第 86 章：平滑肌中的钙稳态与钙信号（Calcium Homeostasis and Signaling in Smooth Muscle）

引言（Introduction）

细胞内钙离子（Ca²⁺）是一种通用的第二信使，调控着大量细胞功能，包括收缩、代谢、兴奋性、分泌、转录、免疫应答、受精与发育等过程。Ca²⁺信号传导的最终核心是对胞内 Ca²⁺浓度 [Ca²⁺]i 的控制——既包括局部控制，也包括全局控制——它不仅取决于 Ca²⁺的流入和从细胞内钙库的释放，还取决于 Ca²⁺的清除机制。Ca²⁺信号传导具有复杂的时空模式，正是这种复杂性赋予了同一信使分子多种功能的多样性。平滑肌（SMC）在整个身体中并非一种均一的组织，其类型与功能不仅因器官不同而异，还因所在位置不同而变化。平滑肌可以是肌源性的（myogenic，Ca²⁺瞬变由动作电位或慢去极化波控制），也可以是神经源性的（neurogenic，Ca²⁺信号主要由神经活动控制）。每一种 SMC 类型都有其独特的 Ca²⁺信号系统，以适应其特定功能。除收缩外，平滑肌中已识别出其他与 Ca²⁺信号相关的功能，很可能还有更多功能有待发现。在平滑肌中，胞质溶胶 Ca²⁺的进入受两条途径调节：一是质膜（PM）上的 Ca²⁺内流，二是细胞内钙库（主要是肌浆网 SR）Ca²⁺的释放。控制 Ca²⁺内流的 PM 通道群体包括电压门控、受体门控和钙库操纵性通道；参与细胞内钙动员的两类 Ca²⁺释放通道是兰诺定受体（RyR）和 1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）。主要的胞质 Ca²⁺清除系统有肌浆网/内质网 Ca²⁺ ATP 酶（SERCA）、由 Na⁺/K⁺ ATP 酶（NKA）供能的 Na⁺/Ca²⁺交换体（NCX）以及质膜 Ca²⁺ ATP 酶（PMCA），线粒体亦可能参与其中并起协同作用。过去 15 年间，借助 Ca²⁺敏感性荧光指示剂与共聚焦显微镜等新型 Ca²⁺成像技术，结合电生理方法和生化与分子生物学新方法，平滑肌 Ca²⁺信号研究取得了显著进展，已揭示出从 Ca²⁺火花（sparks）、Ca²⁺膨泡（puffs）等基本事件到细胞内和细胞间 Ca²⁺波与振荡的高度复杂的空间时间信号谱。这种复杂的 Ca²⁺信号传导源自位于质膜、肌浆网和线粒体上的离子转运和泵蛋白之间的相互作用。本章旨在综述平滑肌细胞中已识别的 Ca²⁺进入与清除机制，并将其与 Ca²⁺信号传导的分级层次联系起来。在这些研究中，新型 Ca²⁺成像技术（特别是共聚焦显微镜）的发展发挥了核心作用，使研究者能够观察从单个通道簇释放的 Ca²⁺火花等局部事件到跨细胞传播的 Ca²⁺波等全局事件的空间时间演化。结合电生理技术（电压钳、膜片钳）和生化与分子生物学新方法（包括选择性抑制剂、基因敲除和转基因小鼠模型），研究人员现在能够将特定的 Ca²⁺信号特征与特定的分子实体联系起来，并以严格的因果方式测试它们的功能作用。本章的结构遵循"来源-清除"的二分法，但在适当的地方会指出同一分子实体在两个过程中的双重作用。

电压门控 Ca²⁺通道（Voltage Operated Ca²⁺ Channels）

如引言所述，平滑肌中胞质 Ca²⁺的进入由两类机制协同控制：第一类是通过质膜上各类通道（包括电压门控、受体门控和钙库操纵性通道）的 Ca²⁺内流，第二类是从细胞内钙库（主要是肌浆网 SR）Ca²⁺的释放。电压门控通道响应膜去极化而开放，受体门控通道由激动剂与膜受体的结合直接开放，钙库操纵性通道在 SR Ca²⁺含量下降时被激活。三类通道在不同类型平滑肌中的相对贡献因组织类型、刺激性质和细胞状态而异。除此之外，钠钙交换体（NCX）在反向模式下（即 Na⁺外流、Ca²⁺内流）也可以作为 Ca²⁺进入的辅助途径。Ca²⁺从 SR 释放则由两类受体通道介导：兰诺定受体（RyR）介导 Ca²⁺火花和 Ca²⁺诱导的 Ca²⁺释放（CICR），1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）介导由 G 蛋白偶联受体激活磷脂酶 C 后产生的 IP3 信号所触发的 Ca²⁺释放。这两类受体在 SR 膜上可以共存于同一钙库，也可以位于不同钙库；其相对密度和空间分布是不同类型平滑肌 Ca²⁺信号特征差异的核心决定因素。以下各小节将分别详细讨论这些来源途径。

跨 SMC 膜的电位在所有相位性（phasic）及部分张力性（tonic）平滑肌收缩的控制中起关键作用——通过其去极化和随后经电压门控 Ca²⁺通道的 Ca²⁺内流。电压门控 Ca²⁺通道是一类随膜电位降低（即膜去极化）而开放的离子通道群体，负责动作电位（AP）上升支的形成。在电兴奋性平滑肌细胞中，Ca²⁺的进入主要通过长时程（L 型）高电压激活 Ca²⁺通道，该通道具有大电导（8–25 pS），并对二氢吡啶（DHP）类衍生物敏感——既可为拮抗剂（如硝苯地平）所阻断，又可为激动剂（BayK-8644）所激活，故称为 DHP 敏感性 Ca²⁺通道。这类通道存在于所有类型的平滑肌细胞中，但其表达水平及对 Ca²⁺信号的贡献因组织和刺激而异。在某些类型的平滑肌中还检测到低电压激活瞬时型（T 型）电压门控 Ca²⁺通道，但其功能角色尚不明确。动作电位介导的 Ca²⁺瞬变源自经 DHP 敏感性通道的直接 Ca²⁺内流，在由尖峰状 AP 控制的平滑肌（如子宫、膀胱、胃肠道、门静脉）中表现为 Ca²⁺尖峰（图 86.1e）；在输尿管平滑肌中，Ca²⁺瞬变呈现由平台型 AP 控制的平台相（图 86.1c）。SMC 作为三维电合胞体相互连接，不仅具有机械互通，也具有电互通功能，因此电生理现象须结合组织结构和细胞关系来解释。所有平滑肌中都存在集体行为，但其空间传播程度各异。相邻细胞内部之间的低阻通路允许电流的电紧张扩散，乃至更广泛地传播 AP。共聚焦成像显示，在输尿管中 AP 介导的 Ca²⁺尖峰主要沿轴向传播（图 86.1a、b），而在膀胱、胃肠道和子宫等其他类型平滑肌中则沿轴向且在较小程度上沿横向传播（图 86.1d）。仅当所有肌束被募集并参与力生成时才能产生最大力。平滑肌细胞之间的功能性连接由间隙连接组成，控制平滑肌细胞之间的电偶联。在小阻力动脉和微动脉等张力性非发放型平滑肌中，平滑肌可被多种直接刺激物部分去极化，这些刺激物打开 DHP 敏感性 Ca²⁺通道，激活小而持续的 Ca²⁺内流，从而引发张力性收缩。在这些类型的平滑肌中，再生型 AP 的产生受到对 TEA 敏感的一族 K⁺通道快速激活的阻碍。DHP 敏感性 Ca²⁺通道能够在中等去极化（−40、−20 mV）下开放，并产生所谓的"窗口电流"，其导致胞内 Ca²⁺的稳定增加，与张力性收缩的发展相关。与全或无再生型 AP 引发的 Ca²⁺尖峰（其产生具有特征性恒定振幅的 Ca²⁺尖峰）不同，"窗口"Ca²⁺电流可根据去极化水平分级变化。图 86.1 中的代表性记录展示了大鼠输尿管（一种具有平台型 AP 的相位性平滑肌）和大鼠子宫（具有尖峰状 AP 的妊娠期平滑肌）中 Ca²⁺波与机械收缩的时间关系。在输尿管中，Ca²⁺瞬变呈现长平台相与持续的力发展相对应；在子宫中，Ca²⁺尖峰伴随单一或融合的相位性收缩。这些模式提示平滑肌的 AP 形态是 Ca²⁺瞬变波形的主要决定因素之一，进而决定收缩的时间特征。

与受体激活偶联的 Ca²⁺进入（Ca²⁺ Entry Coupled to Receptor Activation）

30 多年前人们就提出受体激活可经独立于膜去极化的机制导致 Ca²⁺进入平滑肌细胞，由此引入了受体门控 Ca²⁺通道（ROC）和药理-机械偶联（pharmaco-mechanical coupling）的概念。当时 ROC 代表除电压敏感性 Ca²⁺通道以外的任何质膜 Ca²⁺通透通道，它们因激动剂与受体的结合而开放。基于新的证据，激动剂可通过三种不同的方式激活电压非依赖性 Ca²⁺进入平滑肌细胞，对应于平滑肌中药理-机械偶联的不同方面。第一类 ROC 是经钙库操纵性通道（SOC）的电容性 Ca²⁺进入（CCE）（图 86.2）。Ca²⁺释放/Ca²⁺进入偶联的想法最初由 Casteels 和 Droogmans 在血管平滑肌中提出。按照这些作者的观点，血管平滑肌细胞中去甲肾上腺素敏感性 Ca²⁺库的重填是通过 Ca²⁺库与表面膜之间的偶联发生的，这种偶联允许 Ca²⁺离子快速向内进入细胞，且对电压门控 Ca²⁺通道阻断剂具有抗性。SOCs 定义为响应肌浆网内腔 [SR][Ca] 浓度下降而开放的质膜 Ca²⁺通道。启动 SOCs 开放的关键事件是 [SR][Ca] 下降，而非 ER 释放的 Ca²⁺。这一现象可用环匹阿尼酸（CPA）和毒胡萝卜素（thapsigargin）选择性抑制 SERCA 泵来实验性证明。这两种药物通过抑制 Ca²⁺的螯合而耗竭 SR Ca²⁺库，且不激活 G 蛋白，因此可用于将经 SOCs 的 Ca²⁺进入与其他受体门控通道区分开来。SR Ca²⁺-ATP 酶抑制剂激活的 Ca²⁺内流被认为是经 SOC 的 Ca²⁺进入的良好功能标记。大量研究表明 SERCA 泵抑制剂可在多种类型的平滑肌中增加 Ca²⁺内流，且这种内流对 L 型 Ca²⁺通道阻断剂具有抗性。规范瞬时受体电位家族（TRPC）的成员，特别是 TRPC1，参与血管平滑肌细胞的 SOCE。一些研究表明，平滑肌中 SOC 的基础通道具有非选择性。最近发现单跨膜蛋白 STIM1（基质相互作用分子 1）在 SOCs 激活中起关键作用，STIM1 是钙库中 Ca²⁺的感应器。另有研究提供令人信服的证据，表明 Orai1（希腊神话中"天堂之门的守护者"）是钙库操纵性 Ca²⁺释放激活通道的孔道亚基。由 STIM1-Orai 复合体整合 TRPC 蛋白被认为是一种控制平滑肌 SOC 激活的机制。

第二类 ROC 是非选择性阳离子通道（NSCC），它们由与受体蛋白的直接相互作用而开放。NSCC 对单价阳离子（如细胞外和细胞内的 Na⁺、K⁺）具有均等通透性；但这种电导是否是 Ca²⁺进入的重要直接来源仍存在争议。NSCC 电流在许多细胞中具有电压依赖性，反转电位接近 0 mV，证明了其非选择性。NSCC 激活的分子机制尚未完全明了。在回肠平滑肌中，NSCC 可被 ACh 与 M2 受体的结合所开放（通过 Gi/Go 工作），并由与磷脂酶 C（PLC）偶联、产生 IP3 的 M3 受体促进。平滑肌中非选择性阳离子电导的分子实体尚未被确定；然而 Inoue 及其同事表明，在 HEK293 细胞中表达 TRP6 蛋白产生的电流具有与血管平滑肌细胞中由肾上腺素能刺激激活的非选择性阳离子电流相似的生物物理和药理学特性。

第三种机制是通过独立于钙库的受体门控（ROC）通道激活 Ca²⁺进入（图 86.2）。这类 ROC 是一种非选择性阳离子通道，由 GPCR 的受体刺激通过第二信使如 IP3 或 DAG 的产生而开放。ROC 上的电流呈现非选择性阳离子电流的特性，并具有不同程度的 Ca²⁺选择性。TRPC 家族的多个成员被接受可形成 ROC 通道，包括 TRPC3、TRPC6 和 TRPC7。

与 SR Ca²⁺释放相关的 Ca²⁺信号（Ca²⁺ Signals Associated with the SR Ca²⁺ Release）

平滑肌细胞中来自 SR 的 Ca²⁺释放通过两类 Ca²⁺释放通道的激活而发生，这两类通道具有显著的同源性和总体结构，分别称为兰诺定受体（RyR）和 1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）。两类受体均存在三种亚型——RyR1、RyR2、RyR3 和 IP3R1、IP3R2、IP3R3。RyR1 亚型主要在骨骼肌表达，RyR2 在心肌表达，RyR3 似乎在包括平滑肌在内的许多细胞类型中表达。IP3R 在骨骼肌和心肌中表达较弱，但其基因产物已在许多可兴奋和非兴奋细胞中被识别。平滑肌细胞以不同比例表达多种 RyR 和 IP3R 亚型；它们可以共享同一钙库或位于不同钙库，具体取决于平滑肌的类型或物种。这些通道参与平滑肌细胞收缩、舒张、增殖和分化等多种功能的控制。它们的功能角色在很大程度上取决于分子身份、表达水平与比例、亚细胞分布，以及它们与其他细胞结构形成的功能单元的类型，这是一个目前正在调查的领域。当与较高浓度激动剂共同刺激时，传播性 Ca²⁺波可源自扩散引起的 Ca²⁺释放位点的空间募集，这一现象在大鼠输尿管的多细胞制备和小鼠结肠肌细胞中均有报道。在豚鼠回肠中，强毒蕈碱刺激可在富含 IP3R 的亚质膜 SR 元件中触发 IP3R 介导的 Ca²⁺释放，产生亚质膜 [Ca²⁺]i 上冲（SPCU）；该事件与动作电位密切相关，并依赖于经电压门控 Ca²⁺通道的 Ca²⁺进入。Ca²⁺释放通过 IP3R 可进一步募集相邻的 RyR（参见 IP3R-RyR 偶联机制），从而放大初始 Ca²⁺信号。这种跨通道偶联被认为是平滑肌中 Ca²⁺波传播的重要机制之一，RyR 与 IP3R 的相对密度差异直接决定了不同组织中 Ca²⁺反应对哪种受体家族更敏感。

Ca²⁺火花（Ca²⁺ Sparks）

由 RyR 通道簇激活介导的 Ca²⁺火花已在骨骼肌、心肌和平滑肌中被识别。在骨骼肌中，Ca²⁺火花由 L 型通道（Cav1.1）与 RyR1 通道簇的直接机械相互作用触发，从 SR 中释放 Ca²⁺。在心肌中，Ca²⁺火花由 AP 期间经 Cav1.2 通道进入的 Ca²⁺所产生，通过 Ca²⁺诱导 Ca²⁺释放（CICR）机制刺激 RyR2 通道开放。平滑肌的 Ca²⁺火花与心肌的不尽相同，尽管两者皆源自 RyR 通道簇的开放，并反映基本 Ca²⁺释放单元的激活。在心肌中，Ca²⁺火花在全细胞中被募集，产生 [Ca²⁺]i 的整体上升，放大来自 PM 的 Ca²⁺信号。在平滑肌中，Ca²⁺火花反复出现于肌细胞内仅少数几个邻近浅表 SR 的离散胞质微域，称为高频放电位点（FDS）（图 86.3a）。尽管 SR 是沿质膜内侧连续的网状结构，但在大多数平滑肌细胞中仅有 1–4 个 FDS。FDS 总是与 SR 的一个富含 RyR 的显著部分重合。FDS 相关的 SR 元素是浅表 SR 网络的一部分，位于核包膜 1–2 μm 范围内，而核包膜正是细胞去极化时首先释放 Ca²⁺的位置。然而，RyR 通道开放与 L 型 Ca²⁺通道门控之间并非总是紧密耦合，这促使 Kotlikoff 及其团队提出"loose coupling"（疏松偶联）的概念。在大多数平滑肌中，最有效的 Ca²⁺火花触发因素似乎是内腔 SR Ca²⁺（SR[Ca]），它经电压门控 Ca²⁺通道的 Ca²⁺内流而被载入。SR[Ca] 通过在腔体侧刺激 RyR 来调节 Ca²⁺释放；这种促进的机制仍知之甚少。在平滑肌细胞中，对 RyR 敏感的 Ca²⁺释放单元被精确地定位于与质膜离子通道通信的位置（图 86.2）。Nelson 及其同事最早提出有力证据，将 Ca²⁺火花和 STOC（自发瞬时外向电流）联系起来，作为确定肌源性张力程度的负反馈机制。Walsh 及其同事在其精细的工作中直接证明了内腔 Ca²⁺水平与 Ca²⁺火花及 STOC 频率之间的陡峭关系。有人提出 SR[Ca] 提供了一种机制，使激动剂能够调控 Ca²⁺火花与 STOC，从而控制平滑肌的兴奋性。通过使细胞膜超极化，Ca²⁺火花/STOC 偶联机制可舒张或对抗动脉收缩、控制输尿管的兴奋性和相对不应期，并直接影响多种相位性平滑肌动作电位的持续时间。Ca²⁺火花似乎还参与肠及其他平滑肌的重要起搏电位。它们也通过其他平滑肌（如肺血管肌细胞）中的 ClCa 通道发挥去极化影响。这种 Ca²⁺火花—BK 通道—超极化负反馈通路是平滑肌区别于骨骼肌和心肌的一个独特调控机制，对肌源性张力的精确控制至关重要；它解释了为什么在某些张力性血管平滑肌中，尽管 L 型 Ca²⁺通道持续活跃，张力却能保持稳定。

Ca²⁺膨泡（Ca²⁺ Puffs）

Ca²⁺膨泡一词是指 IP3R 自发开放或对低浓度激动剂响应时发生的局部小幅度 [Ca²⁺ 升高。通过 IP3R 通道开放介导的 Ca²⁺事件的多态性——从单个 Ca²⁺膨泡到传播再生性 Ca²⁺波——已在多种非兴奋性细胞中得到很好的表征和描述。数字 Ca²⁺成像技术已揭示，在大多数平滑肌类型中，对 IP3 或产 IP3 激动剂的胞内 Ca²⁺信号常常呈现为传播性 Ca²⁺波或 Ca²⁺振荡（图 86.3）。在非兴奋性细胞中，IP3 引起的 [Ca²⁺i 升高呈现为局部瞬时 Ca²⁺升高。迄今为止，Ca²⁺膨泡仅在两种平滑肌中被检测到：一种是大鼠输尿管（其中激动剂诱导的 Ca²⁺释放在调节收缩中起主导作用），另一种是小鼠结肠肌细胞。与 Ca²⁺火花不同，Ca²⁺膨泡在幅度、时程和空间扩散上表现出很大的可变性，提示输尿管肌细胞中 IP3R 门控通道存在于含有可变数量通道的簇内，且这些簇内可变数量的通道可被募集。大鼠输尿管肌细胞中的 Ca²⁺膨泡可被细胞内应用肝素或抗 IP3R 抗体选择性阻断，但对兰诺定或抗兰诺定受体抗体不敏感。当受到更高浓度激动剂刺激时，传播性、对兰诺定不敏感的 Ca²⁺波似乎源自扩散引起的 Ca²⁺释放位点的空间募集。这与多细胞制备中的数据一致，其中报道了兰诺定不敏感的激动剂诱导 Ca²⁺释放。在小鼠结肠肌细胞中，自发或 P2Y 受体刺激期间出现了对兰诺定不敏感、被 xestospongin 和 U-73122（PLC 抑制剂）抑制的局部 Ca²⁺瞬变和膨泡。膨泡与 BK 通道和小电导 Ca²⁺激活 K 通道（SK）的激活偶联。因此，由 G 蛋白介导的 PLC 激活引起的 Ca²⁺释放可通过靶向 SK 通道的 Ca²⁺膨泡与抑制反应相联系——这与通常发现 IP3 依赖性机制被平滑肌兴奋性激动剂利用形成鲜明对比。强毒蕈碱刺激可在豚鼠回肠中触发由亚质膜 SR 元件中 IP3R 介导的 Ca²⁺释放产生的亚质膜（sub-PM）[Ca²⁺]i 上冲（SPCU），其中亚质膜 SR 元件富含 IP3R。这些事件与动作电位密切相关，并强烈依赖于经电压门控 Ca²⁺通道的 Ca²⁺进入，表明在这种类型的平滑肌中兴奋-收缩偶联涉及由电压门控 Ca²⁺进入促进的初始局部 IP3R 介导的 Ca²⁺释放。Ca²⁺膨泡的概念与 Ca²⁺火花形成对比：后者是 RyR 介导的、空间局限且时间短促的事件，其主要功能是激活邻近 BK 通道以提供超极化负反馈；而前者是 IP3R 介导的、空间可变性更大、招募机制依赖 IP3 浓度的局域事件，其下游既可激活 SK 通道产生抑制（结肠肌细胞中），也可与电压门控 Ca²⁺进入协同触发动作电位相关 Ca²⁺释放（豚鼠回肠中）。这种双功能性表明 IP3R-Ca²⁺膨泡通路在不同平滑肌中具有功能多样性，其下游后果取决于亚细胞 IP3R 的分布和局部信号环境。

Ca²⁺波与振荡（Ca²⁺ Waves and Oscillations）

加载 Ca²⁺敏感染料的完整血管的数字 Ca²⁺成像显示，在许多血管中，激动剂诱导的收缩由单个平滑肌细胞中的异步波状 Ca²⁺振荡维持（图 86.3）。Ca²⁺振荡表现为沿 SMC 长轴传播的复发性胞内 Ca²⁺波（图 86.3），可由激动剂、咖啡因或胞质或内腔 Ca²⁺水平升高引发。钙波在平滑肌细胞中据信沿 SR 传播。一般认为，这些波主要由再生性 Ca²⁺释放（即钙诱导钙释放 CICR）机制传播。在 CICR 机制中，快速 Ca²⁺波通过反应-扩散循环传播，其中 Ca²⁺离子沿 ER 外部扩散，并诱导储存在 SR/ER 中的更多 Ca²⁺的释放。波由 SR 上的 IP3R 在产 IP3 激动剂作用下引发，并通过从一个释放位点或簇的顺序 Ca²⁺释放以近乎恒定的振幅推进（图 86.3）。每个波包括上升相和下降相。上升相由源自 IP3R 释放的"引发"成分组成，随后为"放大"成分，在此期间这种释放反馈过程将引发（局部）反应放大为波的上升相。对 Ca²⁺波传播的考察表明，决定域间传播的关键因素是 IP3R 和/或 RyR 对 Ca²⁺敏感性的时间依赖性变化，这可以产生释放位点之间的"loose coupling"，并由"fire-diffuse-fire"模型描述。Ca²⁺波的再生性质取决于 [Ca²⁺]i 对 IP3R 的正反馈和 Ca²⁺敏感性 RyR 的募集。平滑肌中 RyR 激活的另一种机制是激动剂刺激的环 ADP 核糖（cADPR）的增加。cADPR 由作为细胞表面受体（CD38）的 ADP-核糖基环化酶从 NAD 生成，被认为通过 FK506 结合蛋白 12.6（FKBP12.6）促进 RyR 的激活。Ca²⁺释放的 cADPR/CD38 通路被认为由 GPCR 募集，但其细节基本未知。IP3R 和 RyR 的相对参与程度在不同类型的平滑肌之间有所不同。在 IP3R 密度高于 RyR 的平滑肌（如大鼠输尿管或结肠平滑肌）中，神经递质的 Ca²⁺反应将主要仅依赖于 IP3R 的激活。在 RyR 密度高于 IP3R 的平滑肌（如大鼠尾动脉和大鼠门静脉）中，神经递质诱导的 Ca²⁺波和振荡依赖于 IP3R 和 RyR 两者的激活。然而，需要比较功能性实验与 IP3R 和 RyR 通道表达和分布相关联，以将这一结论扩展到所有类型的平滑肌。对释放的延迟负反馈对振荡行为至关重要，可由 IP3R1 型同种型被高细胞质和/或低内腔 [Ca²⁺] 抑制、IP3R 的时间依赖性失活或 SR Ca²⁺摄取经 SERCA 的激活来解释。波振荡倾向于源自细胞内同一区域的观察可由 SR Ca²⁺释放通道和/或 SERCA 泵单元的局部更高密度来解释。产生 Ca²⁺火花的 FDS 可在某些类型的平滑肌类型中作为起始位点。Ca²⁺振荡的频率取决于所用激动剂的类型和浓度；浓度越高，振荡频率越高。在由单层平滑肌细胞组成的毛细血管前微动脉中，低浓度激动剂诱导低频异步 Ca²⁺振荡。低频 Ca²⁺振荡产生由单细胞控制的节律性相位收缩——局部血管运动。激动剂浓度的增加导致振荡细胞数量和 Ca²⁺振荡频率的增加，从而导致个体相位收缩的叠加，产生动态非传播性血管收缩。在毛细血管前微动脉中，血管运动有助于血液灌注，而血管收缩可减少或完全阻断局部血流，起到局部毛细血管前"括约肌"的作用。在大血管中，收缩力将取决于振荡细胞的数量和 Ca²⁺振荡的频率。此外，Ca²⁺波还通过激活 ClCa 通道在相位性平滑肌中发挥去极化影响，从而在细胞群中同步但间歇性地激活 DHP 敏感性 L 型 Ca²⁺通道，随后产生同步的 Ca²⁺振荡，构成区域性血管运动。由于部分释放的 Ca²⁺可被挤出到细胞外空间，Ca²⁺波的复发将依赖于 SR 通过 Ca²⁺内流的重新装载。这可通过几种机制发生：钙库操纵性非选择性阳离子通道、L 型电压门控 Ca²⁺通道和 NCX 的反向模式。需要更多研究来识别这些或其他机制对 SR 补充的相对贡献。RyR 和 IP3R 对胞内 [Ca²⁺]i 动员的相对贡献以及这些受体在局部 Ca²⁺释放事件（火花或膨泡）、传播性 Ca²⁺波或 [Ca²⁺]i 振荡发生中的作用因 SMC 类型而异，且通常取决于 SMC 刺激的强度和机制。

肌浆网（SR）与肌（内质）质网 Ca²⁺ ATP 酶（Sarcoplasmic Reticulum (SR) and Sarco(endo)plasmic Reticulum Ca²⁺ ATPase (SERCA)）

分别讨论 Ca²⁺来源和 Ca²⁺清除多少带有人为性，因为任一系统都可能扮演双重角色；例如 Na⁺/Ca²⁺交换体。分开讨论的优势在于从不同视角观察每个系统。尽管通过通道的离子通量比离子泵清除的通量大几个数量级，但 Ca²⁺瞬变的时程若无 Ca²⁺清除通路的抑制可能被严重低估。离子通过通道的速度可能主导初始 Ca²⁺瞬变，但稳态下 Ca²⁺清除机制发挥作用，它们是决定稳态 [Ca²⁺]i 的主要因素。基础条件下估计为每分钟 16 μmol/L 的 Ca²⁺内流比静息 [Ca²⁺]i 大两个数量级以上。因此，胞质溶胶中 Ca²⁺的清除对维持静息基线至关重要。主要的 Ca²⁺清除系统有肌浆网（内质网）Ca²⁺ ATP 酶（SERCA）、由 Na⁺/K⁺ ATP 酶（NKA）供能的 Na⁺/Ca²⁺交换体（NCX）和质膜 Ca²⁺ ATP 酶（PMCA）。NCX 通常被认为是高容量、周转迅速但对 Ca²⁺亲和力低（Kd ≈ 1 μM）的交换体。SERCA 和 PMCA 对 Ca²⁺ 的亲和力较高（Kd ≈ 0.1–0.3 μM），但周转率低于 NCX。对于平滑肌而言，每种对 Ca²⁺清除组分的相对贡献取决于条件和平滑肌类型。估计通常依赖于抑制剂，且常从清除速率线性外推，因此必须谨慎看待。这些数据还存在组织、制备和物种差异。在小鼠膀胱中，NCX 占 Ca²⁺清除的约 60%，PMCA 和 SERCA 各贡献约 20–30%。在子宫平滑肌中，35% 可归因于 NCX，其余归因于 PMCA。在从小鼠主动脉分离的细胞中，在 SERCA 被环匹阿尼酸抑制后，NCX 占 Ca²⁺挤出的 90%。在某些条件下，线粒体 Ca²⁺摄取也可能是一个因素，但其表观亲和力被认为相对较低（约 10–20 μM）。人们假设 [Ca²⁺i 相对较高的微域可以规避这种相对较低的亲和力。然而最近的证据表明线粒体可能在 Ca²⁺清除中发挥某种缓冲和/或调节作用（详见下文）。这些 Ca²⁺清除系统的分布、定位和相互作用是平滑肌 Ca²⁺处理方面的近期研究焦点；特别是 caveolae 及其相应的亚质膜区室的作用。Caveolae 代表一种部分与一般细胞外环境隔离的 Ca²⁺池。这些囊泡膜结构被认为是可被 SR 重复利用的 Ca²⁺ 来源。在平滑肌中已牢固确立了对该区室的定位，PMCA 和 NCX 与 caveolae 的共定位提示 Ca²⁺挤出和调节在该亚质膜区室中的作用（图 86.1）。目前尚无直接证据证明它们在平滑肌 caveolae 中的共定位。然而，平滑肌中 NCX 与 NKA α2 亚型的共定位（图 86.1）提示其可能存在。除此之外，最近的证据表明 Ca²⁺清除的主要参与者也可能作为单元受到遗传调控。综合上述定量贡献估计（膀胱 60/20/20、子宫 35/65/0、主动脉 90/10/0），可看到平滑肌中 NCX/SERCA/PMCA 三系统的相对贡献具有强烈的组织依赖性，这种差异很可能反映了不同平滑肌的生理功能需求：膀胱需要快速 Ca²⁺循环以支持频繁排空，NCX 的高容量、低亲和力特征适合这种快速清除；子宫在妊娠期需要维持低频振荡性收缩，PMCA 的高亲和力适合维持低水平静息 [Ca²⁺]i；主动脉作为大血管则需要 NCX 占主导以处理大幅度的 Ca²⁺ 瞬变。

在血管平滑肌细胞中，肌浆网 Ca²⁺库对收缩调控以及其他细胞功能（如通过 IP3 受体（IP3R）和兰诺定受体（RyR）的 Ca²⁺释放以及通过 Ca²⁺摄取的 [Ca²⁺]i 进一步调控）的基因调控具有显著贡献。SR 估计占平滑肌体积的 5–7%，有证据支持 SR 是一个单一内腔连续的实体，同时包含 IP3R 和 RyR，其中 Ca²⁺可被每个受体自由获取。SERCA 和 SR 的一个更引人注目的方面是它们被报道在空间上定位，并直接或间接地与 PMCA、NKA-NCX 和线粒体以及质膜和细胞核相互作用。这提示 SERCA 和 SR 在 Ca²⁺稳态中起核心作用。SERCA Ca²⁺泵是约 110 kDa 的跨膜蛋白，属于高度保守的离子转运 ATP 酶 P 型超家族中的一员，由三个同源基因 SERCA1–3 编码。SERCA2b，作为两种选择性剪接转录物之一，是大多数平滑肌组织的主要 SR Ca²⁺泵。SERCA 在调节平滑肌 [Ca²⁺]i 和收缩力中的功能角色——主要基于抑制剂 thapsigargin 和环匹阿尼酸的使用——早已确立。在一个 SERCA2 基因靶向小鼠中——其中 SERCA2a 和 SERCA2b 两个等位基因均被删除——SERCA2a 蛋白水平和 SR Ca²⁺摄取的最大速度均下降了 35%。令人略感意外的是，在 SERCA2 蛋白水平降低 30–40% 后，无论是主动脉还是门静脉都未显示出改变的机械特性，这提示 SERCA2 在血管平滑肌中具有较大的功能储备。SERCA 在血管 [Ca²⁺]i 调节中作用更清晰的图景来自于对一个相关的 52 个氨基酸蛋白 phospholamban（PLN）的研究，该蛋白作为 SR Ca²⁺泵活性的抑制剂。在其非磷酸化形式中，PLN 单体抑制 SERCA，而 PLN-Ser16 经 PKA 或 PLN-Thr17 经 CaMKII 的磷酸化通过增加泵对 Ca²⁺的表观亲和力而缓解这种抑制。PLN 以单体形式（作为 SERCA 的强抑制剂）和低抑制性五聚体形式存在于 SR 膜中。PLN 单体的磷酸化降低了其胞质结构域的净电荷，这有利于自缔合为低抑制性五聚体结构。这种 SERCA:PLN 比例的调节是心肌和平滑肌组织收缩力的重要决定因素。PLN 存在于平滑肌中，但其表达量以物种和组织特异性的方式变化。cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶均可磷酸化 phospholamban，导致平滑肌内质网 Ca²⁺积累增加。与已综述的其他蛋白不同，PLN 是单拷贝基因，没有已知亚型，这促进了基因靶向小鼠的开发。PLN 缺失小鼠主动脉对 KCl 或 PE 刺激的浓度-力反应敏感性低于野生型组织。用环匹阿尼酸（CPA）抑制 SR Ca²⁺泵消除了这些差异，确定 SR 是这种右移的来源。PLN-KO 主动脉中 PE 诱导收缩的快速相上升速度是野生型的两倍，这与 SERCA 的去抑制和伴随的 SR Ca²⁺负荷增加一致。涉及血管调节的另一个关注点是，PLN-KO 小鼠主动脉对 ACh 或毛喉素（forskolin）激活 PKA 的内皮依赖性舒张被减弱。在膀胱中的研究扩展了收缩力研究，表明 [Ca²⁺]i 反应与力反应平行。CCh 刺激 PLN 缺陷膀胱显示出 [Ca²⁺]i 和力的最大增加显著减弱，与野生型对照相比。PLN-KO 膀胱的 CCh 诱导收缩的 EC50 值也相对于野生型膀胱升高。如 PLN 缺陷主动脉研究中所观察到的，CPA 对 SERCA 的功能抑制消除了这些差异，再次将观察到的效应定位于 SR。使用在平滑肌特异性 SMP8 α-肌动蛋白启动子驱动下携带 PLN cDNA 转基因的 PLN-SMOE 小鼠进行功能获得实验表明，效应是 PLN 特异性的，而非仅 SR 的效应。PLN-SMOE 膀胱中 CCh 的胞内 Ca²⁺和力关系显著向左移动，与 PLN-KO 膀胱观察到的情况相反。CPA 对 PLN-SMOE 组织几乎没有影响，提示 PLN-SMOE 膀胱中的 SERCA 和 SR Ca²⁺摄取已受到实质性抑制。在相位性平滑肌中，快速的收缩/舒张循环需要更快的胞内 Ca²⁺循环速率。PLN 可能在该组织收缩力中发挥关键作用，并在门静脉和 PLB-KO 小鼠胃窦中观察到这一点。与这种增加的张力性收缩活性相关联的是更快的收缩和衰减动力学。关于 PLN 和 SERCA 在血管平滑肌收缩力中的作用，已提出两个主要假说。正如 Ca²⁺火花一节所讨论的，一个依赖于 Ca²⁺激活钾（KCa）通道的激活，另一个依赖于胞质 Ca²⁺向 SR 的隔离速率增加。Nelson 及其同事支持平滑肌中 Ca²⁺火花驱动的收缩力下降机制。Ca²⁺火花是亚质膜小区中 Ca²⁺浓度的瞬时升高，由少量兰诺定受体的激活引发。在平滑肌中，Ca²⁺"火花"被认为通过激活质膜中的大电导 KCa（BK）通道而导致舒张增强。伴随的超极化关闭电压依赖性 Ca²⁺通道，导致 [Ca²⁺]i 降低和舒张。PLN 缺陷平滑肌中收缩力改变的第二个理论基于胞质 Ca²⁺向 SR 的隔离速率增加。PLN-KO 小鼠的研究提示胞质 Ca²⁺向 SR 的隔离速率增加具有直接作用。这种 Ca²⁺从胞质中的增强清除将有效降低 [Ca²⁺]i，进而导致较低程度的收缩和 SR 的较大 Ca²⁺负荷。这一作用得到几项独立研究数据的支持。一个引人注目的论点来自 Paul 及其同事的研究——力的抑制也在 KCl 去极化时观察到。在这些条件下，预期 Ca²⁺火花不会发挥这种作用。看似合理的反对意见是 SR 对 Ca²⁺的摄取可能饱和，且收缩延长时失去抑制作用。然而，有证据表明 SR 可经由分隔的 NCX 和 NKA 进行矢量卸载，正如 van Breemen 及其同事最初提出的那样。最终，PLN 的调节作用可能既通过增强 SR Ca²⁺螯合的间接角色，又通过胞质 Ca²⁺清除增加的 [Ca²⁺]i 降低中的直接角色而存在。SERCA 据报道通过 cGMP 和 cGMP 非依赖性途径参与 NO 介导的舒张。NO 据报道可直接激活 SERCA 并重新装载 Ca²⁺库，从而使钙库操纵性 Ca²⁺通道失活，降低胞内钙并舒张动脉。这种机制主要为 cGMP 非依赖性，并在血管疾病中受损；然而在 PLN 基因敲除小鼠中，主动脉的 cGMP 舒张不受影响。SERCA 在 Ca²⁺稳态中的另一个方面是越来越多的文献表明 SERCA 氧化还原调节的潜在重要性。最后，PLN 与 SERCA 的相互作用及其通过辅助蛋白 HAX-1、Hsp20、junctin 和 HRC 的调节，最近阐明了心肌中 SERCA 调节的其他潜在位点，并无疑将在不久的将来被推广到血管平滑肌。

质膜 Ca²⁺ ATP 酶（Plasma Membrane Ca²⁺ ATPase）

PMCA，一种钙调蛋白依赖性钙 ATP 酶，是一种普遍存在的转运蛋白，可将 Ca²⁺挤出穿过质膜。它还被报道为反向转运一个质子，这反过来可能影响其活性。已经确立了四种 PMCA 同种型，并因选择性剪接而产生进一步的变异性。PMCA1 和 PMCA4 是目前在平滑肌中报道的唯一同种型。缺乏特异性抑制剂限制了 PMCA 生理意义的研究，我们的大部分知识来自于对基因改造小鼠的研究。然而，最近合成的 PMCA 肽抑制剂已有报道。PMCA 可以是血管、膀胱和子宫平滑肌中收缩力的主要调节者。Neyses 及其同事使用过表达人 PMCA4b（hPMCA4b）靶向血管平滑肌的转基因小鼠表明，PMCA4b 通过抑制 caveolar 区室中的一氧化氮合酶 I（神经元（n）NOS）调节血管张力。他们报告了血压升高以及对 KCl 的最大收缩增加（在内皮剥离的主动脉环中），以及转基因小鼠对苯肾上腺素和前列腺素 F2α 的敏感性增强，与对照相比。PMCA4 和 nNOS 据报道可共免疫沉淀，提示 PMCA4 通过降低局部 [Ca²⁺] 来调节血管张力，从而抑制 nNOS。利用 Pmca1⁻/⁻、Pmca4⁻/⁻ 和 Pmca1⁻/⁻ × Pmca4⁻/⁻ 小鼠，Paul 及其同事观察到对 KCl 力发展半衰期的显著延长，提示 Pmca4 等位基因的消融可能限制去极化诱导的 Ca²⁺内流，因为在 Pmca1⁻/⁻ 小鼠中总 PMCA 未受影响。提出通过 PMCA 基因消融的平滑肌中近膜 [Ca²⁺] 升高的 NCX 介导的 Ca²⁺挤出激活。关于 PMCA1 和 PMCA4 在膀胱平滑肌中的同种型特异性作用已有报道。Pmca1⁻/⁻ 膀胱对 KCl 和卡巴胆碱（CCh）刺激显示出比野生型（WT）对照更高的 [Ca²⁺]i 和力反应（图 86.2）。相比之下，与野生型对照相比，Pmca4⁻/⁻ 膀胱对 CCh 的反应被显著抑制（图 86.2），但对 KCl 的峰值张力和 [Ca²⁺]i 未受影响。这些数据加上 Pmca1⁻/⁻ 基因型胚胎致死的发现支持 PMCA1 的管家作用，而受体信号调节似乎是 PMCA4 的功能。Pmca4⁻/⁻ 膀胱中 CCh 反应被抑制的潜在机制包括 SR 相关亚质膜空间中的高 [Ca²⁺]，导致 SR 超负荷，抑制钙库操纵性 Ca²⁺进入和/或通过 PMCA4 相关亚细胞区室 [Ca²⁺] 增加激活 Ca²⁺激活的 K⁺通道。同种型特异性功能分化的核心证据可总结为：PMCA1 是普遍表达的"管家"亚型（其基因敲除导致胚胎致死），而 PMCA4 在平滑肌中的功能是通过调节 caveolar 微域中局部 Ca²⁺ 来调控信号网络（nNOS 抑制和受体信号转导），而非主要负责稳态 Ca²⁺挤出。这一区分对理解 PMCA 在病理状态下的功能具有重要意义——例如，PMCA4 缺失或功能障碍可能导致 nNOS 过度激活和血管张力异常，这为高血压和血管疾病的机制研究提供了新方向。

由 NKA 驱动的 Na⁺/Ca²⁺交换体介导的 Ca²⁺清除（Ca²⁺ Clearance via Na⁺/Ca²⁺ Exchanger Driven by NKA）

利用由 Na⁺/K⁺ ATP 酶供能的 Na⁺梯度的 Na⁺/Ca²⁺交换体可以是一个有效的 Ca²⁺清除系统。哺乳动物 NCX 家族至少由三种同种型 NCX1–3 组成，每种又产生各种剪接变体。NCX 在质膜上交换一个 Ca²⁺离子换 2–3 个 Na⁺离子，因此可以是电生的，并受膜电位以及 Na⁺和 Ca²⁺跨膜梯度的调节。由于它是双向的，Na⁺/K⁺ ATP 酶的抑制可导致 NCX 的反向，增加 [Ca²⁺]i 和收缩力；一种被假设为盐敏感性高血压基础的机制。Na⁺/K⁺ ATP 酶是典型的 P 型 ATP 酶，于 1957 年由 Skou 发现。NKA 每水解一个 ATP 将三个 Na⁺离子运输出细胞、两个 K⁺离子运输入细胞。因此它奠定了膜电位以及 Na⁺和 K⁺梯度的形成。它通常被描述为 αβ 二聚体，目前已知有四种 α 亚型和三种 β 亚型。β 亚基似乎参与 ATP 酶定位到质膜和酶的成熟。较新的证据表明与另一种通常被视为 γ 亚基的蛋白质的关联，该蛋白是称为 FXYD 蛋白的更大类别蛋白的成员，因有七种此类蛋白而增加了额外的多样性。Na⁺/K⁺ ATP 酶是否总是与 FXYD 蛋白家族的某一成员相关尚未知。催化 α 亚基有四种已知同种型，但只有 α1 和 α2 亚基与成年小鼠主动脉平滑肌相关。α1 同种型对 Na⁺的亲和力（KNa ≈ 12 mM）高于 α2（KNa ≈ 22 mM）。α2 同种型对抑制剂乌本苷的亲和力（IC50 = 58 nM）远高于 α1 亚基（IC50 = 48 μM），这是啮齿类动物特有的，是有用的实验工具。在大多数其他哺乳动物（包括人类）中，α 同种型对乌本苷的敏感性具有相似的幅度。NKA 同种型研究的最新重点是它们的定位以及与其他 Ca²⁺清除蛋白的共定位。NCX、NKA 和 SR 在平滑肌中的共定位早已确立。在培养的血管平滑肌和星形胶质细胞中，α1 同种型均匀分布在质膜上；α2 同种型呈现点状分布。Blaustein 及其同事报告 NKA α2（或 α3）同种型定位于包含 NCX 和 SR 的相同微域中（图 86.1），并提出 α2 同种型通过 NCX 调节微域中的 [Ca²⁺]，通过与 SERCA 的通信调节 SR Ca²⁺负荷和收缩力的模型。尽管 NCX 对 Ca²⁺的亲和力较低，但 NCX 与 SR Ca²⁺储存位点的紧密结构偶联（其中局部 [Ca²⁺]i 可显著高于细胞整体平均值）提示 Na/Ca 交换体活性可能在填充 Ca²⁺储存中具有重要作用。鉴于 α1 同种型的广泛分布，它被认为履行"管家"功能。基因靶向和转基因模型进一步推进了我们对 NCX 和 NKA 酶功能的理解。在平滑肌中，NCX 在 Ca²⁺稳态中的作用在不同平滑肌类型和组织间显示出相当大的差异，在许多情况下仍有争议。其在平滑肌中的作用要么是间接推断，要么在很大程度上被忽略——通常是在复杂的多细胞制备上进行的间接研究。尽管多细胞制备带来了困难，在完整的钠负载豚鼠输尿管中，有 NCX 以反向模式运作的证据。Aaronson 和 Benham 使用电压钳条件下从豚鼠输尿管分离的单细胞证实了这些观察，并获得了 NCX 以反向模式运作、提升 [Ca²⁺]i 但对 [Ca²⁺]i 清除影响不大的证据。在从豚鼠膀胱分离的细胞中，Ganitkevich 和 Isenberg 表明 NCX 在调节 [Ca²⁺]i 中作用不大。同样，在电压钳下的豚鼠结肠肌细胞中，NCX 似乎不调节整体平均 [Ca²⁺]i；然而在从 Bufo marinus 分离的单细胞中，有 NCX 可在正向模式下运作的证据；即 Na⁺入细胞，Ca²⁺出细胞。另一方面，NCX 在血管平滑肌中可起主要作用，占小鼠主动脉细胞中 Ca²⁺清除的 90%。Kanaide 及其同事使用人平滑肌 α-肌动蛋白启动子在鼠模型中表达了犬 NCX1.3。在这些表达 NCX1.3 的小鼠中，毛喉素对 PKA 的激活在主动脉中诱导的 [Ca²⁺]i 和张力下降幅度大于野生型对照。这些变化在 NCX 抑制（低 Na⁺ PSS 或 SEA0400）存在时被抑制，提示 Na⁺/Ca²⁺交换体在这些毛喉素诱导的现象中的作用。使用平滑肌（SM）特异性启动子的 NCX1 敲低减弱了小鼠的血管收缩、L 型 Ca²⁺通道电流并降低血压。在有利于反向 Ca²⁺交换的条件下——低细胞外 Na⁺浓度、纳摩尔乌本苷或 NCX 抑制剂 SEA0400 处理，加压肠系膜动脉中的血管收缩和肌源性张力也被减弱。肌源性张力和血压的降低归因于经 NCX1 的 Ca²⁺进入减少，导致较低的胞质 Ca²⁺浓度。利用 α1⁻/⁻、α2⁻/⁻ 和 α2⁻/⁻ 小鼠，Paul 及其同事发现 α2⁻/⁻ 主动脉对受体介导刺激比野生型主动脉更敏感，同时也表现出更快的力发展速度。α2⁻/⁻ 主动脉对通过 A-或 G-激酶通路激活的舒张也不那么敏感。另一方面，α1⁻/⁻ 主动脉的收缩力值与野生型相同。α2⁻/⁻ 主动脉的收缩力值通常介于 α2⁻/⁻ 和野生型主动脉之间。如果 α2 同种型确实通过与 NCX 和 SERCA 的共定位调节 SR 功能，那么它在 α2⁻/⁻ 主动脉中的缺失将导致 Na⁺/Ca²⁺交换的抑制或反向，最终导致亚质膜区室 Ca²⁺含量的增加。这反过来可能导致更大的 SR 负荷，这可能解释受体介导刺激敏感性的增加和力发展速度的加快。这种"超负荷"的 SR 也可能解释观察到的对激动剂诱导舒张的敏感性降低，因为早已确立 SERCA 可被升高的 SR Ca²⁺抑制。基于 NKA 在信号传导中的直接作用（详见下文）的另一种假说已被 Xie 及其同事提出。在小鼠模型中与低水平乌本苷结合——在这种情况下仅与 α2 同种型结合——观察到的收缩力增加被认为不仅与改变的泵活性有关，还与 Src 激酶的激活有关，最终导致肌醇三磷酸（IP3）的产生、IP3 受体的敏化和 SR Ca²⁺释放。因此，NKA 的乌本苷抑制可能既有利于 SR Ca²⁺储存增强，又有利于 SR Ca²⁺储存耗竭。最近在血管平滑肌细胞中比较这些选择的建模表明，当乌本苷的主要作用是 α2 NKA 的抑制时，乌本苷可导致增强的 [Ca²⁺]i 瞬变，从而导致增强的 SR Ca²⁺负荷。更复杂的是，最近对来自 18 天胎龄 α2⁻/⁻ 小鼠的培养主动脉平滑肌细胞的研究表明，SR Ca²⁺负荷与对照野生型小鼠相似。PMCA 活性和电容性 Ca²⁺进入的改变是影响这些培养细胞中 Ca²⁺处理的潜在补偿途径。Paul 和同事生成了分别携带 NKA α1 或 α2 同种型转基因与平滑肌特异性 α-肌动蛋白启动子 SMP8 偶联的小鼠。携带 α2 转基因（α2sm1）的小鼠为低血压，而携带 α1 转基因（α1sm1）的小鼠为正常血压。一个令人惊讶的观察是 α 同种型的协调表达。无论表达哪个转基因，两种 α 同种型和总 NKA 在蛋白质和 mRNA 水平上均以相似程度增加。这些增加在 α2sm1 品系中更大，提示观察到的血压降低依赖于 α 同种型表达的扩展程度。α1sm1 主动脉未检测到收缩力参数差异，与血压无变化一致。使 α2sm1 主动脉中血压降低的解释复杂化的发现是不仅 α2 同种型蛋白增加，其他 Ca²⁺清除蛋白 PMCA、NCX 和 SERCA 也增加。重要的是，没有出现蛋白质的全面增加，特别是收缩相关蛋白——肌动蛋白、肌球蛋白轻链和 calponin——保持不变。Ca²⁺清除可能对 Ca²⁺稳态和信号传导至关重要，以至于其所有元素可能被作为一个单元进行协调调控。因此，α2sm1 主动脉中血压降低和收缩力效应的另一种解释与 Ca²⁺清除蛋白的更大表达相关。虽然 NKA-NCX 显然在 Ca²⁺清除中重要，但 α 同种型在 NKA Ca²⁺清除中的作用看起来不同，但机制尚未完全解决。Blaustein 及其同事发现 α2⁺/⁻ 小鼠为高血压，而 α1⁺/⁻ 小鼠为正常血压。在 α2⁺/⁻ 肠系膜动脉中观察到分离的加压肠系膜动脉中肌源性张力增加，但在 α1⁺/⁻ 动脉中未观察到。这些研究者提示 α2⁺/⁻ 小鼠中观察到的高血压可能源于这种升高的肌源性张力。由于 NCX 抑制剂 SEA0400 和 KB-R7943 阻断了 α2⁺/⁻ 动脉中肌源性张力的增加，可以推测 NCX 是主要参与者。α2-Na⁺泵活性的降低可能导致 [Na⁺]i 增加并通过反向 NCX 活性导致肌源性张力。最终，动脉肌细胞的 α2 同种型似乎参与血压的长期调节。

Na⁺/K⁺ ATP 酶与信号传导（Na⁺ K⁺ ATPase and Signaling）

NKA 在 Ca²⁺稳态中作用的一个相对较新的方面是其在细胞信号传导中的潜在参与。NKA α1 同种型包含三个不同的结构域，其结合基序据报道与信号分子相互作用，包括 IP3R、PLC-γ、PI3K、ERK 和 Src。Caveolae 似乎是 NKA 受体功能所必需的，具体对于血管平滑肌而言。这些相互作用——主要基于使用乌本苷抑制 NKA 的研究——表明内源性强心苷产生第二信使和调节蛋白激酶级联活性的潜力。这种强心苷的作用并非没有怀疑者。然而较新的研究倾向于令人信服。最广泛的关于此类信号传导的文献涉及 Src 的激活。Xie 及其同事提出了一种模型，其中与 NKA 结合的 Src 位于 caveolae 中。乌本苷结合激活 Src，然后激活其他下游信号通路。许多下游系统被报道参与其中，包括早期反应基因和许多代谢途径。区分机制的一个困境在于，即使纳摩尔乌本苷对 NKA 的抑制也可在小型小鼠肠系膜动脉中数分钟内导致 [Ca²⁺]i 和收缩力的增加，这也可能在数分钟内增强信号通路。NKA 的信号传导功能为强心苷类药物（如地高辛）的作用机制提供了分子基础——传统上认为强心苷仅通过抑制 NKA 引起细胞内 Na⁺ 累积、继而通过反向 NCX 增加 [Ca²⁺]i 来增强心肌收缩力，但现在认识到 NKA 同时作为信号枢纽激活 Src 及其下游激酶级联，可能独立于其离子泵功能调控基因表达和细胞增殖。这一发现为强心苷在血管平滑肌中的非收缩效应（如血管重塑、炎症反应）提供了机制解释，并将 Na⁺/K⁺ ATP 酶从单纯的"离子泵"重新定位为"离子泵+信号转导器"的双功能蛋白。

线粒体与 Ca²⁺稳态（Mitochondria and Ca²⁺ Homeostasis）

人们早已知道线粒体可以摄取 Ca²⁺。这里的问题是它对血管平滑肌 Ca²⁺清除的相关性，这当然将取决于特定的血管平滑肌。线粒体被认为是 Ca²⁺信号传导中的主要参与者，但它们作为主要清除组分（而非相互作用的 Ca²⁺清除系统的调节者）的作用不太确定。鉴于它们在 ATP 合成、细胞氧化还原电位、活性氧（ROS）生成和 Ca²⁺积累中的作用，如果线粒体在 Ca²⁺稳态中不发挥任何作用，那将是值得注意的。线粒体通过电子传递链挤出质子而产生负膜电位。当 [Ca²⁺]i 超过约 100 nM 时，通过电生单向转运体使用由电子传递链活性在内线粒体膜上产生的电位 ΔΨm 来积累 Ca²⁺。线粒体通过 Na⁺或 H⁺逆向转运体将 Ca²⁺更缓慢地释放回胞质。以这种方式，线粒体可充当 Ca²⁺缓冲器。目前对平滑肌的研究重点是线粒体与 SR 在微域中的紧密接近。在一些细胞中，线粒体位于产生 Ca²⁺火花的 Ca²⁺释放单元起始位点附近。线粒体可能在平滑肌中充当"防火墙"，缓冲由 RyR 簇产生 Ca²⁺火花释放的 Ca²⁺，保护平滑肌不产生全局而非局部的 Ca²⁺信号。在平滑肌中，Van Breemen 及其同事表明线粒体可以以多种方式调节 Ca²⁺稳态。上述研究中综述的大部分知识依赖于线粒体抑制剂。可以预期这不仅影响 Ca²⁺摄取，还会改变 ROS、氧化还原电位和 ATP 供应。后者值得考虑，因为 ATP 为 Ca²⁺清除离子泵供能。张力性动脉的基础 ATP 利用率在 0.5 至 2 μmol ATP/min·gwt 范围内。相位性动脉通常较高，并在维持主动等长收缩时，使用率可加倍。血管平滑肌的总磷酸原（ATP + PCr）含量通常为 3–6 μmol/gwt，因此需要持续的代谢供应。取决于条件，限制磷酸原产生的线粒体抑制可能模糊此类数据的直接解释。有趣的是，就支持离子泵功能而言，已知与质膜微区相关的糖酵解酶在有氧条件下优先为 Na⁺/K⁺ ATP 酶供能。糖酵解在低氧条件下可轻易翻倍或更多，且大动脉在低氧下可维持显著的力，其中信号传导——而非 ATP 限制——似乎解释了从有氧条件失去力。因此可以使用低氧在无线粒体 ATP 产生（推测还有 Ca²⁺摄取）的情况下研究 Ca²⁺清除；尽管 ROS 产生可能仍然是个问题。在非刺激条件下，系统性血管一般在暴露于低氧时不会收缩，而是温和地舒张，提示任何潜在的线粒体 Ca²⁺释放并不大或很快被 SR 摄取或挤出。由于力基线水平在低氧下维持，Ca²⁺清除在可观的 Ca²⁺泄漏下持续发生。在受刺激动脉（如猪冠状动脉）中，低氧降低力和 [Ca²⁺]i，这在再氧合时可逆。这些动脉可在缺氧条件下可逆地收缩和舒张，表明在无线粒体氧化代谢下存在显著的 Ca²⁺清除能力。低氧下不需要线粒体进行 Ca²⁺清除，它们在有氧条件下的贡献可由其他 Ca²⁺清除机制补偿。这部分可由血管平滑肌的强大糖酵解能力解释。尽管线粒体对 Ca²⁺的表观亲和力较低，但线粒体 [Ca²⁺]m 已被证明反映胞质 [Ca²⁺]i。解释是局部 [Ca²⁺]可显著高于胞质。问题是作为 Ca²⁺清除因素，线粒体与例如 SR 相比有多大？线粒体被估计占血管平滑肌体积的约 5%，与 SR 相似，因此需要一些 Ca²⁺缓冲以避免 Ca²⁺过载以清除胞质 Ca²⁺。这通常被认为是 PO₄。线粒体 Ca²⁺含量据报道高达 100 nmol/mg 蛋白，似乎能够超过其全部 P 含量，这可能反过来限制 ATP 产生。这将是线粒体作为 Ca²⁺汇的一个限制，和/或需要一种挤出 Ca²⁺的方法——据推测经 SR。此外，线粒体还被建议参与 SR Ca²⁺负荷。然而，与其他 Ca²⁺螯合细胞器相比，按每个循环离子所用能量来说这并不有利。Ca²⁺进入内线粒体基质的成本大约是 Ca²⁺泵的两倍（就由于线粒体膜电位降低导致的 ATP 损失而言）。如果 SR 能直接从胞质中加载和卸载 Ca²⁺，显然会更有效。也许线粒体氧化磷酸化与 Ca²⁺的协调值得额外成本。关于线粒体在 Ca²⁺清除中的作用，培养平滑肌细胞中 [Ca²⁺]i 的测量一直模棱两可。除了组织和物种差异之外，必须记住与细胞培养相关的平滑肌 EC 偶联中众所周知的变化。在大鼠主动脉和肺动脉平滑肌细胞中，中等（约 1 μM）的 [Ca²⁺]i 增加不影响线粒体 [Ca²⁺]。在电压钳下的大鼠股动脉细胞中，CCCP 对线粒体的抑制改变了咖啡因诱导的 Ca²⁺释放和 Ca²⁺清除。在培养的小鼠主动脉细胞中，使用 CPA 释放钙库后，当 NCX 和 PMCA 也被抑制时，CCCP 或钌红适度影响 [Ca²⁺]i，提示在高 [Ca²⁺]i 下线粒体的作用。使用透化冠状动脉的研究表明线粒体起次要作用。基于使用 Ca²⁺清除抑制剂的研究，与 NCX、PMCA 和 SERCA 相比，线粒体清除似乎不是主要因素。另一方面，线粒体在 Ca²⁺信号传导和 Ca²⁺清除系统的潜在协调中具有更明确的作用。尽管我们将 Ca²⁺清除系统——PMCA、NCX-NKA 和 SERCA-PLN——作为独立实体处理，但它们是相互关联的。例如，PMCA 对 Ca²⁺的挤出导致 H⁺的反向转运，从而通过 Na⁺/H⁺交换体与 NKA 偶联。这与上文讨论的 NCX 和 NKA 的偶联是相加的。SERCA 也是相互关联的，特别是如与 α2-NKA 和 NCX 的亚质膜区室化所提出的。此外，如钙库操纵性 Ca²⁺进入（上述）一节所述，SR[Ca]——由 SERCA 调节——通过钙库操纵性 Ca²⁺进入与 Ca²⁺内流相联系。

结论（Conclusion）

平滑肌类型本身之间的差异通常大于平滑肌和骨骼肌之间的差异。因此，鉴于其广泛的功能多样性，调节和维持 Ca²⁺稳态的机制也大相径庭，这是不足为奇的。我们现在对 Ca²⁺进入和清除的主要参与者有了更好的理解。我们还在理解（即使只是认识到）参与者之间的相互作用是 [Ca²⁺]i 调节的核心方面取得了进展。这些复杂的相互作用——鉴于 [Ca²⁺]i 稳态对细胞信号传导和功能的重要性——将继续是平滑肌研究的主要焦点。

本章个人批注

本章是平滑肌部分关于 Ca²⁺稳态与信号传导的综述，体量适中（1019 行源文），但章节逻辑非常清晰——先按"来源→清除"的两大类组织，每一类内再细分通道/泵/交换体/细胞器。每个小节都在做相同的模式：先给出生化/分子基础（通道类型、亚型、基因），再给出功能证据（抑制剂、转基因/基因敲除小鼠模型），最后给出与生理功能（收缩张力、血管张力、血压）的联系。Burdyga 和 Paul 的写作风格非常"实用主义"——他们从不掩饰"我们仍不完全理解"，比如在 Ca²⁺火花部分明确说"loose coupling"的机制仍 poorly understood，在线粒体部分坦承 mitochondrial clearance does not appear to be a major factor compared to NCX, PMCA and SERCA，但对每一个观察都给出至少一个定量数据点或一个关键文献。这种风格对我来说是有用的，因为它明确区分了"已知事实"和"尚未定论"，避免了在读综述时常见的把假说过度包装成事实的陷阱。我个人最感兴趣的是第 86 章与前几章（83-85）的衔接方式——83 章讲平滑肌超微结构，84 章讲离子通道，85 章讲 GPCR，本章则把所有通道和受体的下游汇聚到 [Ca²⁺]i 这一"通用货币"。这是教科书典型的"汇流"式章节布局。从我自己的 SMC G&R 研究角度看，本章最有价值的信息是 phospholamban 在平滑肌中的双重作用（既通过 RyR/BK 火花通路影响 Ca²⁺火花频率，又通过 SERCA 直接调节 Ca²⁺摄取率）——这两个机制在血管张力调节中的相对贡献目前仍有争议，是建模时必须考虑的关键不确定性。另一个让我停下来思考的是 Na⁺/Ca²⁺交换体部分，特别是 NKA α2 亚型与 NCX 的微域偶联——这个机制意味着 NCX 的"低亲和力"在亚质膜微域中可能被局部高 [Ca²⁺]克服，从而在 SR 补充中发挥比预期更大的作用。这与 FEniCS 模型中将 NCX 处理为均匀分布的简化形成对照。最后，作者反复回到一个总论观点：所有 Ca²⁺清除系统（PMCA、NCX-NKA、SERCA-PLN、线粒体）不是独立运作的，而是物理上共定位并可能受协调遗传调控——这是"功能单元"概念的核心证据（Pritchard et al. 2010 的研究）。

与上下章的衔接（一段话）

本章位于平滑肌部分（Part IV）的中心位置，紧接第 85 章（Wirth/Offermanns 关于平滑肌 GPCR）。第 83-85 章从超微结构到离子通道再到受体，逐层铺设了"刺激如何到达平滑肌"的基础设施；本章则把所有这些通路——电压门控通道、受体门控通道、钙库操纵性通道、GPCR 下游的 IP3R/RyR——汇聚到 [Ca²⁺]i 这一通用货币上，并把焦点转向"细胞如何将 Ca²⁺从这个通用货币中清除出去"（SERCA、PMCA、NCX-NKA、线粒体）。从章节安排的角度看，本章起着承上启下的过渡作用：它把所有上游信号的"输入端"总结为 [Ca²⁺]i 的时空模式（sparks/puffs/waves/oscillations），并把"输出端"（清除系统）的机制细节留给下一章（第 87 章"平滑肌收缩的调节"），后者将进一步把这些清除机制的功能后果与收缩力的实际调节联系起来。在动脉血压、血管运动（vasomotion）、肌源性张力的语境下，本章建立的清除系统清单（特别是 α2-NKA/NCX/SERCA 微域和线粒体"防火墙"概念）将在第 92 章（血流动力学控制）和第 99 章（动脉高血压）中再次出现，作为这些下游疾病的分子基础。