第 8 章：转录组学方法要点——跨越 RNA 测序及其他（Essentials of transcriptomic methods: Navigating through RNA sequencing and beyond）

引言（Introduction）

自 20 世纪 90 年代初 Frederick Sanger 的双脱氧链终止法首次对随机 RNA 转录本进行 DNA 测序以来，RNA 研究领域的技术进步已显著拓宽了研究的范围。这些技术革新使研究者能够以前所未有的速度与成本效益来研究整个转录组——即在特定条件下、于特定时间点、在特定细胞或组织中产生的全部 RNA 转录本。在动脉粥样硬化这一受多种因素影响的复杂背景下，转录组学通过提供对驱动斑块形成与进展的分子机制的综合理解推进了该领域的研究。通过同时采用靶向与非靶向方法，研究者已识别出与炎症、脂质代谢及细胞外基质重塑相关的关键生物标志物，从而显著加深了对该疾病病理生理的认识，并为精确诊断工具与潜在治疗干预措施的开发开辟了新路径。本章将聚焦于这两大类转录组学方法——靶向与非靶向方法。

定量聚合酶链式反应（Quantitative polymerase chain reaction, qPCR）

Kary Mullis 因开发聚合酶链式反应（PCR）于 1993 年获诺贝尔化学奖，这是分子技术的一项革命性突破，对遗传研究与诊断产生了深远影响。定量实时 PCR（qPCR）是最具影响力的改良之一，其通过使用荧光实现对互补 DNA（cDNA）分子的精确定量，已彻底改变了基因表达水平的测量方式。为提升 qPCR 实验的可靠性、可重复性与透明度，Bustin 等人于 2009 年发表了 MIQE 指南（Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments），为保证高质量结果勾勒了关键步骤。

一次成功的 qPCR 实验由若干关键阶段构成。第一步是设计分析，需要识别目标基因。其次是 RNA 提取，须获得高质量、无降解与污染且浓度足够的样品，以确保结果的可靠性与可重复性。针对目标基因或感兴趣区域设计特异性引物至关重要：引物应避免二聚体形成、实现接近 100% 的扩增效率并保持高度特异性，关键设计标准包括长度 18–25 个核苷酸、GC 含量 40%–60%、熔解温度 60–65°C（上下游引物温差 ≤2–3°C）、产物大小 70–200 bp，同时避免二级结构；常用辅助软件包括 NCBI 的 Primer-BLAST、Primer3 与 Beacon Designer。

在 qPCR 流程开始之前，反转录（RT）是分析 RNA 靶标的必要步骤。在 RT 过程中，反转录酶将 RNA 转换为 cDNA，因为 qPCR 只能扩增 DNA 而非 RNA。值得注意的是，尽管 RT 已知易出错且可能产生假象，但它不仅是 qPCR 的第一步，也是许多其他表达谱分析协议的第一步，包括最常见的 RNA-seq 与微阵列协议。所生成的单链 cDNA 随后作为稳定模板用于 qPCR，从而实现对样品中 RNA 水平的精确定量。RT 之后，qPCR 反应包括变性、退火与延伸三个步骤。检测方法依赖于荧光，可使用 SYBR Green 等染料或 TaqMan 探针等水解探针。这些荧光染料可特异性结合双链 DNA，随着扩增的进行，SYBR Green 等染料的信号与新合成 DNA 的量成正比地增强。

为确保准确性，必须使用内参对照，因为归一化可消除技术变异，确保所测量的基因表达水平反映真实的生物学变化而非实验噪声。常用作归一化的参考基因或持家基因包括 GAPDH、18S rRNA 与 ACTB；它们应在不同样品间保持稳定，以补偿投入材料、RT 效率及其他实验因素的差异。在设计实验时，挑选在特定实验条件（如组织类型与处理）下表达最稳定的内参对照至关重要，因为基因稳定性可因条件而异。为保证稳定性，可使用 geNorm 或 NormFinder 等专用软件，这些程序可计算稳定性评分以识别最一致的内参对照。最终，定量与分析基于定量循环数（Cq），即扩增 DNA 的荧光信号越过所设阈值的循环数，代表目标核酸可被检测到的量。低 Cq 值表明目标基因初始量较高（达到检测阈值所需的循环数更少），而高 Cq 值（例如超过 35 个循环）则反映目标基因初始量较低。通过比较不同样品或条件下的 Cq 值，可评估基因表达水平。

qPCR 已被广泛用于验证与动脉粥样硬化斑块发展相关的生物标志物，能够精确测量基因表达水平。该技术已识别出在斑块形成、炎症、脂质代谢与细胞外基质重塑中起作用的关键 RNA 靶标，这些靶标对疾病进展至关重要。通过对 RNA 表达进行定量，qPCR 提供了关于驱动动脉粥样硬化分子机制的宝贵洞见，有助于发现诊断、预后与监测该疾病的治疗靶点与生物标志物。在精度与灵敏度方面，标准 qPCR 已逐渐被数字 PCR 所超越，后者可实现绝对定量，并对低丰度转录本与基因表达细微变化实现高度灵敏、准确的测量。此外，基因表达谱分析（例如动脉粥样硬化病变内）也可通过原位杂交（ISH）实现，该技术利用标记的 RNA 探针与组织切片内的目标 RNA 序列杂交，通常与荧光染料、标签或产生显色信号的酶偶联。尽管 ISH 的灵敏度可能不及基于扩增的方法，但它可在天然细胞背景下对 RNA 进行空间检测与可视化，从而提供关于基因表达定位的宝贵洞见。

微阵列（Microarray）

微阵列技术于 1995 年首次引入，使研究者能够借助于一块紧凑的芯片状表面同时分析动脉粥样硬化病变中数千个基因的表达。该高通量方法涉及从生物样品中提取 RNA，然后按大多数协议将 RNA 反转录为 cDNA 并用荧光染料标记。标记的 cDNA 与固定在微阵列上的 cDNA 探针杂交，从而实现序列特异性结合。最常用的平台之一 Affymetrix 颠倒了后两步顺序——荧光染料仅在杂交之后加入，从而消除了杂交步骤中的染料效应。每个点位的荧光强度随后由扫描仪定量测量，从而对样品的基因表达水平给出精确的呈现，有助于实现全面的转录组学分析。

作为一种靶向方法，微阵列技术能够整合针对特定基因或 RNA 序列集合的探针，从而在降低费用与数据复杂度的同时实现快速分析。这种方法对所有类型的 RNA 都很有效，包括微小 RNA（miRNA）、信使 RNA（mRNA）与长链非编码 RNA（lncRNA）的谱分析——在脂质稳态通路、动脉粥样硬化斑块进展以及内皮细胞炎症与免疫激活中，相关研究表明这些 RNA 发挥着重要作用。微阵列因此已被证明在研究基因调控网络与表达谱方面非常有效。与 qPCR 相似，归一化过程是微阵列分析的关键环节，旨在最大限度地减少非生物变异，确保原始荧光数据被准确转换为可靠的定量结果。总体而言，微阵列技术为大规模检查基因表达提供了一种高效而全面的手段，已成为转录组学与分子生物学领域不可或缺的工具。值得注意的是，虽然聚焦于已知外显子，现代高密度微阵列实际上仍可在替代基因转录本以及弱表达基因的可靠定量方面提供卓越的灵敏度。

靶向 RNA 测序（Targeted RNA sequencing）

对整个转录组进行测序并非唯一选择，靶向 RNA-seq 专注于富集特定基因或目标 RNA 序列（图 8.1）。该方法有助于避免不相关数据的干扰——这些数据在处理全转录组数据时不仅常常使分析变得杂乱，更可能完全淹没那些表达水平不高但确有兴趣的目标基因。靶向测序采用两种主要方法：扩增子法（使用引物扩增特定 RNA 区域）与杂交捕获法（使用探针杂交分离目标序列）。在进行测序之前，必须先定义目标区域或目标 panel。用于这些方法（与其他方法一样）的 RNA 必须具有高质量与足够数量，可在测序前进行多聚（A）选择或核糖体 RNA 去除等富集步骤以提高目标转录本的产出。

无论采用扩增子法还是杂交捕获法，精心的文库制备对于获得最佳测序结果至关重要。该过程通常包括若干关键步骤：分离核酸（处理 RNA 时执行 RT 以合成 cDNA）；随后对核酸进行片段化并对其末端进行修复以确保与下游步骤兼容；接着将测序接头连接到片段上以便结合到测序平台上；最后对文库进行纯化以去除多余试剂，并准备上机测序。上述每一步对于生成准确反映目标序列的高质量文库都至关重要。

靶向 RNA-seq 提供了若干需要权衡的优势与缺点。积极方面：靶向 RNA-seq 提高了灵敏度，可检测与定量低表达基因与罕见变异；该方法还可确保出色的覆盖深度，对所选区域进行更深测序，从而获得更准确的结果；此外，所生成数据由于范围聚焦往往更易于分析，得到更易于管理的数据集，可节省时间与成本并减少不相关数据的负担。然而也存在明显的缺点：靶向 RNA-seq 可能因最初目标选择而引入偏差，有可能遗漏所定义目标集合之外的重要转录本；一旦为特定候选基因生成测序数据后，将其重新用于其他分析便十分困难，灵活性有限；对特定目标的关注可能限制对基因表达动态变化的全面理解。

目前，多家公司与方法在提供 RNA 靶向测序方案方面处于前沿，各自提供独特的方法学与技术。除 Agilent 等非测序公司提供专用捕获产品外，Illumina 作为下一代测序的领导者也提供靶向 RNA-seq 方案，利用其广泛的文库制备协议与先进的测序平台实现基因表达分析的高灵敏度与高特异性。罗氏的技术，乃至 Thermo Fisher Scientific 的 Ion AmpliSeq 靶向测序，可实现高效的多重分析并支持多个 RNA 目标的同步分析，从而简化工作流并实现经济高效的实验。此外，一些自建 RNA 靶向测序方法被与 Oxford Nanopore Technology（ONT）的纳米孔技术相结合。包含 3000 种 lncRNA 的 FIMICS panel（这些 lncRNA 在衰竭心脏中受到调控并可在血样中检出）可能为识别参与动脉粥样硬化斑块发展的新基因提供途径，这些新基因可能构成未来药物或生物标志物的靶点。总体而言，这些进展反映了在研究与临床应用中对精确而高效 RNA 分析日益增长的需求。

测序合成法（Sequencing by synthesis, SBS）

测序方法在覆盖范围上可大致分为靶向与非靶向两大类，各自在转录组学研究中承担不同目的。靶向测序聚焦于基因组或转录组中的特定基因或感兴趣区域，可详细分析与疾病相关的特定基因或突变。该方法在临床场景中特别有益，可识别精准医学靶向 panel 中的可操作变异。相比之下，非靶向测序（如全基因组或全转录组测序）提供整个遗传景观的全面总览，使研究者能够在不预设特定目标的前提下发现新基因、变异与调控元件。尽管非靶向方法提供了对转录组更全面的视角，靶向测序则为预定义序列提供更高的灵敏度与特异性，使两种方法学都成为推进转录组学理解的必备工具。鉴于两类方法各自的优缺点，选择何种方法往往取决于具体的研究目的与临床需求。

在非靶向转录组学方法中，虽然分析并非像靶向测序那样聚焦于特定基因或区域，但某些富集步骤往往是提高测序数据质量与相关性的必要条件。这些富集策略通常旨在提高特定 RNA 类型的代表性，同时减少其他类型（如核糖体 RNA，rRNA）的优势。核糖体 RNA 在典型细胞的总 RNA 中约占 80%–90%，如果保留在样品中，rRNA 将主导测序读段，以其信号淹没数据集，导致其他 RNA 物种（如 mRNA 与非编码 RNA，ncRNA）在最终结果中被显著低估或完全缺失。为解决这一问题，RNA-seq 之前通常采用两种主要策略：多聚（A）富集与核糖体 RNA 去除。

多聚（A）富集利用了大多数 mRNA 与部分 ncRNA（如 lncRNA）3' 端具有多聚腺苷酸化（poly(A)）尾这一特点。在文库制备过程中，样品与寡核苷酸（dT）引物或包被有 oligo(dT) 序列的磁珠共同孵育。这些 oligo 特异性地结合 RNA 分子的 poly(A) 尾。完成结合后，含 poly(A) 的 RNA 借助磁力分离等方式从其余 RNA 群体中分离出来。这些被富集的 RNA 随即用于文库制备与测序的下游步骤。多聚（A）富集特别适用于研究蛋白质编码基因，因为绝大多数多聚腺苷酸化的转录本对应 mRNA。然而，该方法排除了非多聚腺苷酸化的 RNA，例如许多组蛋白 mRNA、环状 RNA 与某些 ncRNA，因此对于需要更广阔转录组视角的研究而言存在局限。

核糖体 RNA 去除则从 RNA 样品中定向去除 rRNA，保留 mRNA、ncRNA 与其他 RNA 物种的混合物用于测序。该方法通常使用 rRNA 特异性探针结合 rRNA 序列；rRNA 一旦与这些探针结合，便可借助磁珠或酶消化从样品中去除。核糖体去除对旨在捕获转录组全面视角的实验（包括编码与非编码 RNA）具有优势。与多聚（A）富集不同，该方法允许保留非多聚腺苷酸化的 RNA，可深入研究 lncRNA、小核 RNA、小核仁 RNA与某些病毒 RNA 等 RNA 物种。

在测序方法学层面，目前最广泛使用的两种方法是测序合成法（SBS）与直接 RNA 测序（DRS）。本节将使用基于 Illumina 的测序作为测序合成法的代表性示例，并使用 Oxford Nanopore Technologies 的 RNA-seq 作为 DRS 的示例，逐一详述这些方法。

SBS 依赖 DNA 聚合酶的活性，因此 RNA 分子必须首先被反转录为 cDNA 方能进行测序。虽然这种转换使 RNA 能够被有效分析，但也带来一定局限：超出 RNA 序列之外的信息，例如 RNA 修饰（如甲基化）以及 RNA 编辑事件（如腺苷-肌苷 A-to-I 转换），通常会在 RT 过程中丢失。这些修饰与编辑事件可在 RNA 稳定性、定位与翻译中发挥关键作用，而它们在基于 cDNA 的测序中的缺失会限制对这些调控层面的认识。

Illumina 的 SBS 技术可在配对末端模式下对长达约 300 bp 的 DNA 片段进行测序。该长度限制源于测序过程的化学性质——每个被掺入的核苷酸都会产生信号，且随着读段变长，由于聚合酶保真度与噪声的逐渐累积，保持准确性的能力会下降。配对末端测序是 Illumina 平台的一个关键特征，在 RNA-seq 实验中尤其有价值。在配对末端测序中，每个 DNA 片段的两端都被测序，产生两个读段：一个来自 5' 端，一个来自 3' 端。其结果是得到一组已知片段间距离的读段对，这带来诸多优势：提高比对准确性、提供片段大小信息、可检测融合转录本、增强转录本组装、对低表达转录本具有更高灵敏度。在 RNA-seq 工作流中，配对末端测序常与链特异性文库制备相结合，以提供关于转录本方向的额外信息层，使研究者能够区分由相反 DNA 链转录而来的重叠转录本，进一步增强转录组学洞见。

此外，配对末端模式下 150–300 bp 的典型读段长度非常适合 RNA-seq：它们足够长以跨越小外显子的连接（这对可识别剪接位点的比对工具至关重要），又足够短以保持高碱基识别准确度。尽管具有诸多优势，配对末端测序也存在一些局限：它需要更多测序循环，增加了成本与运行时间。此外，对非常短的 RNA 物种（如 miRNA），配对末端测序可能并无必要，因为单端读段已能提供足够信息。

SBS 方法的关键步骤如下。片段化是 RNA-seq 中的关键步骤，将 RNA 或 cDNA 打断为较小片段以利于高效测序。虽然 RNA 通常在片段化前被反转录为 cDNA，但也可对 RNA 直接进行片段化。常用片段化方法包括：酶切片段化（使用 RNAse III、RNAse A 或 DNase I 等酶）、机械剪切（如超声处理或热诱导片段化）、化学片段化（使用二甲基亚砜等试剂）以及转座酶介导的标签化（利用转座酶将接头序列插入片段化的 cDNA 中）。这些方法可确保所得片段大小适合测序，从而优化数据的质量与准确性。

末端修复：片段化可能产生受损的 DNA 末端，可能阻碍高效的接头连接并对测序质量产生负面影响。末端修复过程通过使用 DNA 聚合酶填补 3' 或 5' 突出端、核酸外切酶去除不期望的突出端以及激酶在 5' 端添加磷酸基团来解决这些问题。经过这些修饰，DNA 片段具有均匀的平末端，可为高效的接头连接做好准备，确保高质量的测序。

接头连接：接头被连接到 DNA 或 cDNA 片段上以实现若干关键功能：通过整合索引或条形码序列实现多重分析；提供用于结合流动池的测序引物结合位点；包含用于 PCR 扩增的引物结合位点。该连接过程由 DNA 连接酶介导，DNA 连接酶在接头与 DNA 片段之间形成共价键。

扩增与 DNA 桥形成：在 DNA 片段经制备与连接接头后，它们被加载到流动池上。流动池是一个涂有寡核苷酸（短 DNA 序列）的平面玻璃表面，这些寡核苷酸与 DNA 片段上连接的接头互补。这些片段随后与流动池表面的寡核苷酸杂交或结合。每个结合的 DNA 片段随后在称为"桥式扩增"的过程中被扩增。在此阶段，片段弯曲以与附近的寡核苷酸形成桥。DNA 聚合酶随后合成新链，形成双链桥结构。

簇生成：双链桥随后被变性（分离为单链），每条单链重复该过程，形成更多桥并使 DNA 在原位扩增。这导致在流动池的特定位置形成密集的、由相同 DNA 片段组成的簇。这些簇的形成至关重要，因为每个 DNA 簇含有数千至数百万份原始 DNA 片段的拷贝。该扩增是必要的，因为测序过程中（当核苷酸被掺入并发光时）所发射的荧光信号必须足够强以被测序仪的相机检测到。没有簇扩增，来自单个 DNA 分子的信号将过于微弱而无法被准确检测。

文库生成与测序：在所有制备步骤完成且文库已生成后，便可开始测序并产生数百万条读段（亦称原始测序数据）。测序完成后，经历的分析步骤包括碱基识别、质量控制（QC）、比对到参考基因组以及对结果的解读——例如识别基因表达水平、突变或其他感兴趣的基因组特征。

测序过程：完成桥式扩增步骤后，实际的测序便开始了。这是 SBS 的核心过程，DNA 聚合酶合成与被测序 DNA 模板互补的链。该步骤在流动池上进行，其中经扩增的 DNA 簇充当测序模板。反应混合物中存在四种类型的核苷酸——腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤（G）。这些核苷酸在化学上以独特的荧光染料修饰，每种在掺入后发出特定颜色。此外，这些核苷酸配备了可逆终止基团，该基团在单个核苷酸加入后暂时阻断进一步的 DNA 合成，从而确保一次只掺入一个核苷酸，防止错误并提高测序准确性。

测序过程按以下步骤进行：（1）核苷酸掺入：DNA 聚合酶将一个核苷酸添加到不断生长的互补链上。核苷酸的选择由模板链的序列决定。（2）荧光信号检测：一旦核苷酸被掺入，与其相连的荧光染料即被激活，发出特定信号并被光学系统检测与记录。每种核苷酸类型产生不同的荧光颜色，使仪器能够识别被掺入的碱基。（3）可逆终止与切割：可逆终止基团被化学切割，使合成得以继续；类似地，荧光染料也被去除，使链为下一轮核苷酸掺入做好准备。（4）循环重复：此过程对每个核苷酸重复进行，直至 DNA 片段末端。系统于每个循环捕获荧光信号，构建 DNA 序列的精确读段。测序完成后，检测到的信号被编译为数字格式，为 DNA 链的每个位置分配碱基。

完成测序后，所收集的数据将经历广泛的生物信息学分析，包括：碱基识别——根据记录的信号确定核苷酸序列；质量过滤——去除低置信度或模糊的读段；读段比对——将读段映射到参考基因组或从头组装；定量分析——测量基因表达水平、检测突变并分析 RNA-seq 应用的转录本变异。目前，可用于 RNA-seq 数据分析的计算工具与方法多种多样，涵盖归一化协议、差异表达分析及各种下游应用。这些工具与方法在不断演进，为研究者提供多种选项以根据特定实验设计与研究目标定制其分析。

非靶向转录组学方法具有显著的优势与局限：它们提供无与伦比的覆盖范围，有助于在整个转录组中发现新的变异与突变，是识别新生物标志物、在没有预设转录组学知识的前提下研究基因表达动态等广泛应用的理想选择。非靶向方法所生成的大量数据可重新用于各种分析，增强了它们对后续研究的多功能性。然而，这些方法也存在明显局限：它们通常更昂贵，并产生大型数据集，需要先进的计算资源、数据存储与分析工具，从而使得快速数据解读变得复杂。此外，非靶向方法的广泛范围可能降低其对低丰度转录本或特定感兴趣区域的灵敏度，对罕见转录本的精确定量带来挑战。

直接 RNA 测序：进展与应用（Direct RNA sequencing: advancements and applications）

不同于需要从 RNA 合成 cDNA 的 SBS 方法，DRS 允许直接对天然 RNA 分子进行测序。目前，ONT 采用了一种前沿的方法，使 RNA 能以其天然形式被测序，保留其原始结构与化学修饰，同时最大限度地减少与 RT 相关的偏差与假象。

ONT 的 DRS 利用基于嵌入膜中的蛋白质纳米孔系统，这些纳米孔构成流动池的核心组件。膜在电学上是绝缘的，离子电流流过纳米孔。在膜的两侧施加电压，形成流过纳米孔的电流。当纳米孔未被占据时，该电流是稳定的。当核酸通过纳米孔时，个体核苷酸与孔相互作用。每种碱基——腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）或尿嘧啶（U）——以独特的方式部分阻断电流。阻断的程度取决于该碱基的特定化学性质。这些变化被实时记录，使系统能够直接从信号中解码 RNA 序列。该方法的一个主要优势在于被测序的是天然 RNA，意味着该过程保留了分子的原始性质，包括甲基化与 RNA 编辑等化学修饰。这不仅提供序列信息，还提供对表观转录组学景观的洞见，而后者在传统方法中通常会丢失。

为促进 RNA 通过纳米孔，特定的马达蛋白（即解旋酶）在文库制备过程中被添加到 RNA 上。这些马达蛋白通过专门设计的接头序列与 RNA 连接，该接头专门连接到 RNA 分子的 poly(A) 尾。这一特异性至关重要，因为 poly(A) 尾是大多数真核 mRNA 与部分非编码 RNA 的普遍特征，确保只有具有 poly(A) 尾的 RNA 分子被作为测序目标。该接头使马达蛋白能够牢固地结合 RNA，使其为高效测序做好准备。一旦连接，马达蛋白便以受控、逐步的方式将 RNA 链引导通过纳米孔，以一致的速率将链送入孔中。这一精确的相互作用对于准确的信号检测至关重要，并确保测序过程聚焦于多聚腺苷酸化的 RNA 物种，从而提高数据质量与可靠性。

由于文库制备的成功依赖于 poly(A) 尾的存在，对于标准的多聚腺苷酸化 RNA-seq，核糖体去除在文库制备前通常不是必需的。核糖体 RNA 缺乏 poly(A) 尾，因此不会与接头或马达蛋白结合，自然而然从文库中被排除。然而，对于聚焦于表观转录组学（包括非多聚腺苷酸化 RNA）的研究，核糖体去除应在文库制备过程中额外的 poly(A) 加尾步骤之前进行。这一顺序确保有效去除核糖体 RNA，同时使非多聚腺苷酸化的 RNA 能被处理并纳入测序文库，从而实现对转录组更全面的分析。

尽管 DRS 在本质上不需要将 RNA 反转录为 cDNA，但在文库制备过程中通常建议加入 RT 步骤。该过程产生 RNA-cDNA 双链体，可实现两个关键目的：首先，它通过减少二级结构（如发夹或环）的形成来帮助拉直 RNA 分子——这些结构可能阻碍纳米孔或降低测序效率。通过以此种方式稳定 RNA 链，双链体确保了 RNA 在纳米孔中的更顺畅通过。其次，RNA 分子更均匀的构象增强了纳米孔准确且一致地读取序列的能力。需要注意的是，尽管 RNA-cDNA 双链体已形成，但马达接头蛋白专门将 RNA 链引导进入纳米孔。双链体中的 cDNA 组分留在孔外，既不穿过孔也不在该过程中被测序。

如前所述，DRS 已被证明是表观转录组学领域中一种无价的工具，使对 RNA 修饰（例如 N6-甲基腺苷 m6A）的研究成为可能。通过以天然状态对 RNA 进行测序，该方法保留了化学修饰，为其在转录组中的存在、位置与潜在功能角色提供了直接证据。例如，m6A 修饰现在可以使用 DRS 高精度地检测。m6A 特异性地在信号中产生特征性偏移，提示修饰的存在。然而，仅有信号本身尚不能确认修饰的确切类型（例如 m6A），因此需要深入的生物信息学分析以进行准确解读。为解读这些信号变化，先进算法应用统计模型或监督式机器学习方法以检测与已知修饰相关的模式。目前，算法已能够直接从纳米孔测序期间产生的电信号中检测特定 RNA 修饰，如 m6A 与 5-甲基胞嘧啶。

尽管取得了进展，该技术仍面临若干局限。虽然准确度已有提高，但错误率仍是个问题；大量数据的产生需要显著的数据存储容量与计算能力。目前，用于 DRS 数据分析的生物信息学流程还远未标准化。虽然有多种工具可用，每种工具都设计用于解决数据处理与分析的特定方面，但它们在整合到统一工作流中的方式在不同的研究中各异。例如，Guppy 与 Bonito 等工具常用于碱基识别，将来自纳米孔测序的原始信号转换为核苷酸序列；Nanopolish 与 Tombo 等工具则专门用于检测 RNA 修饰并将 DRS 读段比对到参考基因组。此外，Minimap2 广泛用于比对，而 FLAIR 与 TALON 用于转录组组装与同种型鉴定。尽管这些工具可用，工作流中缺乏标准化可能导致结果解读与比较的不一致。此外，目前尚无可商用的多重分析 DRS 样品的方案。多重分析指将多个 RNA 样品汇集到单次测序运行中、每个样品以分子条形码或标签唯一标识的过程。该方法是 DNA 测序中的标准做法，可同步处理多个样品，降低成本并最大化测序通量。然而，在 DRS 情境下，对天然 RNA 分子进行条形码编码以及在文库制备过程中保留其修饰的技术挑战阻碍了可靠多重分析协议的开发。缺乏多重分析选项限制了可扩展性与成本效益，对使用直接 RNA-seq 进行大规模转录组学研究构成显著瓶颈。

单细胞 RNA 测序：细胞异质性洞见（Single-cell RNA sequencing: insights into cellular heterogeneity）

单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）已成为在单细胞分辨率下解析细胞异质性、理解动脉粥样硬化中转录动态的强大工具。不同于对异质细胞群进行平均基因表达并掩盖细胞水平洞见的传统批量 RNA-seq，scRNA-seq 使我们能够揭示细胞群内的多样性，揭示细胞功能与疾病进展中的生物学通路，并提示新的治疗靶点。在动脉粥样硬化中，scRNA-seq 数据已识别出关键的参与者，如内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞与免疫亚群，揭示它们的亚型异质性以及在斑块形成、炎症与脂质代谢中的不同作用。本节将深入探讨 scRNA-seq 在动脉粥样硬化研究中的技术层面与应用，包括研究设计与样品制备、scRNA-seq 方法介绍、scRNA-seq 分析流程概述、scRNA-seq 在动脉粥样硬化中的应用以及转录组数据的细胞类型反卷积（图 8.5）。

scRNA-seq 方法（scRNA-seq methods）

在过去十年中，scRNA-seq 方法激增。其中两种方法因其广泛使用与成熟特性而尤为突出：基于板的全长转录本测序与基于液滴的高通量测序。下文介绍这两种具有代表性的方法学，其他进展还包括无物理细胞分离的制备方法（可能更具成本效益），如 Parse Bioscience 与 sci-RNA-seq3。

基于板的全长转录本测序：此测序协议从通过 FACS 或手工显微操作将单细胞分离到多孔板的各个孔中开始。细胞随后被裂解，其 RNA 被反转录为 cDNA。SMART-seq2 作为代表性方法，在 RT 步骤中采用模板转换机制以生成覆盖转录本全长的 cDNA 文库，提供从 5' 到 3' 端的全面覆盖。在 cDNA 扩增、标签化与测序后，便可构建全长单细胞转录组文库。

基于液滴的高通量测序：液滴方法利用微流控设备将单细胞与带有独特条形码的珠子一同封装到纳升级的液滴中。具有代表性的平台 10x Genomics Chromium 采用基于液滴的微流控技术并行分割数千个单细胞。在每个液滴内，细胞被裂解，释放出的 mRNA 然后与连接在带条形码珠子上的 oligo(dT) 引物杂交。这些引物含有独特的细胞条形码与独特分子标识符（UMI），从而以细胞特异与分子特异的标识符标记每个转录本。所捕获的 mRNA 使用 oligo(dT) 引物与模板转换寡核苷酸被反转录为 cDNA。在 cDNA 扩增与测序后，构建出高通量单细胞转录组文库。

比较这两种测序方法时，每种方法都提供独特的优势与局限：（1）可扩展性与通量：10x Genomics Chromium 可在单次运行中处理数千个细胞，使其高度适合针对复杂细胞群的大规模研究。相比之下，SMART-seq2 受可用孔数限制，对高通量应用的可扩展性较低。（2）基因检测灵敏度：由于能够捕获全长转录本并进行稳健的 cDNA 扩增，SMART-seq2 在检测低丰度转录本方面通常具有更高的灵敏度。（3）转录本覆盖度：SMART-seq2 擅长捕获全长转录组，可对同种型与可变剪接进行详细分析。然而，10x Genomics Chromium 通常聚焦于转录本的 3' 或 5' 端，限制了其研究同种型多样性的能力。（4）lncRNA 检测的局限：两种技术都依赖于 poly(A) 尾捕获，这限制了其检测非多聚腺苷酸化 lncRNA 的能力，导致对 lncRNA 转录组的分析不完整。

scRNA-seq 分析流程概述（Overview of scRNA-seq analysis pipeline）

为最大化在单细胞分辨率下获取生物学洞见的能力，已开发出各种具有不同目的与功能的分析工具用于 scRNA-seq 数据。通常，scRNA-seq 数据分析可分为三个步骤：预处理、聚类与注释、下游分析。

预处理：这是 scRNA-seq 的基础步骤，涉及比对到合适的基因组并过滤低质量细胞、去除双胞与游离 RNA 污染、以及对数据进行归一化以确保细胞间的可比性。10x Genomics 开发的 Cell Ranger 提供端到端的初步预处理解决方案，包括比对、条形码分配与 UMI 计数。对于双胞去除，已开发若干工具，如 DoubletFinder、scDblFinder 与 Scrublet。SoupX 与 DecontX 可用于去除游离 RNA 污染。游离 RNA 不属于任何单一细胞，因此会增加将 RNA 分配到单个细胞时的噪声。随后，使用 Seurat 或 Scanpy 进行进一步的质量控制与归一化。通常使用以下质量控制指标来决定是否保留某个细胞：所检测到的唯一基因数、所检测到的 UMI（转录本）总数、线粒体基因与血红蛋白基因表达百分比。过滤阈值的选择并非固定，通常根据所研究的特定细胞与组织类型而变化。

聚类与细胞注释：数据经预处理后，下一步是探索其结构并识别模式。一般而言，该分析可分为六步：（1）高变基因检测：这些基因作为后续分析的基础。（2）降维：为简化高维数据同时保留其生物变异，应用主成分分析（PCA）等降维技术。（3）批次效应去除：批次效应是 scRNA-seq 数据中的常见问题，需要加以解决以确保准确的聚类与解读。Harmony、Seurat（CCA 与 RPCA）、scVI、Scanorama 与 BBKNN 等方法被广泛用于校正这些技术伪迹。（4）聚类：两种常用算法 Leiden 与 Louvain 用于将具有相似转录谱的细胞归组。（5）可视化：UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）与 t-SNE（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding）等可视化工具使研究者能在二维或三维中查看复杂数据。（6）细胞类型注释：主要有两种注释方法。第一种是手动注释，依赖先验生物学知识与该领域的广泛参考资源；通常使用标记基因（即已知在特定细胞类型中特异性表达的基因）来识别细胞簇。共识论文与荟萃分析为动脉粥样硬化的细胞类型与亚群提供可靠的标记基因。CellMarker 2.0 与 PanglaoDB 等数据库存储了经过人工整理的跨多种组织与物种的细胞类型特异性标记基因列表，可帮助科学家促进注释。另一种是自动注释，使用计算工具与算法（如 SingleR 与 CellTypist）根据参考数据集或统计模型分配细胞身份。虽然这些工具可用于识别主要血管细胞类型，但通常不适合动脉粥样硬化中观察到的复杂细胞亚型。值得注意的是，步骤（1）至（5）可使用 Seurat 或 Scanpy 高效执行。

下游分析：最后一步涉及利用已聚类的数据获得深入的生物学洞见。下游分析大致可分为基因水平与细胞水平两类方法。对基因水平分析：（1）差异表达分析，聚焦于识别在不同细胞簇或实验条件之间表达存在显著差异的基因。Seurat 与 Scanpy 是常用工具。Wilcoxon、MAST 以及伪批量方法（DEseq2）在这些软件包中得到了良好实现。（2）功能分析，包括使用 MSigDB（The Molecular Signatures Database）进行 GO/KEGG 富集分析与基因集富集分析（GSEA）。clusterProfiler 与 Enrichr 等工具被广泛用于这些分析。（3）转录因子（TF）识别：该分析主要有两种算法。一种是重建调控网络并识别在特定簇中活跃的 TF，例如 pySCENIC。另一种是基于先验知识数据库预测 TF 活性，例如 DecoupleR 配合 CollecTRI（Collection of Transcriptional Regulatory Interactions）数据库。对细胞水平分析：（1）细胞间通信，分析细胞如何通过信号分子相互作用，提供关于免疫反应与其他细胞间过程的洞见。CellPhoneDB 与 CellChat 等工具可预测并可视化配体-受体相互作用，使研究者能够绘制复杂的通信网络。NicheNet 通过将配体-受体相互作用连接到下游靶基因扩展了该分析，提供了对信号通路的全面视角。（2）细胞轨迹分析，重建动态生物学过程（如细胞分化）。Monocle3 与 Slingshot 等工具可推断伪时间轨迹，揭示细胞沿发育通路的进展。Velocyto、scVelo 与 CellRank 2 通过基于已剪接与未剪接转录本估计 RNA 速度进一步增强这些分析。

scRNA-seq 在动脉粥样硬化中的应用（Application of scRNA-seq in atherosclerosis）

scRNA-seq 研究已成功表明不同细胞类型（如平滑肌细胞 SMC、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞与其他免疫亚群）表现出广泛的表型多样性。例如，在小鼠研究中，对 SMC 系谱示踪细胞的单细胞分析已揭示 SMC 在动脉粥样硬化过程中经历表型转换，呈现多种表型，如成骨软骨样、纤维肌细胞样、泡沫细胞样与干细胞样状态。类似地，使用人斑块进行的 scRNA-seq 研究也已在人类中揭示出相当的 SMC 来源细胞状态。此外，scRNA-seq 也便利了对巨噬细胞的研究。已在人类与小鼠的动脉粥样硬化斑块中发现具有不同功能的五个主要巨噬细胞亚群：驻留样巨噬细胞、炎性巨噬细胞、泡沫细胞/TREM2hi 巨噬细胞、增殖性巨噬细胞与干扰素诱导型巨噬细胞。

使用 scRNA-seq 识别的基因或亚群进行的因果性研究正慢慢出现，但迫切需要这些研究来兑现该技术诞生时所承载的高度期望。

转录组数据的细胞类型反卷积（Cell-type deconvolution of transcriptomic data）

scRNA-seq 已彻底改变了我们对细胞异质性的理解，但仍受高成本与技术局限性的制约，特别是对大规模研究而言。相比之下，批量 RNA-seq 提供了经济高效的转录组分析替代方案，但缺乏细胞类型分辨率。为弥补这一差距，已开发出计算性的细胞类型反卷积方法，通过利用来自 scRNA-seq 的参考谱来推断批量 RNA-seq 数据中的细胞组成。已为这类分析开发了多种工具，包括 DWLS、MuSiC、CIBERSORTx、AutoGeneS、BayesPrism、Bisque、CDseq、CPM、MOMF、SCDC 与 Scaden。

scRNA-seq 实现了对动脉粥样硬化病变内细胞异质性的精细理解，提供了批量方法无法捕获的洞见。通过精心设计研究、选择适当的测序平台、确保正确的样品制备并利用稳健的分析流程，研究者能够发现多样的细胞群及其在斑块形成与进展中的动态作用。最终，这些进展为识别新治疗靶点、深化对动脉粥样硬化的机制理解铺平了道路。

空间转录组学在动脉粥样硬化中的应用（Spatial transcriptomics in atherosclerosis）

从批量到空间转录组学：近年来，随着高通量测序技术（如 2008 年的批量 RNA-seq 或 2009 年的 scRNA-seq）的发展，研究者获得了对多细胞生物不同细胞间基因表达异质性的前所未有的理解。在动脉粥样硬化领域，多项研究为动脉粥样硬化斑块内的细胞内容及相关细胞特异性表达提供了宝贵洞见。生成的数据已由大型联盟收集，如 CellxGene Discover（专门为动脉粥样硬化社区设计的 PlaqView）。尽管取得了这些进步，对 RNA 分离或从整个组织中分离活细胞的需求构成了一个缺点，因为此类细胞的空间上下文信息会丢失。因此，空间转录组学（ST，2020 年度方法）应运而生，能够对完整组织进行高分辨率的基因表达谱分析。通过保留空间上下文，它使研究者能够识别不同的细胞群，提供关于组织微环境中细胞功能、表型与位置之间关系的关键信息：细胞的精确位置与组织方式至关重要。

在比较 RNA-seq、scRNA-seq 与 ST 时，可以将它们类比为水果：通过 RNA-seq 获取基因表达谱类似于制作水果冰沙——将不同水果混在一起，丢失单个水果的特征，但保持整体可识别的味道，我们可以识别不同的水果。例如，可以尝到大量苹果的味道，或者在组织中可以找到大量平滑肌细胞特异性基因。scRNA-seq 类似于制作水果沙拉，所有单个组分都可识别，但它们被混在一起。尽管美味，但并不知道这些水果是共同生长还是来自不同地理区域。另一方面，ST 类似于制作水果挞，所有单个水果都可识别，并且它们在挞中的特定位置也被标注。因此，RNA-seq 给出组织整体的（平均）基因表达，scRNA-seq 提供该组织中各个细胞的整体基因表达，而 ST 则添加了给定组织的空间上下文。因此，使用 ST 技术收集的数据为量化基因表达水平与研究空间基因表达模式提供了强大工具。

空间转录组学方法：已描述了多种用于检查空间基因表达模式的技术（表 8.1），可分为两大类：靶向与非靶向方法。在靶向方法中，选择特定基因或转录本集合进行分析。该方法通常涉及使用预定义的探针或探针 panel 靶向特定的目标基因，提供其空间分布的精确信息。这只提供关于少量选定（数百到数千个）基因（通常只是经典转录本）的信息，可能遗漏未被纳入分析的其他基因所包含的重要生物学洞见，因此显示出有限的发现潜力。由于分析仅限于先前已知的基因，靶向方法既不识别新的或先前未表征的基因，也不识别不同的转录本同种型，从而遗漏关于内含子-外显子连接处遗传变异影响与不同剪接因子活性的信息。在非靶向方法中，整个转录组被测序与分析，无需事先选择特定转录本。该方法通常涉及捕获与测序空间分辨样品中存在的所有转录本。这提供了对转录组的全面视角，允许检测与发现多种基因，并有可能揭示生物学相关的新转录本。因此，非靶向方法可被视为一种假设生成方法，能够以无偏方式探索转录组，导致新基因或转录本与表达模式的发现。另一方面，靶向方法可被视为基于确认的方法，聚焦于特定的目标基因以验证假设（例如由非靶向方法生成的假设），或用于研究特定的已知生物学通路。两种方法都是有价值的且互补的，取决于研究目标与调查阶段。例如，Asp 等人通过利用 ST 的空间探索能力、scRNA-seq 提供的反卷积技术以及原位测序（ISS）的精确亚细胞靶向准确性，刻画了发育中人类心脏在三个特定阶段的空间格局与细胞多样性。

比较方法：这些方法代表了范围广泛的 ST 技术，每种都有独特的优势与局限。基于成像的方法如 smFISH、MERFISH 与 seqFISH+ 提供单分子精度，但存在多重分析挑战。基于测序的方法如 Slide-seq2、Stereo-seq 与 DBiT-seq 在通量上可扩展，但空间分辨率各异。混合方法如 TIVA tags 与 ZipSeq 为活体内与活体组织中的靶向分析提供灵活性，而 GeoMx DSP 与 10X Genomics Visium 等工具则擅长区域特异性分析。下面简要描述每种方法并提供其优缺点。

靶向方法：STARmap 或空间分辨转录本扩增子读出映射使用原位测序与水凝胶-组织化学方法在完整组织内以单细胞分辨率绘制基因表达图谱。它提供高空间分辨率的单细胞转录组学，可在完整组织上工作，无需组织解离。缺点是与基于测序的方法相比通量有限、设置过程费力且需要专用仪器设备。BOLORAMIS（连接在 RNA 上的条形码寡核苷酸经扩增用于多重原位分析）将锁式探针连接、ISS 与 FISH 相结合，实现空间分辨的 RNA 检测。其优势包括高度多重检测、稳健的空间分辨率以及测序与成像方法的整合。然而，它工作流程复杂，需要精确的连接化学，并且对高 RNA 数量的通量有限。MERFISH（多重错误稳健荧光 ISH）使用错误稳健的条形码编码与连续成像检测数千种 RNA 物种。其优势包括极度的多重性、高灵敏度与单分子分辨率。缺点是需要迭代杂交、复杂的成像系统以及大量计算分析。seqFISH+（连续荧光 ISH 增强版）使用组合条形码编码与迭代成像在完整组织中检测超过 10,000 个基因。它在大规模多重分析、单分子分辨率方面表现出色，且不需要测序。其局限在于耗时的迭代成像、复杂的工作流程以及对高端成像系统的依赖。osmFISH（优化的单分子荧光 ISH）使用连续杂交轮次检测数十到数百个 RNA 分子。它提供单细胞分辨率、高信号质量与直接的实施方式。然而，与更先进的方法相比，其多重能力较低，对大规模实验较慢。CosMx SMI（空间分子成像仪）能够在完整组织中以亚细胞分辨率进行多重 RNA 与蛋白检测。其突出特点为高空间分辨率、同时测量 RNA 与蛋白的能力以及自动化工作流。其局限包括基于点位的检测（对单分子分辨率精度较低）以及对大样品较慢的通量。GeoMx DSP（数字空间分析平台）使用紫外线光释放化学方法对来自特定组织区域的基因与蛋白表达进行谱分析。它允许区域特异性分析，与 FFPE 组织兼容，并能与新一代测序（NGS）系统良好整合。然而，它提供较低的分辨率（约 100 μm），聚焦于批量空间区域而非单细胞。

非靶向方法：FISSEQ（荧光原位测序）将 RT 与测序合成法相结合，直接在原位检测与映射 RNA 分子。它提供真正的单分子分辨率，保留空间信息，且不需要解离。缺点包括 RNA 捕获效率低、需要专用成像系统以及相对有限的通量。10x Genomics Visium 使用在玻片上的空间条形编码点以点位级分辨率（HD 约 2 μm、原始 Visium 系统约 55 μm）绘制组织切片上的基因表达图谱。它高度可扩展，与 NGS 整合良好，便于实施，并与新鲜、冷冻与（历史）FFPE 包埋的组织兼容。然而，由于其基于点位的检测，它无法解析单细胞或亚细胞特征。DBiT-seq（组织中确定性条形编码空间组学测序）使用微流控条形编码以接近单细胞分辨率（10 μm）映射 RNA 表达。它提供高空间精度、基于测序的高通量以及高效的条形编码。局限是依赖微流控专业知识、对组织处理敏感以及无法解析亚细胞细节。Slide-seq2 通过使用密集包装的 DNA 条形码珠以约 10 μm 分辨率映射基因表达，改进了 slide-seq 的 RNA 捕获效率。其优势包括成本效益、可扩展性以及接近单细胞的空间分辨率。缺点包括潜在的数据稀疏性以及对亚细胞分析的有限分辨率。HDST（高定义 ST）使用较小的条形编码珠实现 2 μm 分辨率的 ST。它能够实现接近亚细胞的 RNA 映射与超高空间精度。挑战包括较低的 RNA 捕获效率、计算复杂性以及对专用仪器设备的要求。PIXEL-seq 使用具有空间条形编码的微孔阵列以单细胞分辨率分析基因表达。它提供高空间精度、可扩展性以及基于测序的数千个基因的检测。其局限包括微制造复杂性、对组织质量的敏感性以及计算开销。Seq-Scope 通过使用密集包装的 DNA 纳米球作为空间条形编码锚点实现超高空间分辨率（约 0.5 μm）。它擅长亚细胞 RNA 映射并实现全转录组分析。然而，它需要专用玻片、复杂的工作流程以及大量的计算资源。Stereo-seq（空间增强分辨率组学测序）使用 DNA 纳米球实现超高空间分辨率（约 0.5 μm）与大面积组织覆盖。它是数千个基因的亚细胞与全器官映射的理想选择。缺点是其复杂的设置、计算需求以及专用仪器设备的需求。TIVA Tag（活体转录组分析标签）使用光活化探针选择性捕获活组织内活细胞中的 RNA。其关键优势为靶向 RNA 分析、活细胞兼容性与最小扰动。局限包括低通量、有限的多重分析以及对光化学活化的依赖。LCM-seq（激光捕获显微切割测序）将精确的基于激光的组织切割与 RNA-seq 相结合，对来自特定组织区域的转录组进行谱分析。它提供高空间精度、与 FFPE 组织兼容以及区域选择上的灵活性。缺点是其耗力的工作流程、较低的通量以及批量分析性质。ZipSeq（基于邮编的连续条形编码）使用光活化条形码与基于光的激活在活体组织中空间标记 RNA 以进行测序。它提供靶向的、灵活的空间分析，具有活细胞兼容性与连续条形编码。然而，它需要精确的光激活设置、有限的通量以及预定义的空间靶向。

空间转录组学与动脉粥样硬化（Spatial transcriptomics and atherosclerosis）

ST 方法已被证明是理解动脉粥样硬化分子机制、对斑块形成、进展与破裂提供洞见的强大工具。例如，Sun J 等人的研究使用 10x Genomics Visium 平台识别了人颈动脉斑块中不同区域的独特转录特征，凸显了斑块破裂发生的近端与最狭窄区域的脆弱性。空间 RNA-seq 揭示了差异表达基因如基质金属肽酶 9，可作为治疗靶点。类似地，Ravindran A 与同事最近的研究将 ST 应用于动脉粥样硬化斑块中，揭示了平滑肌细胞特异性基因表达，鉴定了可能在细胞外基质稳定性中起作用的新基因如 Itih4（基于 Molecular Cartography 原位杂交 ISH 平台）。2023 年，一项研究使用 ST 调查动脉粥样硬化斑块中的克隆性，揭示了平滑肌细胞的多克隆与克隆扩增，特别是在不稳定斑块中，这可能影响斑块稳定性（BaseScope ISH、10X Genomics Visium）。类似地，另一组研究定义了稳定与不稳定冠状动脉斑块中细胞特异性与区域性的转录改变，从而凸显了涉及斑块不稳定性的促炎与促血栓通路（GeoMx Digital Spatial Profiling）。此外，ST 帮助 Sukhanov S 等人识别了晚期斑块区室中的全局转录组变化，揭示了 IGF-1 在稳定斑块中的作用（10x Genomics Visium）。此外，2024 年的研究已使用 ST 揭示了大隐静脉移植物中的转录变化，与炎症和组织重塑相关的通路相关联，这些变化促成静脉移植物疾病（10x Genomics Visium）。通过将 ST 与成像相结合的方法，能够检测易损斑块，将光声信号与炎性巨噬细胞及关键生物标志物相关联（通过共检测索引 CODEX 进行免疫荧光成像，10X Genomics Visium）。所有这些研究都表明 ST 如何为理解动脉粥样硬化的复杂分子景观及其并发症提供关键的空间分辨率，从而为疾病机制与治疗策略提供宝贵洞见。

空间条形编码方法：未来？（Spatial barcoded methods: the future?）

空间条形编码方法涉及使用空间组织阵列从透化组织切片中捕获转录本以进行 RNA-seq 分析。这些技术与基于 3' 的 scRNA-seq 具有相似之处，包括使用扩增与测序处理手柄、条形码、UMI 与多聚-T 引物来捕获多聚腺苷酸化的转录本。然而，与 scRNA-seq 中每个液滴具有自己的条形码不同，这些技术对阵列中的每个点位使用独特的条形码。在这些技术中，每个空间条形码的空间位置在捕获多聚腺苷酸化转录本之前是预先确定的。这意味着空间位置信息被编码在条形码本身内，而不是依赖于特定感兴趣区域的选择与分离。虽然这些技术提供转录组范围的覆盖，但它们不提供单细胞分辨率。分辨率由阵列上点的大小、形状与间距决定。

10X Genomics Visium HD 基于空间条形编码技术，是当前时代最受欢迎的技术。Visium HD 玻片包含 4 个捕获区域，每个区域有 5000 个以六角形配置排列的条形码点位，每个点位含有数百万个具有该点位特有的空间条形码的捕获寡核苷酸。Visium HD 玻片上的每个点位为 2 μm，点位之间没有距离，与原始（低密度）Visium 技术（点位为 55 μm，点位中心到中心距离 100 μm）形成对比。与其前身相比，Visium HD 方法能够在空间水平上实现单细胞转录组学，尽管理论上该分辨率足以识别单个细胞。该方法受特定组织类型与样品（新鲜、冷冻或——历史上的——FFPE 包埋）的影响。然而，Visium（HD）当前的流行可归因于其易于在现有实验室基础设施中适配。Visium 最初为新鲜冷冻组织与 3' Illumina 测序设计，最近已被改造用于 FFPE 组织。此外，Visium 已用于 Nanopore 长读测序以定量同种型。

展望（Outlook）

细胞与其在组织样品中相对位置之间的关系对于理解疾病病理至关重要。ST 使科学家能够测量组织样品中的所有基因活动并映射这些活动发生的位置，从而更好地理解生物学过程与疾病。作为一个快速发展的领域，它在推进我们对动脉粥样硬化中复杂生物系统的理解方面具有巨大前景。空间分辨率与灵敏度的改进将实现对组织内基因表达模式更精确的映射，使细胞异质性与空间组织的更精细细节得以捕获。例如，内皮-间质转化（EndoMT）是动脉粥样硬化的标志并与斑块不稳定性的增加相关。研究 EndoMT 具有挑战性，涉到特定小鼠品系的培育。在人斑块中原位应用 ST 可能有助于解决目前关于 EndoMT 发生所需的细胞轨迹与转化中基因与分子通路的问题。此外，将 ST 数据与其他组学数据（例如 scRNA-seq 与表观基因组分析）相整合将提供对组织内分子景观与调控网络更全面的视角。尽管全基因组关联研究已揭示数百个赋予心血管疾病风险及其亚临床表现的遗传变异，它们在原位的效应——特别是在血管床空间背景下细胞内基因调控网络中的效应——往往不明确。将 ST 与低覆盖全基因组测序相结合可揭示种系变异如何在空间背景下影响细胞表达。造血干细胞中的体细胞突变可导致克隆造血，这一过程通常被称为"潜能未定的克隆造血"（CHIP）。CHIP 患者具有增加的动脉粥样硬化风险，通常归因于携带 DNMT3A、TET2 与 ASXL1 等基因体细胞突变的血细胞克隆扩增。在原位（即在空间背景下细胞中）研究 CHIP 具有挑战性。然而，将 ST 方法与深度全基因组测序相结合可能富有洞见。

计算方法与生物信息学工具的进步将促进大规模 ST 数据集的分析与解读（一个主要的例子是社区驱动的 CellxGene），从而能够发现新的空间调控基因与通路。最后，将 ST 与临床数据与疾病模型相结合在理解疾病机制、识别生物标志物与开发靶向治疗方面具有巨大潜力，前提是需要足够的样品以获得有意义的洞见。总体而言，ST 的未来前景光明，在揭示空间基因表达复杂性及其对组织功能与心血管疾病影响方面具有令人兴奋的机会。

本章个人批注

本章作为全书的"方法学枢纽"，功能定位介于前面的基础理论（ch1–ch7 的调控机制、ncRNA、表观转录组）与后面的应用章节（ch9 动物-人桥接、ch10 临床转化、ch17 循环 RNA 生物标志物）之间。读完本章的最大感受是：动脉粥样硬化的转录组学研究正经历从"批量平均"到"空间分辨"再到"多组学整合"的范式跃迁——bulk → scRNA-seq → ST → multi-omics 的演进脉络清晰可辨，且每种方法都对应着对细胞异质性不同维度的解析能力。

关于方法选择的几点观察：（1）靶向方法（qPCR、微阵列、靶向 RNA-seq）在临床转化场景下仍然不可替代，特别是当目标基因集合已明确时（如 FIMICS panel 中 3000 种 lncRNA）；（2）非靶向 scRNA-seq 与 ST 在发现阶段具有不可替代的价值，特别是在识别 SMC 表型转换（成骨软骨样、纤维肌细胞样、泡沫细胞样、干细胞样）与巨噬细胞亚群时；（3）ONT DRS 在表观转录组学中具有独特地位，因为它能直接检测 m6A 等修饰而无需 RT 步骤，这与 ch7 表观转录组学主题直接呼应。

值得在 ch9（动物-人桥接）和 ch10（临床转化）重读时回顾的几个具体技术点：（1）ONT DRS 的"无 RT"特性如何为 in vivo 修饰检测提供新视角；（2）Visium HD 2 μm 分辨率对小鼠品系 EndoMT 研究的可能贡献（与 ch13 基因调控网络相关）；（3）CHIP 突变（DNMT3A、TET2、ASXL1）的空间映射可能将克隆造血与斑块微环境关联起来（与 ch11 性别二态性主题中的炎症机制潜在联系）。

与上下章的衔接（一段话）

本章在全书结构中处于"方法论核心"位置，恰位于 ch7（表观转录组学的生物学机制）之后、ch9（动物-人桥接的转化研究）之前。ch7 末尾对 m6A 与 A-to-I 修饰机制的生物学介绍，需要在方法学层面回答"如何检测这些修饰"——本章的 ONT DRS 章节直接承接这一需求，详细描述了通过纳米孔直接检测 RNA 修饰的工作原理与算法（m6A 在电信号中产生特征性偏移）。同时，本章为 ch9 的转化研究铺设了技术基础：scRNA-seq 揭示的 SMC 表型转换谱与巨噬细胞亚群（resident-like、inflammatory、foamy/TREM2hi、proliferating、IFN-inducible）将在 ch9 中被用于跨物种比较；ST 方法（Visium、GeoMx DSP、MERFISH）将在 ch9 与 ch12（多组学整合）中被进一步用于人斑块的空间分辨研究；CHIP 突变（DNMT3A、TET2、ASXL1）的空间映射与 EndoMT 研究的展望，则分别预演了 ch11（性别偏向机制中涉及免疫调控与体细胞突变）和 ch13（基因调控网络中涉及细胞轨迹与转化）的主题。作者将方法学章节独立成篇，使后续各章可专注于生物学发现本身，而不必在每章内重复技术细节。