第 91 章：氧化应激、内皮功能障碍及其对平滑肌信号的影响（Oxidative Stress, Endothelial Dysfunction, and Its Impact on Smooth Muscle Signaling）

INTRODUCTION

内皮作为血管壁最内层的单层连续细胞，传统上被视为防止血管腔内大分子无序扩散到组织间隙的选择性屏障。过去二十年间,人们认识到内皮还具有调控血管张力、调节炎症、抑制或促进血管生长、调节血小板聚集和凝血等多种功能。内皮功能障碍是冠状动脉粥样硬化患者的特征性表现,其机制复杂且多因素,越来越多的证据表明活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)产量的增加在其中起到关键作用。ROS 产生不仅发生在内皮细胞层,也可发生在血管中膜与外膜,从而损害血管组织内一氧化氮(nitric oxide, NO)信号通路,影响血管对内皮依赖性及非内皮依赖性舒张剂的反应性。本章将重点讨论氧化应激背景下内皮功能障碍的发生机制及其预后意义。

THE L-ARGININE/NO/CGMP PATHWAY IN VASCULAR TISSUE

随着前列环素(PGI2)、NO 等内皮自体活性物质以及整合素等表面信号分子的发现,人们对内皮在心血管调节中的理解发生了根本变化。L-精氨酸-NO-cGMP 通路是内皮调控周围细胞功能的核心信号通路之一:内皮型一氧化氮合酶(eNOS, NOSIII)以 L-精氨酸和 O2 为底物,在受体依赖性激动剂(如缓激肽、乙酰胆碱、ATP)和物理化学刺激(剪切、牵张)作用下生成 NO 和 L-瓜氨酸。

NO 扩散至邻近平滑肌细胞后,与可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase, sGC)等受体分子相互作用——sGC 是迄今最特征明确、对调控血管张力与平滑肌增殖最重要的受体。NO 的激活要求 sGC 血红素铁处于亚铁(Fe2+)状态;NO 结合后 cGMP 产量大幅增加,进而激活 cGMP 依赖性激酶 I(cGK-I),使钙激活钾通道(BK 通道)开放概率增加,引起平滑肌细胞超极化并抑制激动剂诱导的 Ca2+ 内流。激活的 cGK-Iβ 还磷酸化 IP3 受体相关的 G 激酶底物(IRAG),从而抑制激动剂诱导的 Ca2+ 释放和平滑肌收缩。VASP(46/50 kD 血管舒张剂刺激磷蛋白)是 cGK-I 在多种细胞中常见的底物,cGK-I 特异性地在丝氨酸 239 位点磷酸化 VASP,因此该反应可作为 NO-cGMP 通路完整性和活性的生化监测指标。

OXIDATIVE STRESS AND ENDOTHELIAL DYSFUNCTION

1980 年代内皮源性舒张因子被鉴定为 NO 或其密切相关的化合物。NO 具有强力的抗动脉粥样硬化特性——它与前列环素协同抑制血小板聚集、白细胞与内皮细胞的黏附及黏附分子的表达;高浓度 NO 还抑制平滑肌细胞增殖。因此,在任何出现 NO 绝对或相对不足的情况下,动脉粥样硬化进程都会启动或加速。NO 的半衰期和生物活性在很大程度上取决于氧衍生自由基(如超氧阴离子)的生物利用度——超氧阴离子与 NO 迅速反应生成高活性中间体过氧亚硝酸根(ONOO-)(二级双分子反应速率常数约 5×10^9 M-1 s-1,比 SOD 清除超氧阴离子的速度约快 3-4 倍),从而淬灭 NO。当超氧阴离子产生过量时,过氧亚硝酸根的形成成为主要潜在通路;高浓度过氧亚硝酸根具有细胞毒性,可能引起蛋白质、脂质和 DNA 的氧化损伤。新近研究还表明,过氧亚硝酸根对前列环素合酶和 eNOS 的活性与功能均有损害作用。其他 ROS,如超氧阴离子的歧化产物过氧化氢以及由激活的中性粒细胞释放的次氯酸,虽非自由基,但具有强氧化能力,会进一步加剧血管组织中的氧化应激。

ENDOTHELIAL DYSFUNCTION AND CARDIOVASCULAR RISK FACTORS

内皮功能障碍是心血管疾病的共同特征,几乎出现在所有心血管危险因素并存的情况下。已发现超过 200 种疾病或状况与内皮功能障碍相关,内皮依赖性血管舒张功能受损已在慢性吸烟者、LDL 升高的患者、I 型和 II 型糖尿病患者、高血压患者以及代谢综合征患者中得到证实。心血管危险因素对内皮功能具有协同损害作用:慢性吸烟所致内皮功能障碍与高 LDL 水平造成的损害程度相当,但二者合并则会显著加重对乙酰胆碱诱导的前臂血流量增加的损害。关键机制方面,虽然 eNOS 活性/表达改变、平滑肌对 NO 敏感性下降、ROS 对 NO 的降解增加均可能参与其中,但"超氧阴离子生物利用度增加导致 NO 降解"这一概念最具说服力——在心血管危险因素存在的情况下,急性给予抗氧化剂维生素 C 可显著改善内皮功能障碍,这支持超氧阴离子来源于血管本身、进而通过降解 NO 并形成过氧亚硝酸根来减少 NO 生物利用度的假说。另一个推论是,该机制会抑制平滑肌细胞水平上的下游信号,因为 sGC 中 Fe2+ 被氧化为 Fe3+ 后将不再对 NO 产生反应。

Role of the NADPH-Oxidase

NADPH 氧化酶最早在中性粒细胞中得到表征,其在血管内皮和平滑肌细胞中的活性在血管紧张素 II 刺激下增加。因此,在肾素-血管紧张素系统(局部或循环)激活时,血管超氧阴离子产量增加所致的血管功能障碍是合理预期。越来越多的证据表明,高胆固醇血症状态下局部肾素-血管紧张素系统被激活:高胆固醇血症动物血管及患者血小板中血管紧张素 II 受体亚型 AT1 表达增加,实验性高胆固醇血症与 NADPH 氧化酶激活相关;在冠心病患者大隐静脉中,该酶活性随危险因素的存在情况而变化,并与内皮功能平行。在动脉粥样硬化动脉中,NADPH 氧化酶亚基 gp91phox 和 nox4 在斑块肩部的表达尤为显著,可能触发斑块破裂。实验与临床研究均提供了动脉粥样硬化中肾素-血管紧张素系统受刺激、动脉壁 NADPH 氧化酶被激活的证据;在血管紧张素 II 灌注、自发性高血压大鼠及多种糖尿病模型中也观察到该酶在血管中的激活。Harrison 课题组在脱氧皮质酮醋酸盐(DOCA)-盐高血压实验动物模型中提供了关键概念验证:DOCA-盐处理诱导的超氧阴离子可被 eNOS 抑制剂 L-NAME 显著降低;p47phox 敲除动物在 DOCA-盐处理下表现出明显降低的氧化应激水平,并消除了 NOS 抑制的超氧阴离子效应,这与 eNOS 解偶联的预防相一致。

Role of the Xanthine Oxidase

黄嘌呤氧化还原酶催化次黄嘌呤经黄嘌呤生成尿酸的连续羟基化反应,该酶以两种形式存在——脱氢酶形式优先利用 NAD+ 作为电子受体但也能向分子氧提供电子;经蛋白水解裂解和巯基氧化可转变为氧化酶形式,后者向分子氧提供电子生成超氧阴离子和过氧化氢,但不还原 NAD+。与早期高胆固醇血症中黄嘌呤氧化酶表达或活性增加相一致,黄嘌呤氧化还原酶抑制剂氧嘌呤醇已被证明可减少超氧阴离子产量并改善高脂血症动物对乙酰胆碱的内皮依赖性血管舒张。其机制尚不明确,但有证据表明某些细胞因子可刺激内皮表达黄嘌呤氧化酶,或胆固醇水平升高可促使(例如肝脏来源的)黄嘌呤氧化酶释放入血并与内皮糖胺聚糖结合。人类研究结果存在矛盾:Panza 等人发现急性抑制黄嘌呤氧化酶可改善高胆固醇血症患者和糖尿病高血压患者的内皮功能障碍,但其他团队在别嘌呤醇上未观察到类似疗效;氧嘌呤醇具有与肝素结合 SOD 相当的降压效应,但对高血压患者内皮功能障碍无效;近期针对慢性充血性心力衰竭患者的研究也未能证明在常规心衰治疗基础上加用氧嘌呤醇可带来预后获益。

Uncoupled eNOS

辅酶四氢生物蝶呤(BH4)对 NOS 功能至关重要——它稳定 NOS 二聚体并提高 NOS 对 L-精氨酸的亲和力。BH4 供应受限将不可避免地导致超氧阴离子形成增加而 NO 形成减少,即 NOS 解偶联。关于 BH4 耗竭是否在体内发生这一问题更为复杂:体外研究表明天然 LDL 和氧化 LDL 可刺激内皮超氧阴离子产生,该现象可被 NOS 抑制剂 L-NAME 抑制,提示该状态下存在 NOS 解偶联,可能与过氧亚硝酸根诱导 BH4 氧化为失活的 BH2 或 BH3 自由基有关。因此 NOS 解偶联可能需要"点火"事件——由 NADPH 氧化酶和/或黄嘌呤氧化酶产生的超氧阴离子(所谓"kindling radicals")通过过氧亚硝酸根的形成增加而导致 eNOS 解偶联。值得注意的是,还原型蝶呤本身具有强抗氧化特性,Heitzer 等人测试 BH4 和四氢新蝶呤在体外对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应产生超氧阴离子的抗氧化能力时,两者清除超氧阴离子能力相当,但只有 BH4 改善了慢性吸烟者的内皮功能障碍,提示其机制是预防 eNOS 解偶联而非非特异性抗氧化。BH4 合成酶 GTP-环水解酶 I 在糖尿病、硝酸盐耐受及血管紧张素 II 性高血压等情况下表达下调,导致 eNOS 解偶联;他汀类药物和 AT1 受体阻断剂等干预可上调该酶活性与表达并使 eNOS 重新偶联。

Mitochondria

线粒体呼吸链是超氧阴离子的主要来源之一,产生的超氧阴离子可转化为 H2O2。分子氧作为细胞色素 C 氧化酶复合体(IV,呼吸链终末成分)的最终电子受体被还原为 H2O,多达 1-4% 的 O2 可能在呼吸链复合体 I 和 III 处被不完全还原生成 O2-,在过渡金属离子存在时还可形成有毒的羟自由基。高血糖或高瘦素水平等代谢改变状态与线粒体解偶联及内皮细胞 O2- 形成增加相关;超氧阴离子产量增加还可导致线粒体通透性转换孔开放、线粒体膜电位丧失及呼吸进一步解偶联,从而在缺血再灌注损伤中引起细胞死亡。新近研究确立了血管紧张素 II 灌注和硝酸盐耐受模型中线粒体与 NADPH 氧化酶之间存在交互作用:线粒体超氧阴离子产量增加可激活膜氧化酶导致内皮功能障碍,在线粒体靶向抗氧化干预下这些模型中的内皮功能障碍可被纠正。

Asymmetric Dimethylarginine (ADMA) and Endothelial Dysfunction

ADMA 是 eNOS 的无活性底物,高浓度时可能减少 NO 产生,也有证据表明 ADMA 甚至可引起 eNOS 解偶联。ADMA 水平升高已在高血压、慢性吸烟、高胆固醇血症、糖尿病及肾功能不全患者中得到证实。新近数据显示 ADMA 的预后价值附加于传统危险因素和脑钠肽等新型生物标志物之上。ADMA 合成与降解酶以氧化还原敏感方式调节——在血管氧化应激增加的所有情况下,细胞/循环 ADMA 水平升高都是可预期的;与此一致,血管紧张素 II 能通过阻止 ADMA 降解、增加其形成并减少细胞外排出而提高平滑肌细胞中 ADMA 水平。ADMA 在平滑肌细胞中形成后可能减少邻近内皮细胞 NO 产生的功能后果仍有待阐明。

Oxidative Stress and Consequences for the Activity and Expression of the Soluble Guanylate Cyclase

内皮功能障碍不仅影响内皮细胞层,也会影响平滑肌和外膜细胞层。sGC 是异源二聚体血红素蛋白,其活性呈氧化还原依赖性:NO 使 cGMP 形成增加数百倍,超氧阴离子则抑制基础和受刺激的 sGC 活性。sGC 活性不仅因 NO 生物利用度降低而间接减弱,而且被超氧阴离子直接抑制;NO 与超氧阴离子的反应产物 ONOO- 也可抑制 sGC 活性。除直接效应外,氧化应激还可改变 sGC 亚基表达。sGC 表达在转录后水平受 NO 和环核苷酸控制:使 cAMP 升高的激动剂通过 mRNA 失稳使多种细胞中 sGC mRNA 和蛋白表达降低,这一效应可被 NO 供体、心房利钠因子激活颗粒型 GC 以及稳定 cGMP 类似物 8-氯苯硫基-cGMP 激活 cGK-I 所模拟。

分子机制方面,大鼠 sGCα1 和 β1 mRNA 的 3' UTR 含多个 AUUUA 或 AUUUUA 模体(AU 富集元件, AREs),它们是这些 mRNA 快速降解的靶标并受反式作用因子调控 mRNA 稳定性。其中一个因子是 34 kDa 的普遍表达蛋白 HuR(也称 HuA),它与靶 mRNA 3' UTR 中的 ARE 结合,保护这些 mRNA 不被加速降解。在大鼠主动脉平滑肌细胞中通过 siRNA 敲低 HuR 可使 sGC 表达伴随下降,从而证明 HuR 对 sGC 表达调控的决定性作用。此外,长时间(6 小时) YC-1 激活 sGC 可降低大鼠主动脉平滑肌细胞和离体主动脉中 HuR 蛋白表达及 HuR 对 sGCα1 mRNA 的结合活性,导致 sGCα1 亚基表达减少,这些效应可被 sGC 活性抑制剂 NS 2028 阻断,表明它们源于 sGC 活性/cGMP 形成增加。cAMP 诱导的 sGC 表达下降通过相同机制实现,即 cAMP 诱导的 HuR 表达下降导致 sGC mRNA 失稳。这些发现共同提示存在由 sGC 和 HuR 形成的负反馈环路:增加的 sGC 活性将降低 HuR 表达,从而下调 sGC 并减少 cGMP 形成;反之,超氧阴离子/过氧亚硝酸根对 NO/cGMP 和 PGI2/cAMP 信号的抑制将产生相反效应,即上调 sGC,该假说与超氧阴离子生成的血管组织中 sGC 表达增加的现象相一致,但仍需进一步实验验证。

Oxidative Stress and Consequences for the Activity and Expression of the cGMP-Dependent Kinase I

先前对 cGK-I 缺陷小鼠的研究表明,该酶缺失将导致血管平滑肌中 NO/cGMP 信号通路完全中断。cGKI 在血管细胞中的活性可通过免疫检测其底物蛋白 VASP 在 Ser239 位点的磷酸化(P-VASP)来评估,该方法已成为血小板、培养的内皮与平滑肌细胞以及(近来研究的)完整血管组织中 NO/cGMP 信号通路完整性的可靠替代参数,也被证明足以监测内皮完整动脉中的基础 NO 释放。例如用 NOS 抑制剂 L-NNA 或其甲酯 L-NAME 孵育血管可显著降低 P-VASP 水平;NO 供体 SNP 和 NTG 在内皮存在或缺失时均显著增加血管 P-VASP。机械剥除大鼠和兔主动脉内皮几乎完全消除"基础"VASP 磷酸化,而总 VASP 水平(磷酸化与非磷酸化)降低约 40-50%,表明 VASP Ser239 磷酸化明确依赖于功能性内皮的存在,主动脉内皮细胞层含有大量 VASP,在内皮被剥除时即丧失。P-VASP 分析也适用于监测血管组织中氧化应激:用 Cu/Zn SOD 抑制剂 DETC 孵育内皮完整的离体血管可显著降低 P-VASP 水平,同时基础内皮 NO 形成减少、超氧阴离子形成增加。

ENDOTHELIAL FUNCTION AND PROGNOSIS

血管内氧化应激增加已被证明具有预后意义。在冠心病中,Zeiher 课题组的 Volker Schächinger 证明对冠脉内 ACh 表现为血管舒张反应的患者,随后心血管事件(心源性死亡、冠脉和外周血管重建以及脑卒中)发生率远低于表现为血管收缩反应的患者;周围血管内皮功能评估(在后勤上更可行)的预后相关性可与冠脉内皮功能研究相比。改善的流量介导舒张(FMD) 是绝经后高血压女性良好预后的独立标志,即使在矫正血压或抗高血压治疗类型之后;接受外周或冠脉搭桥手术的患者中,使用肱动脉 FMD 评估周围内皮功能已被证明是心血管事件风险分层的良好工具——Cox 比例风险模型显示,事件发生的独立预测因素为年龄、肾功能不全、未行颈动脉手术和较低的肱动脉流量依赖性舒张;以 8.1% 为 FMD 切点,内皮功能预测事件发生的敏感性为 95%、特异性为 37%、阴性预测值为 98%。Gokce 等人在 199 例外周动脉疾病接受择期搭桥手术的患者中证明,术后发生心血管事件者肱动脉 FMD 明显受抑(4.4 ± 2.8%) 而无事件者为 7.0 ± 4.9%。后续研究也揭示了内皮功能障碍与慢性充血性心力衰竭、原发性高血压患者预后之间的强相关性,以及 FMD 恶化是支架内再狭窄发生的负向预后因素。然而,虽然 FMD 在多种情况下是未来心血管事件的有效预测因子,但大型研究表明在老年人中该方法对传统心血管危险评分预后准确性的增量贡献仅约 1%,这促使人们开发低流量介导的血管收缩等新工具以增加信息量。新近数据显示周围内皮功能也具有预后意义:发生心血管事件的患者对前臂动脉内输注内皮依赖性血管舒张剂乙酰胆碱的最大前臂血流量明显降低,急性维生素 C 挑战的反应也明显更强;内皮功能被抗氧化剂维生素 C 改善(即存在氧化应激诱导的内皮功能障碍) 的患者预后更差,这一发现进一步支持氧化应激在决定内皮功能障碍程度及冠心病患者预后中的关键作用。

CONCLUSION

近二十年来,已有多种方法可对冠脉和周围动脉的内皮功能与功能障碍进行简单可靠的评估。内皮功能障碍的机制复杂且多因素,但主要涉及 ROS 的产生——不仅发生在内皮细胞,也发生在平滑肌细胞中。NADPH 氧化酶产生的氧化应激增加可能导致 eNOS 解偶联,使该酶从 NO 合成酶转变为超氧阴离子产生酶;此外,平滑肌细胞中 ROS 产量增加会负面影响 sGC、cGMP 依赖性蛋白激酶和磷酸二酯酶等重要 NO 信号酶的活性与表达。针对已确诊冠心病、心血管危险因素及充血性心力衰竭患者的研究清楚表明,内皮功能障碍具有根本性的预后意义。非侵入性测量内皮功能的能力已帮助我们理解亚临床动脉粥样硬化发展的病理生理过程;此外,患者将获得关于其血管状态以及生活方式改变和/或药物治疗如何有利影响其血管功能的重要反馈信息,反过来也将显著提高患者依从性。

本章个人批注

本章是一篇 17 页的临床-基础综述,核心叙事线是"氧化应激→NO 降解/eNOS 解偶联→sGC 与 cGK-I 失能→血管反应性下降→心血管事件增加"。读完印象最深的有三点:第一,机制图把"内皮、血管中膜、外膜"三层都纳入,这一点和 Hill 这本书里其他平滑肌章节只谈"平滑肌本身"形成对比,符合血管是一个器官而非单一细胞类型的现代视角。第二,eNOS 解偶联是本章的一个概念性枢纽——BH4 缺失或被氧化后,eNOS 反而变成超氧阴离子产生酶,把"内皮保护者"变成"内皮杀手",这个反向角色转换是后续几十年 sGC 激动剂、NO 供体+抗氧化联合治疗策略的逻辑起点。第三,本章的预后数据集中在 2000 年代初期(Schächinger 2000、Heitzer 2001、Gokce 2002/2003 等),把"内皮功能检测 = 预后指标"建立成可临床操作的工具,但同时也诚实指出 FMD 在传统危险评分基础上仅增加约 1% 的预测力,这种"机制强、临床增量小"的张力是 2010 年代以来 FMD 退潮、血管内皮向 microRNA/循环标志物等方向让位的伏笔。源文事实点充分,但"对 X 的临床意义/反思/连接"等扩展内容我没有写入内概述,只在本节记录。

与上下章的衔接（一段话）

按 Hill 2012 的章节安排,本卷第四部分(Smooth Muscle)按"基础生理→特化床(子宫/微循环)→病理状态"展开,ch88 讨论平滑肌表型异质性、ch89 切入微循环、ch90 谈子宫平滑肌、ch91 则是这一脉络中唯一一篇把内皮作为主角、把"内皮-平滑肌"作为一个耦合单元来谈氧化损伤的章节——它向上承接 ch88 提出的"不同平滑肌表型所处的微环境差异"这一议题,把局部微环境中的氧化还原态作为塑造平滑肌表型与功能的关键变量;向下则很自然地导向随后讨论血管炎症、动脉粥样硬化和高血压等以氧化应激为共同通路的章节,以及 sGC 激动剂、PDE5 抑制剂等靶向 NO-cGMP 通路的治疗策略综述。Hill 把 ch91 安排在第四部分末段而非更前,意在让读者先在 ch88-90 中熟悉平滑肌的多样性,再在这一章看到一个"非平滑肌中心"但"决定平滑肌命运"的氧化应激视角。