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Chapter 08

作者

Jessica J. Senior University of Huddersfield, Huddersfield, UK Email: j.j.senior2@hud.ac.uk

本章作者是 Ch 3 (Wound Healing) 的同一作者(同机构同团队)。Springer Nature 2024,DOI: 10.1007/978-3-031-64532-7_8。

内容概述

本章系统综述 3D 生物打印(bioprinting)用于细胞迁移研究。结构: (1) 3D bioprinting workflow — 5 阶段:(a) Model Design(细胞 + 聚合物选择,蛋白水凝胶如 collagen/gelatin/Matrigel 提供 RGD 黏附序列,多糖水凝胶如 alginate/gellan/pectin/agarose 类似 GAG,合成水凝胶如 polyamide/PEG 生物相容性较差), (b) Print Design(CT/MRI/CAD → STL → G-Code,例如 INKREDIBLE 打印机 Cellink 用 'M760' 开阀 + 'G1 X1.236 Y4.611 E0.01212' 移动打印头), (c) Model Fabrication(bioink 配制 + 沉积,核心权衡:高黏度=高打印保真度但低细胞活力,低黏度=高细胞活力但低形状保持,embedded bioprinting 用 sacrificial 储层解决——SLAM 用 agarose 流体凝胶支持), (d) Model Propagation(化学诱导剂如 IBMX/indomethacin/dexamethasone 促 PPARγ 脂肪生成,β-glycerophosphate/ascorbic acid 促骨生成,物理条件如低氧模拟肿瘤核心 + 空气-液体界面模拟 epidermis + 力学加载模拟 tendon), (e) Application(药物发现/化妆品测试/组织建模与再生/医疗器械)。 (2) 3 种 3D bioprinting 技术: - LIFT (laser-induced forward transfer):激光脉冲聚焦玻璃带 → 高压气泡 → 推动 bioink。最高分辨率(微-纳米级),无喷嘴,但激光热损伤影响细胞活力,慢速,昂贵。 - Inkjet printing (droplet on demand):两种模式——thermal(电加热产生蒸汽泡)和 piezoelectric(机械振动)。gelation 快,分辨率好,便宜,但仅适合低黏度材料,喷嘴尺寸与细胞大小相当(易堵)。 - Robotic dispensing (extrusion bioprinting):连续挤出的方式,分气动/活塞/螺杆。最具临床转化潜力,黏度范围广,但分辨率低,螺杆式喷嘴压降大可能伤细胞。 (3) 3D bioprinted migration models: - Cancer: ① Drop-on-demand + RGD-peptide hydrogel 比较 MCF7(non-invasive,增殖但低 invasion) vs MDA-MB-231(invasive,stellate 形态,EMT)——ROCK 抑制剂显著抑制 MDA-MB-231 迁移;② 神经母细胞瘤 (IMR5) + HUVEC + GelMA 在 Carbopol 支持下共打印,神经母细胞瘤向 HUVEC 方向迁移 + HUVEC 浸润肿瘤低氧区;③ LIFT + 乳腺球体 + 脂肪来源干细胞,高 BMI 脂肪细胞促乳腺癌细胞跨珠迁移(obesity-breast cancer 机制)。 - Skin: ① SLAM 三层皮肤(epidermis + dual dermis + hypodermis) 用 pectin/collagen + keratinocytes + HDF + ADSC 植入猪伤口模型,内外细胞迁移整合;② 体内原位生物打印(inkjet) 直接打印 autologous 角质细胞 + 纤维蛋白-胶原到患者伤口,促再上皮化。 - Muscle: ① C2C12 myoblast + 微图案化 GelMA 平行/垂直/指纹状 → 定向集体迁移,可形成收缩性 myotubes(电刺激响应)甚至模拟人虹膜;② 人肌祖细胞 + fibrinogen/gelatin/HA/glycerol + 气动打印 → 多层肌纤维植入大鼠,血管化 + 功能恢复。 Take-Home: 3D bioprinting 是制造"复杂 3D 迁移微环境"的多学科方法(工程+细胞生物+材料+医学),其工业化发展将持续支持迁移机制研究和再生医学。

核心方程与概念

  • 3D bioprinting 的"5 步工作流"决策矩阵: $\(\text{Step 1: 选细胞 + 聚合物} \to \text{Step 2: 3D 数字化设计} \to \text{Step 3: bioink + 打印}\)$ $\(\to \text{Step 4: 培养成熟} \to \text{Step 5: 应用(药物/植入)}\)$

  • Bioink 黏度-细胞活力的"trade-off"方程: $\(\eta_{\text{bioink}} \uparrow \Rightarrow \text{print fidelity} \uparrow, \quad \eta_{\text{bioink}} \uparrow \Rightarrow \text{shear stress on cells} \uparrow \Rightarrow \text{viability} \downarrow\)$ $\(\tau_{\text{shear}} = \eta \cdot \dot{\gamma} \propto \eta \cdot \frac{v}{r_{\text{nozzle}}}\)$ SLAM 解决方案:用低黏度 bioink + 高黏度 support bed(agarose 流体凝胶)分离"打印性"与"细胞活力"。

  • 打印参数化的"5 维": $\((\text{nozzle gauge}, \text{print pressure}, \text{print speed}, \text{gelation kinetics}, \text{collector platform})\)$

  • Nozzle gauge: 20-32 G,影响剪切应力和分辨率
  • Print pressure: 10-100 kPa,影响挤出速率
  • Print speed: 1-50 mm/s,影响沉积时间
  • Gelation: 离子交联(alginate+Ca²⁺)/温度(gelatin)/酶(transglutaminase)/UV(MeGel)

  • Collector: 平板 vs 悬浮支持凝胶

  • GelMA (gelatin methacrylate) 的"UV 交联"分子方程: $\(\text{Gelatin} + \text{methacrylic anhydride} \to \text{GelMA (含 C=C 双键)}\)$ $\(\text{GelMA} + h\nu + \text{photoinitiator (Irgacure 2959)} \to \text{Crosslinked hydrogel}\)$ GelMA 是明胶 + 甲基丙烯酸酯的化学改性,保留 RGD(细胞黏附) + 可 UV 交联(快速固化),是 bioprinting 最流行的生物墨水之一。

  • 3D bioprinting 三种技术的"参数-能力"对比:

技术 分辨率 黏度范围 速度 细胞活力 成本
LIFT 微-纳米级 (~1 μm) 广 (solid + liquid donor) 慢 中(热损伤) 高
Inkjet (thermal/piezo) 中 (~10-50 μm) 仅低黏度 (<10 mPa·s) 快 中(剪切+热) 低
Robotic (pneumatic/piston/screw) 低 (~100-500 μm) 广 (10²-10⁶ mPa·s) 中 中-高(低剪切) 中-高

  • RGD peptide 与"细胞黏附"的关键: $\(\text{RGD (Arg-Gly-Asp) 序列} + \text{integrin} \to \text{focal adhesion formation} \to \text{迁移起始}\)$ 蛋白水凝胶(collagen/gelatin/fibrin)天然含 RGD;多糖水凝胶(alginate/agarose)需外源添加 RGD 才能支持细胞黏附。

  • Embedded bioprinting (SLAM) 的核心逻辑: $\(\text{低黏度 bioink} \to \text{挤入高黏度 support bed} \to \text{support 保持形状} \to \text{交联} \to \text{移除 support}\)$ 这是"打印性"和"细胞活力"解耦的优雅方案,Senior 团队(Ch 3/7/8)是该方法的早期开发者。

  • Cancer 迁移模型的"侵袭性维度":

  • MCF7:non-invasive,上皮样,增殖但低迁移
  • MDA-MB-231:invasive,间充质样,stellate 形态,RGD-依赖,ROCK 抑制剂响应
  • E-cadherin vs vimentin 染色可区分 EMT 状态

  • 高 BMI 脂肪细胞促 EMT:E-cadherin / β-catenin / tenascin C 阳性

  • Skin 三层模型的"解剖学对应": $\(\text{epidermis: keratinocytes (HEK) + 空气-液体界面}\)$ $\(\text{papillary dermis: 疏松 collagen + HDF}\)$ $\(\text{reticular dermis: 致密 collagen + HDF}\)$ $\(\text{hypodermis: ADSC 分化 adipocytes + 皮下脂肪}\)$

  • Skeletal muscle bioprinting 的"功能验证": $\(\text{C2C12 myoblast} \xrightarrow{\text{微图案化 GelMA}} \text{myotube} \xrightarrow{\text{电刺激}} \text{收缩}\)$ $\(\text{虹膜模型: 径向 + 环形纤维} \to \text{瞳孔扩张/收缩}\)$ 力学输出可用原子力显微镜或牵引力显微镜量化。

关键结论

  • 3D bioprinting 是"组织工程 + 迁移研究"的交叉点:从单纯的支架制造(scaffold)到功能化组织模拟(包含细胞 + ECM + 力学 + 化学梯度),这与传统 2D 培养 + transwell 范式形成质变。

  • 5 步工作流是"标准但可定制":每个新组织都需重新选择细胞 + 聚合物 + 打印技术 + 培养条件,没有"通用"流程。

  • Bioink 黏度-细胞活力的 trade-off 是核心挑战:高黏度利于保真度,低黏度利于细胞活力。Embedded bioprinting (SLAM) 通过引入支持储层巧妙解决了这个矛盾——Senior 团队(Moakes 2021 APL Bioeng [X1])是该方法的代表。

  • 三种打印技术的选择矩阵清晰:

  • LIFT:高分辨率 + 高成本 + 慢速 + 热损伤,用于高分辨小尺度
  • Inkjet:低成本 + 快速 + 仅低黏度,用于高通量筛选小模型

  • Robotic dispensing:中-高黏度 + 临床相关尺寸,用于组织工程植入 没有"最好"的技术,只有"最适合"的技术。

  • Cancer bioprinting 揭示"细胞类型-RGD-刚度"的相互依赖:

  • non-invasive MCF7:在不同刚度/RGD 下都增殖
  • invasive MDA-MB-231:RGD 必需(RGD 缺失则低增殖),Rho/ROCK 抑制剂显著降速

  • 这为RGD 拮抗剂作为抗侵袭药物提供了机制基础

  • Neuroblastoma + HUVEC 共打印显示"肿瘤 + 血管"双向迁移:神经母细胞瘤向 HUVEC 迁移 + HUVEC 浸润肿瘤低氧区。这是血管共培养的临床前模型,可替代部分 PDX 实验。

  • "肥胖-乳腺癌"的 bioprinted 机制证据:高 BMI 脂肪细胞 vs 正常 BMI 脂肪细胞共打印,高 BMI 显著促乳腺癌细胞迁移(EMT 标志物阳性)。这与"代谢-肿瘤"轴的临床流行病学一致,且在体外验证。

  • 三层皮肤 + 猪伤口模型 = 临床前金标准:Senior 团队的 SLAM 三层皮肤(papillary + reticular dermis + hypodermis)+ 自体细胞 + 植入猪伤口,实现内外细胞迁移整合——是皮肤组织工程的高级形态。

  • 体内原位 bioprinting 是"新前沿":直接打印自体细胞到患者伤口(烧伤、溃疡、深组织损伤),省去体外培养时间,有望成为"床旁打印"技术。

  • Muscle bioprinting 实现"功能化肌纤维":C2C12 + GelMA 微图案 → 收缩性 myotubes(电刺激响应)→ 模拟虹膜径向/环形纤维 → 真正"功能性肌肉组织"。

  • 人肌祖细胞 + 大鼠植入模型 = 临床转化路径:human-scale 肌纤维 + 大鼠血管化 + 功能恢复,显示"人源细胞 → 动物植入 → 功能验证"完整路径。

  • 3D bioprinting 是"研究"与"转化"的双重工具:既可作机制研究平台(精确控制 ECM 成分 + 细胞比例),也可作临床转化工具(组织工程 + 药物筛选)。

挑战和开放性问题

  1. "打印性-细胞活力"的根本性 trade-off:虽然 SLAM 部分解决,但高密度细胞(>10⁷/mL)+ 高保真度仍困难。
  2. 规模化制造:临床相关尺寸(如人肝、心)需厘米级打印,多喷嘴同步 + 长时间打印+ 长时间培养的稳定性是工程挑战。
  3. 血管化:3D 打印组织 >200 μm 厚度需要功能性血管网络支持营养和氧气。当前做法是"打印后体内血管化"(依赖宿主血管长入),但慢且不完全。
  4. 免疫相容性:异种细胞打印的免疫排斥,以及水凝胶降解产物的免疫反应。
  5. 力学性能的"时间演化":水凝胶在打印时和培养成熟后力学性能差异大(降解 + 重塑),长期功能稳定性需监测。
  6. 标准化与监管:3D 打印组织是"个性化"还是"标准化产品"?涉及FDA / EMA / NMPA 的监管路径不明,目前以"医院内特殊制备"为主。
  7. 复杂组织(脑、心、肝)的细胞异质性:一个脑组织含神经元 + 胶质 + 内皮 + 血管周细胞 + 巨噬,多细胞比例和空间分布的精确打印仍困难。
  8. 力学刺激的集成:心跳/呼吸/血压对细胞有动态力学刺激,但 3D 打印组织在体外通常静态培养。力学 bioreactor 集成是下一步。
  9. "原位打印"的精度与安全性:直接在患者伤口打印需要无菌 + 实时成像 + 机械精度,临床安全和精度双重挑战。
  10. 商业化路径:3D 打印器官(Organovo 等公司)已上市,但市场小、成本高。规模化生产 + 报销路径仍不清晰。

个人反思与批判性分析

1. 章节是 Senior 团队工作的高度集中 — J.J. Senior 在 Ch 3 (Wound Healing) + Ch 7 (Methods) + Ch 8 (Bioprinting) 出现三次,体现 Huddersfield 团队在"皮肤伤口愈合 + 3D bioprinting"的专长。整个 Part II 方法学章节 + Ch 8 都反映了 Huddersfield 团队的方向,其他方法(微流控、电纺丝、AFM 等)提及较少。 这对直接复用很友好,但对方法学广度不利。

2. 章节的"工程化"语言 vs Ch 6 "物理学化"语言的对比: - Ch 6(计算建模)用数学语言(方程, 代码, Reynolds 数) - Ch 7(实验方法)用分子-细胞生物学语言(试剂, 仪器, 步骤) - Ch 8(生物打印)用工程化语言(打印参数, G-Code, 黏度 trade-off) 三种语言反映了三种方法学的"学科腔调",也提示生物医学的跨学科整合需要"语言翻译"。

3. "Bioink 黏度-细胞活力 trade-off"是工程化核心矛盾: - 这与血管生物力学中"血管壁硬度-细胞响应"问题同源——力学性质与生物功能之间的张力 - Senior 团队的 SLAM 解决方案(支持储层)是优雅的工程解耦——这是 21 世纪生物工程的代表思路 - 对本人研究:血管壁的"软-硬"梯度如何用 3D 打印模拟?这需要可变刚度的多层结构

4. 章节对"力学-生物耦合"的处理仍较浅: - 章节描述了力学条件(机械加载)对 tenocyte/fibrocyte 表型的维持,但没有给出"力学信号如何被细胞感知"的分子机制 - 缺少对剪切应力、循环拉伸、基质刚度梯度的详细处理 - 这与 Ch 5 Wei 2015 Twist-G3BP2 (刚度-EMT) 形成对比——3D bioprinting 章节未充分整合这个机制

5. 章节的"临床转化"语调浓厚,但缺乏对失败案例的反思: - Organovo 等公司的 3D 打印肝组织(2014)曾备受关注,但商业上不成功(2020 退出市场) - 这与"3D 打印器官 = 解决器官短缺" 的乐观叙述形成对比 - 章节对失败原因(细胞活力、规模化、血管化、免疫排斥)的讨论偏少

6. 章节引用与文献覆盖: - 主要文献覆盖至 2021-2022 年 - 关键 reference: Moakes 2021 APL Bioeng X1, Sbirkov 2021(结直肠癌 3D bioprinting), Papaioannou 2019(血管生物打印综述) - 缺少对iPSC 衍生细胞在 3D bioprinting 中应用的近期综述(2020+) - 缺少对中国/亚洲团队的工作引用(清华、四川大学、中国科学院等)

7. 与本人血管生物力学研究的具体连接: - 血管生物打印是直接相关——已有团队打印多材料血管结构(PCL + GelMA + 内皮/平滑肌/成纤维) - SLAM 思路可应用于血管壁多层结构(内-中-外膜)打印——三层 + 不同细胞 + 不同基质 - 力学 bioreactor集成:循环拉伸(模拟脉动血流) + 剪切(模拟血流) + 压力(模拟血压) → 3D 打印血管"活体训练" - RGD 与细胞黏附——可设计"无 RGD 外层 + RGD 内层"的血管结构,模拟"内皮需黏附但中膜需可塑" - 力学-生物耦合研究:"刚度梯度血管"可作为动脉粥样硬化的体外模型(健康血管各层刚度均匀,病变血管局部钙化导致刚度不均)

8. 章节缺乏"计算建模"的整合: - Ch 6 的 SPP/Vicsek 模型完全没在 Ch 8 引用 - 3D bioprinting 模型中的细胞迁移应该可用 SPP 框架建模 - 这与 Ch 7 的批评一致:Part II 的"实验 vs 建模"分离是结构性缺陷

9. 章节的"小尺度验证 → 大尺度临床"鸿沟: - 章节报告的多是毫米-厘米级的实验室构造 - 临床相关尺寸(>5 cm)需要多个 3D 打印构造的组装+ 血管化+ 神经支配+ 长期培养 - 这之间的工程鸿沟远大于"3D bioprinting 章节"所呈现

10. 章节对伦理-监管-商业的回避: - 3D 打印器官涉及"我是否拥有一个心脏?"的伦理问题 - 涉及FDA 个性化医疗器械的监管路径 - 涉及"打印生命"的边界(打印人胚胎?打印带有人类细胞的嵌合体?) - 章节对这些问题基本未触及——这是生物医学工程的伦理盲点

重要参考文献

[X1] Moakes R, Senior J, Robinson T, Chipara M, Atansov A, Naylor A, et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioeng 2021;5(4):046103. doi:10.1063/5.0061361. PMID: 34703964 [X2] Sbirkov Y, Molander D, Milet C, Bodurov I, Atanasov B, Penkov R, et al. A colorectal cancer 3D bioprinting workflow as a platform for disease modeling and chemotherapeutic screening. Front Bioeng Biotechnol 2021;9. doi:10.3389/fbioe.2021.755406 [X3] Papaioannou T, Manolesou D, Dimakakos E, Tsoucalas G, Vavuranakis M, Tousoulis D. 3D bioprinting methods and techniques: applications on artificial blood vessel fabrication. Acta Cardiol Sin 2019;35(3):284-9. doi:10.6515/ACS.201905_35(3).20190415A. PMID: 31249589 [X4] Sabnis N, editors. Cell migration in three dimensions. Methods Mol Biol (MIMB) 2023;2068. (Cited as related volume) [X5] Riahi R, Yang Y, Zhang DD, Wong PK. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom 2012;17(1):59-65. doi:10.1177/2211068211426550 [X6] Senior JJ, et al. (3D bioprinting of cancer models with stiff and RGD-defined hydrogels). cited in Ch 8 [X24] [X7] Horder H, Guaza Lasheras M, Grummel N, Nadernezhad A, Lode A, Sonntag F, et al. Bioprinting and differentiation of adipose-derived stem cell spheroids for bone tissue engineering using a drop-on-demand bioprinting system. Biofabrication 2021;13(3):035042. doi:10.1088/1758-5090/abff31 [X8] Joung D, et al. 3D printed stem-cell derived neural organoids and injured spinal cord models. Sci Adv 2020;6(18):eaay1421. (Cited in section 4.3 muscle context) [X9] Bhattacharjee N, Urrios A, Kang S, Folch A. The upcoming 3D-printing revolution in microfluidics. Lab Chip 2016;16(10):1720-42. doi:10.1039/c6lc00163g. PMID: 27101183 [X10] Datta P, Barui A, Wu Y, Ozbolat V, Moncal KK, Ozbolat IT. Essential steps in bioprinting: From formulation to printed construct. Bioprinting 2018;12:e00076. (General 3D bioprinting workflow) [X11] Hinton TJ, Jallerat Q, Palchesko RN, Park JH, Grodzicki MS, Shue H-J, et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv 2015;1(9):e1500758. doi:10.1126/sciadv.1500758. (Original FRESH/SLAM method) [X12] Ouyang L, Highley CB, Sun W, Burdick JA. A generalizable strategy for the 3D bioprinting of hydrogels from non-viscous photo-crosslinkable inks. Adv Mater 2017;29(8):1604983. doi:10.1002/adma.201604983 [X13] Murphy SV, Atala A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol 2014;32(8):773-85. doi:10.1038/nbt.2958. PMID: 25093879 [X14] Daly AC, Prendergast ME, Hughes AJ, Burdick JA. Bioprinting for the biologist. Cell 2021;184(1):18-32. doi:10.1016/j.cell.2020.12.002. PMID: 33417863 [X15] Duchi S, et al. Handheld coaxial bioprinting: application in skin wound healing. Biofabrication 2020;12(2):025002. (Handheld in situ bioprinting)