第 79 章：肌肉抑制素——调控、功能与治疗应用（Myostatin: Regulation, Function, and Therapeutic Applications）

Discovery of Myostatin and Its Biological Function as a Negative Regulator of Muscle Mass

肌肉抑制素（MSTN，又称 growth/differentiation factor-8 或 GDF-8）最初是在一项寻找转化生长因子-β（TGF-β）超家族新成员的筛选中发现的。其在骨骼肌谱系中近乎独有的表达模式，无论胚胎期还是成年组织，Mstn mRNA 都几乎只在骨骼肌系中被检出，提示其可能参与骨骼肌的发育与功能。MSTN 的生物学功能是通过小鼠基因打靶研究得以阐明的：Mstn 缺失的小鼠全身骨骼肌量均出现大幅增加，单块肌肉可生长至正常大小的约两倍。肌纤维数目与肌纤维体积在 Mstn 缺失小鼠中均升高，说明 MSTN 正常情况下同时承担两种限制肌肉量的角色——发育期调控形成的肌纤维数目，以及出生后调控肌纤维生长。MSTN 的发现立即提示，抑制其信号的分子可能用于促进肌肉生长，既可用于畜牧增产，也可用于治疗人类的肌肉消耗性疾病。事实上，大量后续研究为这类应用提供了强劲动力。尽管最初的鉴定与功能研究是在小鼠中完成的，现在已经清楚，MSTN 的氨基酸序列与其作为肌肉量负调控因子的功能在各物种间高度保守。例如，鸡与人的活性 MSTN 分子预测氨基酸序列完全相同；而导致肌肉量增加的 MSTN 基因自然突变已在牛、绵羊、狗与人中被陆续鉴定。这些发现连同对通路调控与信号组分的鉴定（图 79.1），推动了多种能在体内阻断 MSTN 活性的药理学制剂的开发（9–14），其中若干在系统给药正常成年小鼠时即可诱发显著的肌肉生长，明确证明这一调控系统在出生后持续抑制肌肉生长。

Regulation of MSTN Extracellularly by Binding Proteins

MSTN 以一种前体蛋白形式合成，经蛋白水解加工后产生活性形式（1）。信号肽切除后，pro-MSTN 由 furin 类蛋白酶切割，生成一段 109 个氨基酸的 C 端片段，其二硫键连接的二聚体即为生物活性分子。前体加工是活性 MSTN 水平可被调控的一个环节（15）。加工完成后，C 端二聚体仍以非共价方式与 N 端前肽（propeptide）结合，使 C 端二聚体维持在无活性或潜伏状态（16, 17）。这种由 C 端二聚体与 N 端前肽构成的潜伏复合物代表了血液中 MSTN 的主要循环形式（18, 19）。潜伏复合物中的 C 端二聚体可在体外通过促使前肽解离的方式被激活，例如酸处理或热处理（11, 18）。一个重大问题是该潜伏复合物在体内如何被激活，现有相当多证据表明该激活主要由 BMP-1/TLD 家族的金属蛋白酶对前肽进行蛋白水解切割来完成（11, 20）。这一蛋白酶家族四个已知成员（BMP-1、TLD、TLL-1、TLL-2）的纯化形式均能在体外切割并激活纯化的 MSTN 潜伏复合物（11）。此外，将 Mstn 基因中使前肽抵抗切割的靶向突变、或该蛋白酶家族至少一个成员（Tll2）的靶向突变引入后，小鼠在肌肉量增加方面可部分模拟 Mstn 缺失突变表型，与这些突变小鼠中潜伏复合物无法被充分激活一致（20）。

除前肽外，多种其他蛋白已被证明可结合并抑制 MSTN 活性。其中之一是卵泡抑素（follistatin, FST），一种最初因其抑制垂体细胞分泌 FSH 的能力而被鉴定的蛋白（21, 22）。FST 通过结合激活素（activins）发挥作用（23），激活素与 MSTN 同属 TGF-β 家族的分泌蛋白。后续研究证明 FST 也能结合 TGF-β 家族其他成员，最显著的是骨形态发生蛋白（BMPs）以及与 MSTN 高度相关的 GDF-11（1, 24）。后者提示 FST 也许也能结合并抑制 MSTN，这一点既被利用纯化蛋白的体外研究所证实，也被在骨骼肌中过表达 FST 转基因的小鼠体内研究证实（16）。支持内源 FST 在体内正常作为 MSTN 信号拮抗剂的证据是：Fst 缺失杂合小鼠（Fst 纯合缺失不可存活）表现出肌肉量减少（25），与 Mstn 缺失小鼠的表型相反。尽管这些发现与 Fst 突变小鼠中 MSTN 信号增强相一致，针对 Fst/Mstn 双突变小鼠的遗传学分析表明，FST 限制肌肉量是通过阻断 MSTN 以及另一种具有相似生物活性的配体共同实现的。在完全缺乏 MSTN 的小鼠中，肌肉中过表达 FST 仍可使肌肉量再翻一番（即整体四倍增加）（26）（图 79.2）。尽管与 MSTN 协同作用的配体身份仍待鉴定，多项研究将激活素 A 列为最有可能的候选。

除 FST 外，还鉴定了多种其他 MSTN 抑制蛋白。其一是 FSTL-3（也称 FLRG），属卵泡抑素家族另一成员。FSTL-3 能在体外结合 MSTN 并抑制其活性（19），小鼠中过表达 FSTL-3 引起肌肉量增加（26），与体内抑制 MSTN 活性一致。尽管 FSTL-3 缺失小鼠肌肉量大致正常（25, 27），血清中已检测到 FSTL-3 与 MSTN 形成复合物（19），提示其在体内可能参与调控 MSTN 活性。另外两个含卵泡抑素结构域的蛋白 GASP-1 与 GASP-2 也已被证明可作为 MSTN 抑制剂发挥作用（28, 29）。尽管 GASP-1 和 GASP-2 在体外结合并抑制 MSTN 的能力已有充分记录，但它们在体内的作用尚未明确，因为这些基因突变小鼠的表型尚未见报道；然而，与 FSTL-3 类似，血中已发现 GASP-1 与 MSTN 形成复合物（28），提示其在体内可能参与调控 MSTN 活性。GASP-1 与 GASP-2 在调控 MSTN 活性中的作用可能较为复杂，因为这些蛋白含多个不同的蛋白酶抑制结构域，且既能结合 MSTN 的成熟 C 端部分，也能结合其前肽。最后，另外两种胞外蛋白——LTBP-3（latent TGF-β binding protein-3）（15）与 decorin（30）——也被证明能结合 MSTN，分别被推测参与调控 pro-MSTN 的加工与维持 MSTN 与细胞外基质的结合。

在未被抑制蛋白结合时，成熟 MSTN 分子通过典型的 TGF-β 超家族双组分受体系统发出信号。MSTN 首先与激活素 II 型受体（ACVR2 与 ACVR2B；又称 ActRII 与 ActRIIB）结合（16），对 ACVR2B 的亲和力高于 ACVR2。基于对这些受体基因突变小鼠的分析，这两个受体在肌肉量控制方面功能冗余，MSTN 在体内很可能同时利用这两个受体（12）。MSTN 与激活素 II 型受体结合后，进而招募并磷酸化 I 型受体。体外研究提示两个 I 型受体——ALK4 与 ALK5——均可介导 MSTN 信号（31），但靶向这些受体在肌肉中的体内遗传学研究尚未见报道。激活的 I 型受体几乎可以确定是通过磷酸化 Smad2 和/或 Smad3 来传递细胞内信号。尽管该通路激活与抑制后所引起的部分基因表达变化已被鉴定，但其中哪些对于操控该通路后所观察到的生理效应是必需的尚不清楚。

Development of MSTN Inhibitors as Potential Therapeutic Agents

基于 MSTN 的生物学功能，大量努力被投入到开发能阻断该信号通路的制剂。基于已知调控与信号机制，多数此类制剂为生物制剂并被工程化为 Fc 融合蛋白以增强其体内稳定性。其中一种制剂是 MSTN 前肽的一种形式，如前所述，前肽能结合成熟 MSTN 分子并阻止其信号转导。在体内最具活性的形式是将 Fc 结构域与携带单个氨基酸突变（D76A）以抵抗 BMP-1/TLD 家族蛋白酶切割的前肽突变体融合。该分子既能结合 MSTN 也能结合高度相关的 GDF-11，可在小鼠中诱导与 MSTN 单克隆抗体程度相当的肌肉生长。

迄今报道的最高效药理学制剂是激活素 IIB 型受体的可溶性形式（ACVR2B/Fc 或 ActRIIB/Fc）（12）。该可溶性受体诱导的肌肉增长远比 D76A 突变前肽/Fc 融合蛋白或抗 MSTN 单克隆抗体更为显著。仅两次腹腔注射该可溶性受体即可在两周内在全身范围内诱导 40–60% 的骨骼肌量增加。可溶性受体较其他 MSTN 抑制剂效果增强的一个主要原因是，与 FST 类似，它也能抑制 MSTN 之外的其他对肌肉量有限制作用的 TGF-β 家族成员。可溶性受体较其他 MSTN 抑制剂扩展作用范围的最清晰证明是：即便在 Mstn 缺失小鼠中，该可溶性受体仍能诱导肌肉生长。至少 Acceleron Pharma 一家生物技术公司已将该可溶性受体推进至人体试验，目前正针对肌营养不良患者进行该分子的 II 期临床试验。

尽管在开发能在体内靶向该通路的生物制剂方面已取得相当进展，但在开发 MSTN 信号的小分子抑制剂方面进展甚少。针对 ALK4 与 ALK5 这两个 I 型受体的小分子抑制剂已为其他用途而被开发，并被证明能在体外阻断 MSTN 信号（32）；然而迄今尚未见报告证明这些抑制剂能在体内诱导肌肉生长。基于目前已知的通路调控与信号组分，其他明显的小分子药物发现潜在靶点包括两个 II 型受体 ACVR2 与 ACVR2B，以及 BMP-1/TLD 家族的金属蛋白酶。最后，有报告提示某些 HDAC 抑制剂可诱导 MSTN 拮抗剂 FST 的表达（33），部分研究报告了 HDAC 抑制剂在肌肉退行性病变中的有益效应，这些效应被归因于它们能上调 FST 的表达（34）。显然，该通路小分子抑制剂的研发仍处于起步阶段，这方面工作的一个主要挑战是将已知组分的靶向效应限制于肌肉，或发现可能更具肌肉特异性的新组分。

Physiological Effects of Targeting MSTN Signaling in Normal and Disease Settings

遗传学与药理学操控工具的齐备，引发了大量研究以考察在正常与疾病背景下操控该通路的影响。已清楚的是，正常小鼠中抑制该信号通路可带来显著且广泛的骨骼肌量增加。发育期抑制该通路的遗传学操作引起肌纤维数目增加，多项研究表明 Mstn 缺失小鼠肌纤维数目的增加仅限于 II 型纤维（主要为 IIx 与 IIb）（35–38）。相比之下，出生后通过遗传或药理学手段抑制该通路则引起肌纤维肥大，此时 I 型与 II 型纤维似乎均受影响（39–41）。一般也认同这些肌肉量增加伴随着肌肉力量与收缩力的提高，最具戏剧性的例证也许是 Mstn 杂合缺失突变惠比特犬的比赛成绩提升（7）；但也有研究报告该通路下调时比力下降，提示对肌肉功能的影响可能与对肌肉量的整体影响不成比例（36）。最后，很清楚的是该信号通路所能产生的效应范围极大，在该范围内调控系统的运作非常像一个变阻器，其多个调控组分上的突变均显示单倍不足（综述见参考文献 42）；因此通过对各组分间稳态平衡的精细操控，可以对肌肉量与生长效应进行细致调节。

MSTN 调控系统的上述特性以及操控信号水平的工具与方法，使该通路成为密集研究的对象，以寻找 MSTN 信号靶向可能带来治疗益处的人类疾病状态。这方面努力的一个主要部分是考察在原发性肌肉退行性疾病（如肌营养不良）中靶向该通路的潜在益处。其逻辑是：尽管这一策略不能解决肌肉退化的根本病因，但在该疾病背景下靶向 MSTN 信号可能允许额外的肌肉生长和/或再生，从而也许能补偿 dystrophin 等基因突变所造成的肌肉功能丧失。已有大量研究报告了多种遗传性肌营养不良模型中或引入 Mstn 缺失突变、或直接给予 MSTN 抑制剂的效果，这些模型包括 Duchenne 肌营养不良、1A 型先天性肌营养不良以及多种亚型的肢带型肌营养不良（综述见参考文献 43）。尽管结果因所考察的具体模型、所采用的具体干预以及所研究的疾病阶段而有所差异，但一致的正面发现是，信号的缺失或抑制通常可在其中许多模型中增加肌肉量与力量。此外，在若干情形下也观察到对减少肌肉纤维化的有益效应。这些临床前研究结果足够令人鼓舞，以至于两项针对肌营养不良患者的临床试验得以推进：一项使用针对 MSTN 的单克隆抗体（MYO-029）针对一组异质性的成年患者（44），另一项使用可溶性 ACVR2B 受体针对 Duchenne 肌营养不良儿童。

若干临床前研究也在肌营养不良之外的其他神经肌肉疾病模型中测试了 MSTN 抑制的疗效（综述见参考文献 43）。具体而言，遗传学与药理学方法均被用于在肌萎缩侧索硬化症（ALS）与脊髓性肌萎缩（SMA）小鼠模型中抑制 MSTN 通路。这些研究结果参差不齐，尽管部分研究中观察到了肌肉量增加，但干预并未带来总体生存方面的显著改善。

尽管 MSTN 抑制作为治疗策略的关注重点一直在肌肉退行性疾病的遗传模型上，相当多的兴趣集中于这一治疗策略在更急性肌肉丢失情形下是否同样有效。这方面研究的一大领域是恶病质（cachexia），后者可伴随多种疾病状态，包括癌症、艾滋病、败血症、烧伤、肾衰竭以及充血性心力衰竭。尽管恶病质的病因尚不完全清楚，MSTN 过表达本身可诱发小鼠出现类似恶病质综合征的发现使人们猜想该通路的过度活化在恶病质患者肌肉消耗中可能具有病因学作用（18）。事实上，多项研究发现恶病质实验模型中该调控系统的若干组分被异常调节，最近一项研究发现多种人类肿瘤高水平产生激活素 A，提示激活素 A 至少在部分癌症恶病质患者中可能是激活该信号通路的"罪魁"（45）。若干研究报告了在小鼠恶病质实验模型中药理学阻断 MSTN 通路能有效保存肌肉量或逆转肌肉丢失（14, 45, 46）。此外，在其中一项研究中，可溶性 ACVR2B 受体阻断该通路可在携带诱导恶病质肿瘤的小鼠中延长生存，尽管实际肿瘤生长并未受到影响，提示在癌症患者中保存肌肉量本身就可能延长生存（45）。

尽管这些研究为进一步评估该治疗策略在恶病质患者中的效果提供了有力支持，但该通路的激活是否在恶病质（至少是癌症恶病质）的发生中起病因作用这一问题尚未得到完全回答。在心源性恶病质的情形下，MSTN 在恶病质中的病因作用已被更牢固地确立。尽管在正常条件下体内 MSTN 的主要来源是骨骼肌，但在心衰过程中（无论在人类还是在动物实验模型中）心肌中 MSTN 表达被上调（47–50）。此外，小鼠中 Mstn 基因的心特异性敲除被证明可以阻止横向主动脉缩窄后循环 MSTN 蛋白水平的升高，并使小鼠免于该损伤模式中通常诱发的骨骼肌萎缩（51）。假设同一机制也负责人类心源性恶病质的诱发，这也许是目前最清晰的疾病例子，其中 MSTN 过度活化在肌肉消耗的发病机制中起直接作用。确定 MSTN 在多大程度上参与其他疾病状态所诱发的恶病质将十分重要。

除肌肉退行性疾病与恶病质外，被积极探索 MSTN 抑制潜在治疗应用的第三个领域是随年龄增长发生的肌肉丢失，即年龄相关性肌减少症（sarcopenia）。众所周知，人类随年龄增长丢失肌肉量，尽管已提出多种假说来解释这一现象的分子与生理基础，但年龄相关性肌肉丢失的原因尚未完全阐明。多种研究考察了 MSTN 信号水平随年龄的变化是否可能在年龄相关性肌减少症的病因中起作用（综述见参考文献 52）。这些研究包括对年轻与年老小鼠及人类 MSTN 及若干已知信号组分水平的测量、对年老 Mstn 敲除小鼠肌肉丢失模式的分析、以及试图将人类编码信号组分的基因多态性与老年人肌肉功能相关联。尽管这些研究已识别若干诱人的关联，仍需进一步研究以更确切地建立 MSTN 在肌减少症病因中是否起作用。至少在动物研究中已清楚的是，年老肌肉对该通路抑制仍有反应。若干研究显示，年轻小鼠中药理学靶向该通路的合成代谢效应在年老小鼠中同样可见（13）。至于人类中是否同样如此，目前尚言之过早。

最后，已充分确立的是，靶向 MSTN 通路不仅能在增强肌肉量与功能方面产生深远效应，也能在改善代谢功能方面产生深远效应。事实上，一项早期研究显示，MSTN 缺失小鼠脂肪储存减少，且在肥胖与 II 型糖尿病小鼠模型中 MSTN 缺失可部分抑制脂肪堆积与胰岛素抵抗的发展（53）。这些代谢效应究竟是 MSTN 信号对脂肪组织的直接丢失所致，还是 MSTN 缺失对骨骼肌合成代谢效应的间接结果，尚未被确定地建立。前一种可能性得到以下证据的支持：体外与体内研究均显示 MSTN 可直接向脂肪细胞发出信号（综述见参考文献 54），以及肥胖小鼠脂肪组织中 MSTN 表达被显著上调（55）的观察；然而基于在多种不同品系、肌肉量增加的小鼠中均观察到类似的代谢效应这一事实，更可能的是该通路被靶向的小鼠中所见的代谢效应是骨骼肌信号丢失的间接结果。无论这些代谢效应的潜在基础是什么，大量后续研究已经证明在该通路的靶向在代谢疾病实验模型中的潜在益处，其中包括将 MSTN 抑制剂系统性给予小鼠的研究（13, 56）。结果，存在相当大的兴趣关注靶向该通路的制剂可能不仅适用于肌肉退行性与消耗性病变，也可能适用于肥胖与 II 型糖尿病等疾病的潜在应用。

Conclusions and Speculation

自从 1997 年首次发现肌肉抑制素作为肌肉量的负调控因子以来，在理解肌肉抑制素的调控、鉴定该信号系统的关键组分、以及评估体内操控 MSTN 通路的效果方面取得了巨大进展。已有大量药理学制剂被开发并被证实在体内能阻断该通路。其中许多已在多种肌肉与代谢疾病实验模型中进行了测试，基于这些临床前研究，若干此类制剂已推进到人体试验阶段。然而尽管取得了这些进展，关于 MSTN 生物学仍有许多重要问题悬而未决。也许最基本的问题涉及该调控系统的演化。举例而言，为何该系统已演化出如此复杂的调控组分网络？而且，鉴于在局部调控单块肌肉的生长最为合理，为何要发展出一个让像 MSTN 这样关键介质在血液中循环的系统？也许最根本的是，为何该调控系统在演化选择中被如此强有力地保留？

在试图回答这些基本问题时，必须牢记 MSTN 缺失不仅导致骨骼肌量大幅增加，也对脂肪堆积与葡萄糖代谢具有显著效应。在这方面，我先前推测过（42, 57）：MSTN 的基本生理作用也许是调控肌肉与脂肪之间的稳态平衡，也许 MSTN 信号水平可响应各种生理刺激而被调节，以使代谢平衡向肌肉生长或脂肪储存方向偏移。该模型的一个吸引人之处是，它为解释该调控系统的复杂性以及 MSTN 生物学中的一大谜团（即 MSTN 在血液中循环）提供了合理依据。根据该模型，循环 MSTN 蛋白水平可被调节以设定全身骨骼肌量的总体上限，但由于循环 MSTN 蛋白结合于抑制蛋白而呈生物潜伏状态，单块肌肉的生长可在局部通过调控潜伏 MSTN 复合物在靶位点的激活程度来控制。以此方式，MSTN 可作为肌肉与脂肪之间整体代谢平衡的系统调节因子，同时在局部控制单块肌肉的生长。

若该假说成立，其含义将是：尽管 MSTN 对野外动物起关键作用，但对于人类整个调控系统可能大体上可有可无；也就是说，鉴于人类已不再受诸如掠食者威胁、食物匮乏以及长时间暴露于极端温度等环境应激的影响，我们的生存可能更少依赖于在肌肉与脂肪平衡中将稳态设定点精确地维持在哪里。在这方面，对人类而言，MSTN 调控系统本质上可能是一种演化残留，这使 MSTN 成为药物干预的理想靶点。当然，基于迄今学术与制药界所做的广泛努力已清楚的是，能调节 MSTN 活性的制剂可在体内产生深刻效应。前进的挑战将是更精确地定义该通路的药理学操控将带来治疗益处的疾病情形，并将那些临床适应症与具体的 MSTN 抑制剂进行匹配。

（参考文献：57 篇。完整书目可在源文 Chapter 79 末尾查阅；本节内概述不对引用文献本身做转述。）

本章个人批注

这一章是一篇相当完整的领域综述，逻辑线索相当清晰：从基因发现 → 蛋白加工与调控 → 抑制剂开发 → 体内生理效应 → 综合与推测。值得注意的几个点是：

第一，作者是 Se-Jin Lee 本人——他就是 1997 年发现 MSTN 的那篇文章的第一作者（虽然该文第一作者是 McPherron）。所以整章带有强烈的"局内人"叙事色彩，比如把"the MSTN regulatory system may essentially be an evolutionary vestige"作为整章的收尾。这是教科书里少见的"作者第一人称现身说法"的章节。

第二，"rheostat"（变阻器）这个比喻相当贴切，且作者多次回到它——多个调控组分的单倍不足效应意味着这条通路不是一个开关而是一个旋钮。这一点对药理学有含义：可以根据所需肌肉量增加的幅度"精细调节"抑制强度。

第三，"Conclusions and Speculation"那一节明确把"为何如此演化"作为悬而未决的核心问题提出，并给出了自己的"muscle-fat 稳态平衡"假说。这个假说是否站得住脚，读者可以自行判断——比如有批评意见认为这个假说只是把"为何如此复杂"重新表述为"为何维持 muscle-fat 平衡需要这样复杂的网络"，并不真正解释机制。但作为综述作者本人的总结，它至少为后续研究提供了一个可证伪的框架。

第四，关于"加速器效应"的可溶性 ACVR2B 受体——它在 Mstn 缺失小鼠上仍能继续增加肌肉量这件事，是支持"还有其他限制肌肉量的 TGF-β 家族配体"这一观点的最干净实验证据。作者倾向于 Activin A，但承认尚未盖棺定论。

与上下章的衔接（一段话）

第 79 章是 Part III（骨骼肌）部分的倒数第二章，紧接在第 78 章（DMD/LGMD2B 的免疫学组分）之后。把这两章放在一起读非常有意义——78 章讲的是肌营养不良背景下免疫系统的两面性作用（既可能促进再生，也可能推动纤维化），79 章则讲的是通过调控肌肉抑制素通路来增加肌肉量、可能补偿营养不良背景下的肌肉丢失。事实上 79 章第四节明确提到，针对肌营养不良（包括 DMD、LGMD）的 MSTN 抑制剂临床前研究已经被广泛开展，所以这两章在治疗学层面是直接衔接的——78 章提供"为什么需要补充丢失的肌肉"这一动机，79 章提供"如何补充"的药理学方案。从更宏观的章节序列看，79 章处于一个收束位置：76 章（病毒载体基因治疗）、77 章（细胞治疗）、78 章（免疫学）三条治疗学线索在此汇合，79 章的抑制剂代表"第四条路径"——既不是导入正常基因（76）、也不是移植新细胞（77）、也不仅仅是调节免疫（78），而是通过解除内源性肌肉生长抑制来释放肌肉自身的再生潜能。这恰好呼应了 79 章开头"loss of MSTN increased both fiber number and fiber size"这一发现所暗示的双重机制：既增加发育期肌纤维数目，也促进出生后肌纤维肥大。