仓鼠基因组。

转录组学研究在斑马鱼中的应用（Transcriptomics studies in zebrafish）

斑马鱼(Danio rerio)因体型小、脂质代谢保守、发育快、体外受精、胚胎透明、实验操作简便,成为研究与高脂血症和动脉粥样硬化的优秀且经济的模型。已建立的高脂与动脉粥样硬化斑马鱼模型包括:高胆固醇饮食诱导模型、LDLR 突变模型、APOC2 突变模型以及 LXR 突变模型。

但针对动脉粥样硬化斑马鱼模型的转录组学研究数量仍很少。Ka 等报道了高脂饮食喂养斑马鱼的肝脏特异性转录组改变,并与对应小鼠的转录组做了比较。结果显示,虽然一些已知的人高脂血症风险因子在高脂饮食斑马鱼中上调,但斑马鱼肝脏转录组与小鼠共享的相似度并不高。鉴于斑马鱼与小鼠中受调控通路存在相似性,这些数据提示高脂饮食斑马鱼的转录组谱改变可作为研究人类高脂血症和高胆固醇血症等疾病的替代模型。

转录组学研究在猪中的应用（Transcriptomics studies in pigs）

由于心血管系统与生理机能更接近人类,少数大动物模型也被用于动脉粥样硬化研究。在猪(Sus scrofa)中,动脉粥样硬化可通过致动脉粥样硬化饮食诱导,或通过操控 PCSK9、APOE、LDLR 等脂质代谢相关基因实现。Ossabaw 猪(携带 PCSK9 功能获得性突变)在常规饲料下即显示高 LDL-C,经数月高胆固醇高脂(HCHF)饮食后 LDL-C 水平升至接近人类,并在右冠状动脉出现斑块。由 CRISPR/Cas9 得到的 apoE⁻/⁻ 猪在常规饲料下血浆胆固醇中度升高,经 HCHF 饮食后出现严重高胆固醇血症和主动脉、冠状动脉病变,与人类相似。LDLr⁻/⁻ 猪在常规饲料下也表现出明显高 LDL-C 与低 HDL-C,4 个月 HCHF 饮食后出现类似人类的晚期冠状动脉斑块。

猪动脉粥样硬化的转录组学研究同样较少。Takahashi 等用 HCHF 或 HCHFHS 饮食诱导小型猪高脂血症,对全血样本做 microarray 分析,比较两种饮食模型的表达谱演变。Bahls 等用 microarray 比较了 Rapacz 家族性高胆固醇血症猪的动脉粥样硬化保护性(臂动脉)与易感性(股动脉)的基因表达差异。Cai 等研究了 HCHF 饮食诱导小型猪 NAFLD 的代谢与 RNA-seq 谱,五指山(WZSP)与藏猪(TP)转录组学分析显示肝胆固醇代谢与炎症反应相关基因上调,脂质代谢与胰岛素信号相关基因分别在 WZSP 与 TP 中受 HCHF 特异调控。Haemmig 等最近在约克夏猪高胆固醇血症与糖尿病-高胆固醇血症模型中,对冠状动脉节段做病变 RNA-seq,识别出在分期方式上演化保守、能区分糖尿病与非糖尿病相关动脉粥样硬化的基因签名与信号通路。Milenkovic 等则证明长期高脂饮食可诱导猪动脉内膜与中膜的营养基因组学变化。

作者总结,猪相对于非人灵长类等其他大动物在伦理与经济上更可行,是心血管疾病研究的优选模型。然而,即便采用高脂高胆固醇饮食,在普通猪中发展出晚期动脉粥样硬化病变仍非常困难,提示需要开发基因修饰小型猪品系。

结论与未来展望（Conclusions—future perspectives）

作者在结尾强调,虽然动物模型在动脉粥样硬化理解与新药开发中扮演了重要角色,但即使结合遗传、饮食或两者联合操控,它们仍无法完全模拟人类表型。原因主要包括:(a) 小鼠基因组尚未完全注释;(b) 表观遗传因子如 lncRNA 在小鼠与人类之间不保守;(c) lncRNA 在小鼠中通常表达水平较低;(d) 不同小鼠模型的斑块组成与结构存在显著异质性,且在极少数模型中能找到易破裂斑块。这些挑战被总结在图 9.1 中(修改自 Sopic 等 [68])。

本章个人批注

本章把"动物模型"作为一个综述主题处理,而不是介绍单一研究,适合作为前几章技术性议题(差异表达、scRNA-seq、circRNA/lncRNA 网络)的现实应用索引。读完后我有几点感受:

第一,作者把动脉粥样硬化动物模型研究的历史"大爆炸"精准定位于 1990 年代 apoE/LDLr 敲除小鼠的出现,这一时点恰好与 cDNA microarray 在 1995 年后的普及几乎重合——这两条技术线的耦合(可遗传修饰的小鼠 + 高通量表达谱)是过去三十年领域内几乎所有转录组发现的物质基础。

第二,小鼠章节里 LDLr⁻/⁻ 与 apoE⁻/⁻ 两个模型被反复交叠使用,实际上构成了方法学上的一种"双模型对照":同一研究在两套遗传背景下重复,可以排除模型特异性假阳性。Kim 等 [27] 的泡沫样/非泡沫样巨噬细胞分选就是这样做的。

第三,本节反复出现的主题是"物种保守性"——lncRNA 不保守、HDL/CETP 谱不保守、冠状动脉 vs 主动脉斑块分布不保守、破裂表型不保守。Horstmann 等 [26] 整合人与小鼠 scRNA-seq 后识别出仅见于人的细胞类型,把这种不保守性以最尖锐的方式呈现出来。这与第 6/7 章多次出现的"小鼠模型是机制工具,临床转化需独立验证"是一以贯之的态度。

第四,本节没有给出克服动物-人差异的明确技术路线,只是把问题摆出来。这其实是"差距(bridging the gap)"的题中应有之义——第 10 章(若存在)或本书后续内容可能才会给出类器官、人源血管体外模型、PCSK9 人源化小鼠等具体替代方案。

与上下章的衔接（一段话）

本书第 8 章铺垫了转录组学方法学(批量与单细胞 RNA-seq、空间组学、差异表达与通路富集),本章将这些方法系统地落在"动物模型"这一具体应用场景上;读到这里,我们第一次把前几章频繁出现的 apoE⁻/⁻、LDLr⁻/⁻、DDC 饮食、PANDORA-Seq、scRNA-seq 簇、ceRNA 网络等术语放回到完整的方法-模型对照语境中。下一章(若涉及人或临床样本)将把视角从"用动物模型回答机制问题"切换到"用人类样本验证动物发现",正好与本章结尾反复强调的"动物-人不保守"形成对接;而第 7 章(表观转录组)提到的 m⁶A 等修饰,在本章多处出现差异但缺乏整合讨论,可作为后续章节的潜在交叉点。