第 78 章：遗传性肌营养不良的免疫学组分——杜氏肌营养不良与肢带型肌营养不良 2B 型（Immunological Components of Genetically Inherited Muscular Dystrophies: Duchenne Muscular Dystrophy and Limb-Girdle Muscular Dystrophy Type 2B）
引言
遗传性肌营养不良并非严格意义上的自身免疫病，也不完全复制急性肌肉损伤的状态,但其中许多类型(DMD 和 LGMD2B 尤为典型)都存在不同程度的肌内炎症。这些营养不良的共同特征是肌膜损伤后由卫星细胞介导的肌肉修复，因此它们更准确地代表一种"持续愈合中的伤口"。在正常的伤口愈合过程中,伤口局部释放的炎症介质会诱导黏附分子表达，募集免疫细胞外渗进入组织;TGF-β 由免疫细胞分泌,激活成纤维细胞并促使其分泌细胞外基质蛋白以稳定伤口直至损伤修复;髓系细胞吞噬碎片、分泌生长因子,最终完成修复。但遗传性肌营养不良由于遗传缺陷导致肌细胞膜损伤持续存在，从而形成慢性的炎症环境。组织中既有 TNF、IL-1β、干扰素γ等"促炎"介质，也有 TGF-β、IL-13、IL-10 等"抗炎/促纤维化"介质;这些因子之间的精细平衡对稳定伤口、修复损伤和消除炎症至关重要,一旦这种平衡被打破,就会带来不良后果。此外,肌肉局部环境还会使应答的免疫效应细胞向炎症、坏死或纤维化方向偏移。营养不良肌肉的炎症环境会随时间改变,但最终偏向促纤维化,这一点在 mdx 小鼠和患者肌肉中大量瘢痕组织上得到体现。目前对免疫系统作用的研究主要集中在两种肌营养不良——抗肌萎缩蛋白基因突变所致的杜氏肌营养不良(DMD)和 dysferlin 基因突变所致的肢带型肌营养不良 2B 型(LGMD2B),本章的讨论重点也放在这两种被研究最充分的类型上。对其他营养不良未加讨论并不意味着它们不涉及炎症和纤维化,只是目前关于这些其他类型的信息尚少。
Dystrophin 缺陷肌肉的免疫微环境
营养不良肌肉中含有几乎所有类型的免疫细胞和化学信使。早期的浸润细胞类型描述报告了 DMD 活检组织中以巨噬细胞和 T 细胞为主。DMD 小鼠模型(mdx 小鼠)的出现为研究 dystrophin 缺陷下的免疫反应提供了更深入的条件。mdx 肌肉的病变处包含髓系和淋巴系两类细胞,具体包括 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、双阴性(DN)和双阳性(DP)T 细胞、NK 细胞、NKT 细胞、B 细胞、巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。mdx 和 DMD 活检组织的微阵列分析显示,炎症介质以特定签名形式占主导;此外,许多趋化因子和趋化因子受体表达上调,可能延续炎症反应。本节将讨论这些细胞类型在 DMD 发病机制中的作用,并展示已知的、有望成为该病治疗靶点的炎症介质研究。
巨噬细胞
巨噬细胞是浸润人类和小鼠营养不良肌肉的主要细胞类型。在肌肉坏死的最早阶段,即可见到巨噬细胞游走并包围濒死的肌纤维。骨髓来源的单核细胞进入炎症组织并分化为巨噬细胞。与 T 细胞可被广义分为 Th1 或 Th2 亚型(依据其细胞因子分泌谱)类似,巨噬细胞也可极化为 M1(即促炎症、分泌 TNF、IL-6 和 IL-12)或 M2(即抗炎、促修复、促纤维化,分泌 TGF-β、IFN-γ、IL-4、IL-10)表型。在急性肌肉损伤中已证明 M1 巨噬细胞通过一氧化氮依赖机制杀死肌细胞,而 M2 巨噬细胞则通过分泌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等因素支持肌肉修复。多种细胞因子已被鉴定可促使巨噬细胞向这些亚型极化,包括干扰素γ(促使 M1 型)和 IL-4(促使 M2 型)。
一系列研究阐明了 mdx 小鼠模型肌肉中慢性炎症期间巨噬细胞介导的机制。在疾病早期(3—4 周龄),M1 巨噬细胞占主导;它们表达肿瘤坏死因子和 IL-6,促进其他细胞类型向肌肉趋化。巨噬细胞因子的激活通过 NF-κB 以及纤维蛋白原与 Mac1 整合素的结合实现。此外,M1 巨噬细胞高表达 iNOS,产生细胞毒浓度的 NO,损伤磷脂膜,影响通过 S-亚硝基化的信号传导,或诱导蛋白质变性。iNOS 还可以亚硝基化 ryanodine 受体,加重肌浆网钙泄漏和 calpain 激活,从而恶化疾病。在疾病后期(12 周龄),M2 巨噬细胞成为占主导的类型,表达 IL-10,后者对 M1 巨噬细胞具有抑制作用,并营造有利于肌肉修复的环境。虽然短期提高 IL-10 等 M2 细胞因子可能改善疾病表型,但长期过表达促进纤维化的风险很高,因此需要长期研究以确定其对纤维化进程的影响。M2 巨噬细胞可通过精氨酸酶介导的精氨酸代谢促成骨骼肌和心肌纤维化。这些巨噬细胞高表达精氨酸酶,该酶生成的鸟氨酸和脯氨酸副产物会刺激成纤维细胞合成胶原。因此,小鼠疾病早期阶段复制了急性肌肉损伤的状态,但由于肌肉无法完全愈合,在剩余的病程中建立起一种偏 M2 型、促修复但也促纤维化的环境。针对巨噬细胞进行免疫调节的治疗必须精细平衡促炎和抗炎介质,以免进一步向坏死或纤维化方向倾斜——两者本身都有害。
中性粒细胞
中性粒细胞是营养不良肌肉中数量第二多的细胞类型。它们与巨噬细胞合计约占所有浸润细胞类型的 70%。通过抗体或敲除骨桥蛋白干扰它们在营养不良肌肉中的存在,均可显著改善营养不良表型。它们影响疾病的具体机制尚不清楚,但肌肉损伤研究文献提示中性粒细胞主要通过自由基介导的膜损伤危害肌肉:超氧化物歧化酶生成过氧化氢,再由中性粒细胞的髓过氧化物酶转化为次氯酸。自由基不仅损伤正常质膜,营养不良的膜对自由基介导的损伤更易感,因此干扰中性粒细胞向肌肉的外渗或激活可能对 DMD 有益。
T 细胞
T 细胞代表适应性免疫的关键一臂,调节免疫耐受与激活。在暴露于特异性抗原后,T 细胞可被激活并分化为效应谱系,包括 CTL、Th1、Th2、Th17、γδ 或 Treg 效应/记忆 T 细胞,各自具有不同的能力:迁移并驻留于中枢或外周组织、介导 T 细胞效应功能、影响组织破坏、修复和纤维化过程。在某些情况下,抗原暴露会选择性诱导一种或多种 T 效应功能(如细胞毒性、TNF 或 γ-IFN 产生);而在另一些情况下,可通过诱导凋亡、无能(非应答状态)或耗竭(涉及激活受体的丧失和抑制性受体的上调)使 T 细胞失活或耐受。决定耐受还是激活的因素包括 T 细胞的成熟阶段、参与抗原提呈的细胞类型,以及局部 T 细胞微环境中的细胞因子和其他免疫介质。在胸腺微环境中充分表达的自抗原可通过阴性选择导致自身反应性 T 细胞前体的删除,或通过产生监测和抑制针对这些自抗原的免疫反应的 nTreg(自然 Treg)实现;逃脱这些中枢耐受诱导的 T 细胞则随时可被专业抗原提呈细胞激活,或通过若干外周耐受机制被致耐。局部细胞因子环境和抗原提呈方式帮助这些细胞向具有适当激活或致耐活性的效应细胞分化。T 效应分化曾被认为代表终末分化的承诺,现已明确这一过程更具可塑性,一些效应 T 细胞保留被重编程为替代 T 谱系或具备"混合"效应功能的中间亚群表型的能力。一个显著的例子是自身反应性 Th1 细胞在诱导 foxp3 和/或局部 TGF-β 与视黄酸作用下,能被重编程为免疫抑制性的 iTreg(诱导性 Treg);一些 iTreg 保留产生促炎 γ-IFN 的能力,同时也介导抑制功能。
在坏死开始时,CD4+ 和 CD8+ T 细胞都出现于营养不良肌肉中,短期去除任一亚型对疾病特征均有益。mdx 小鼠与缺乏 T 细胞的裸鼠背景杂交,膈肌纤维化减轻,提示 T 细胞参与此过程。mdx 浸润中许多 T 细胞代表 CD4+CD8α+ 双阳性或 CD4−CD8− 双阴性亚群,已知产生于记忆和耗竭 T 细胞亚群。此外,T 调节细胞和 NKT 细胞在 mdx 和人类中也以低数量存在。目前尚不清楚这些 T 细胞针对哪些自抗原。肌肉完整性丧失、炎症以及随之而来的 MHC I 类分子在肌纤维上的上调,可能促使自抗原以超阈值水平提呈,并在通常于非营养不良肌肉中不表达的 APC 和共刺激背景下完成。已观察到 DMD 和 mdx 肌肉中 T 细胞表达有限且保守的 TCR Vα 和 Vβ 元素使用谱的克隆扩增,提示抗原驱动的扩增或具有有限 TCR 库的 NKT 样调节群体的发育。
特别值得关注的是 revertant 纤维可能刺激 dystrophin 反应性 T 细胞的潜在激活。实际上,在大多数病例中,营养不良肌肉含有通过代偿性突变或外显子跳跃产生被拯救 dystrophin 的 revertant 纤维。虽然这些纤维过于稀少,无法挽救肌肉功能,但它们可能刺激或致耐局部 dystrophin 反应性 T 细胞。多项研究清楚表明 dystrophin 反应性 T 细胞并未在阴性选择中全部删除;功能性 dystrophin 反应性 CD8 CTL 可在不同实验背景下被激活、刺激分化为不同效应细胞或被致耐,这取决于 dystrophin 提呈的背景及所分析的物种。rAAV 载体已成为 dystrophin 基因治疗的首选,因为它们免疫刺激性较低,在某些情况下可具有致耐性,诱导 Treg 细胞或无能化的 T 细胞、使其走向凋亡、仅表达所需效应功能子集或以其他方式失能。使用 rAAV 载体时,微小 dystrophin 能在小鼠中稳定表达并拯救营养不良表型;但同样的 rAAV DMD 载体在犬中具有免疫刺激性,导致 T 细胞阻止 dystrophin 转基因的持续表达。在犬中,短暂免疫抑制足以防止衣壳和 dystrophin 排斥反应,因在这种情形下 dystrophin 阳性纤维的稳定表达得以维持。
DMD 男童的近期基因治疗研究已开始表征人类的 dystrophin 反应性 T 细胞,并强烈需要更好地理解 dystrophin 反应性 T 细胞在营养不良肌肉背景下的调控和贡献。在接受 rAAV 载体介导的肌内微小 dystrophin 给药的 DMD 患者中,6 例受试者中有 4 例在其外周血淋巴细胞(PBL)中产生了 dystrophin 反应性 CD4 和/或 CD8 IFN-γ 产生性 T 细胞。正如预期,其中一些 T 细胞针对微小 dystrophin 特有的新序列或微小基因中存在但在 DMD 患者中缺失的表位;另一些则针对也在受试者 revertant 纤维中表达的表位。在一例中,这些细胞在载体给药前已存在,给药后迅速扩增,与 T 细胞被内源性 revertant 致敏并可能在整个 DMD 发病过程中消除被拯救的 revertant 纤维的可能性一致。Th1 细胞产生的 IFN-γ 可能促进抗原提呈、巨噬细胞的溶酶体活性、促进淋巴细胞迁移或激活 iNOS——每一项都可能促进 dystrophin 阳性细胞的清除。然而,PBL 中发现的 dystrophin 反应性 T 细胞能否向肌肉迁移、存活并损伤 dystrophin 阳性纤维,仍有待观察。一旦 T 细胞进入肌肉,在高 TGF-β 水平和/或其他因子作用下,它们可能被重编程通过转化为 iTreg 或诱导凋亡实现对 dystrophin 的耐受;另一方面,局部 TGF-β 也可能辅助自身反应性 Th17 细胞的发育,这在营养不良背景中尚未被考虑。虽然 T 细胞靶向 dystrophin 阳性细胞或许可解释该 DMD 基因治疗试验中 dystrophin 表达缺乏稳健性和持续性的现象,但低表达水平也可能反映载体/转基因给药和表达的非最佳水平。
在 DMD 外显子跳跃策略的背景下,一项关于 2-O-甲基修饰的 RNA 可作为 TLR7 拮抗剂的报告值得注意。这些发现提示 2-O-甲基反义寡核苷酸(AON)外显子跳跃策略可能通过 TLR7 减弱炎症和自身免疫——TLR7 在人营养不良肌肉的浸润单核细胞和肌纤维上显著上调——这或许可解释 2-O-甲基 AON 介导的 DMD 外显子跳跃缺乏限制性免疫反应的现象。然而,在最近的外显子跳跃和读通框架研究中,尚未实验性地考虑 T 细胞对 dystrophin 的反应性。
炎症与纤维化在 DMD 中的关系
纤维化是 DMD 肌肉中突出且进行性的特征,最终在骨骼肌和心肌中诱发显著的功能损害。利用 mdx 小鼠的多项研究已证实炎症与纤维化之间存在关联。参与营养不良肌肉纤维化过程的一个关键候选免疫调节剂是 TGF-β。该分子在 mdx 和 DMD 肌肉中表达上调,且 TGF-β 及其受体的高表达与疾病更纤维化的阶段相关。TGF-β 浓度与给定模型或肌肉中的纤维化水平并非完全相关,但总体而言,TGF-β 减少通常伴随/导致纤维化减少。这种并非完全紧密的相关性提示,其他促纤维化过程(如通过结合蛋白调节 TGF-β 可用性或精氨酸酶代谢的改变)同时发生。营养不良肌肉中 TGF-β 的来源尚不清楚,但白细胞很可能是该细胞因子的重要来源。TGF-β 可通过增加成纤维细胞分泌胶原或通过将成肌细胞转化为成纤维细胞影响组织纤维化发生,提示它在纤维化过程中既发挥直接又发挥间接作用。TGF-β 促进纤维化并不是它对疾病产生负面影响的唯一方式;它还可以阻断终末生肌分化,从而损害肌肉修复。因此,在 DMD 中靶向 TGF-β 可能带来不止一种有益效应。
McNally 及其同事的一项近期研究为 TGF-β 在促进纤维化中的重要作用提供了有力支持:他们证明潜在的 TGF-β 结合蛋白 4(LTBP4)是营养不良表型的重要修饰因子。LTBP4 与 TGF-β 结合并使其保持潜伏状态。LTBP4 被未知蛋白酶的蛋白水解切割会释放 TGF-β,使其能够结合受体并激活下游信号传导。LTBP4 的活性受其序列中 12 个氨基酸插入存在的修饰,这种插入会阻止其切割,从而减少可用 TGF-β。含有 LTBP4 中 12 个氨基酸插入的营养不良小鼠品系(如 129 背景)比不含该插入序列的品系(D2 背景)膜损伤和纤维化程度更轻。这些研究首次在无偏筛选中证明 TGF-β 是营养不良表型的强效修饰因子。
影响 DMD 的炎症介质
既往多项研究已证明,在 mdx 小鼠体内减少免疫细胞亚群的实验干预可减少肌肉病理,包括去除 CD8+ T 细胞、CD4+ T 细胞、巨噬细胞、TNF 和嗜酸性粒细胞。这些研究支持免疫系统参与 DMD 进展。更近期,调控这些不同细胞类型外渗、迁移、活化和存活的免疫介质开始被阐明。下一节将讨论这些细胞类型或介质在上述过程中的作用。
骨桥蛋白(Osteopontin)
骨桥蛋白(OPN)是一种酸性磷蛋白,在 DMD 活检组织和 mdx 肌肉中高度表达。营养不良肌肉中 OPN 的主要来源是免疫细胞,虽然肌原性细胞也表达它。OPN 可被分泌,也可被保留在细胞内并与 CD44 复合物相关联。分泌的 OPN 与整合素和 CD44 以及包括纤连蛋白和胶原在内的多种细胞外基质分子结合。OPN 还被证明调控多种免疫细胞类型的外渗、表型、激活和存活。最近证明在 mdx 背景下敲除 OPN 会导致营养不良表型减轻,表现为力量增加和纤维化减少。与在其他系统中的作用一致,OPN 是一种免疫调节剂,靶向它会导致中性粒细胞和 NKT 细胞减少以及 TGF-β 减少。因此,在 mdx 小鼠中,OPN 至少部分通过其对炎症的影响促进营养不良和纤维化。
关于人类中 OPN 也促进 DMD 进展,有初步证据。研究人员在美国和意大利研究了两个患者队列,并在 OPN 基因(spp1)启动子中鉴定出与更严重进展相关的单核苷酸多态性(SNP)。在 -66 位点具有"GG"或"GT"的患者进展到完全依赖轮椅的时间早于该位点为"TT"的患者。伴随着更早丧失行走能力的是 OPN 表达增加 2.7 倍。因此,OPN 中的这个 SNP 似乎是 DMD 表型的首个遗传修饰因子,为 OPN 作为治疗靶点提供了有力支持。
OPN 可调节炎症的不同方面,包括免疫细胞迁移,其作用既可通过与 CD44 整合素的直接结合,也可通过调节基质金属蛋白酶(MMP)间接实现。OPN 刺激 MMP 表达,而 MMP 通过蛋白水解切割对 OPN 进行反向调节。MMP9 切割产生的 OPN 片段可通过与 CD44 或整合素结合影响细胞迁移。另一方面,OPN 通过 NF-κB 调节 MMP9 表达。在 mdx 肌肉中 MMP2 和 MMP9 均大幅上调,而在 mdx 中敲除 MMP9 或广泛抑制 MMP 会改善疾病。考虑到 OPN 与 MMP9 之间的相互调节关系,二者同时进行药理学抑制可能具有协同和有益的治疗效果。
NF-κB
核因子κB(NF-κB)信号由广泛参与炎症调控的转录因子家族组成。它们也响应某些炎症介质,尤其是 TNF,或活性氧(ROS)。经典通路包括 P65/p50 二聚化,在抑制因子 I-κB 被靶向降解后被激活。在 DMD 患者和 mdx 小鼠的活检组织中,经典 NF-κB 通路大幅上调,其上调与疾病症状的出现相关。NF-κB 抑制剂,如吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和 NEMO 结合肽,可减轻 mdx 小鼠的营养不良症状。目前尚不清楚 NF-κB 的高表达是否是营养不良肌肉炎症的主要驱动因素,抑或炎症环境(如高 TNF 和 IL-1)驱动 NF-κB 激活;但明确的是,肌肉源性和免疫细胞源性的 NF-κB 都参与促进 mdx 小鼠的疾病进展。有趣的是,NF-κB 信号的高表达可在不存在任何类型营养不良的情况下触发肌肉萎缩,可能由于其维持卫星细胞于增殖状态,阻止肌肉修复所需的融合。因此,靶向 NF-κB 的有益效应既涉及其促进炎症的作用,也涉及其抑制肌肉修复的作用。需要长期研究以充分评估其对肌肉纤维化和年龄相关功能的影响。
肢带型肌营养不良 2B 型——dysferlin 病的免疫发病机制
dysferlin 基因的遗传缺陷导致肢带型肌营养不良(LGMD2B)和 Miyoshi 型远端肌营养不良。肌无力进展缓慢,行走能力丧失通常发生在第四个十年。dysferlin 是含有 C2 结构域的 230 kDa 跨膜蛋白,主要位于质膜的细胞内面,在膜囊泡运输和膜修复中发挥作用。来自 dysferlin 缺陷患者的肌肉样本在电子显微镜下分析显示多种超微结构膜缺陷,包括质膜撕裂和肌膜下囊泡与空泡的积累。
dysferlin 缺陷中的炎症
dysferlin 缺陷肌肉中的炎症浸润已被很好地描述。dysferlin 缺陷患者肌肉活检中显著的单核细胞浸润常常导致误诊为多发性肌炎;然而 dysferlin 缺陷中的肌肉炎症与发生在其他炎症性肌肉病中的情况存在若干差异。一般而言,dysferlin 缺陷肌肉活检显示的巨噬细胞多于多发性肌炎患者活检中的巨噬细胞,而 CD8+ T 细胞则较少。dysferlin 缺陷肌肉中的肌内膜和血管周围浸润由 CD4+ T 细胞、巨噬细胞和 CD8+ T 细胞组成,而非坏死的 dysferlin 缺陷纤维似乎没有任何类型的浸润。因此浸润的性质似乎与多发性肌炎等其他炎症性肌病不同,在多发性肌炎中,占主导的 T 细胞亚群是浸润于原本正常肌纤维的 CD8+ T 细胞。dysferlin 缺陷中的肌肉炎症也与 DMD 不同——DMD 中巨噬细胞和 T 细胞主要存在于坏死纤维中。
骨骼肌炎症在 dysferlin 病的自发性小鼠模型(SJL/J,即 SJL-Dysf)中也显著。dysferlin 缺陷和对照肌肉活检的冰冻切片染色显示,浸润的单核细胞和树突状细胞(但非肌纤维)高水平表达 HLA-A、-B、-C、HLA-DR 和 CD86 抗原。HLA-A、-B、-C 和 HLA-DR 抗原在毛细血管内皮细胞上以及与纤维吞噬和再生相关的部位也呈低水平表达;它们在非坏死纤维中的偶发表达可能代表正在发生的坏死的标志。因此 dysferlin 肌肉活检的 HLA-A、-B、-C 染色模式与炎症性肌病不同——炎症性肌病中肌纤维高表达 MHC I 类抗原。同样,SJL/J 小鼠的冰冻肌肉切片对巨噬细胞激活和树突状细胞标志物的染色显示,浸润的单核细胞表达巨噬细胞单核细胞标志物(MoMa-2)和激活标志物 CD11c 和 ICAM-1。这些数据提示 dysferlin 缺陷患者和 SJL/J 小鼠肌肉组织中的巨噬细胞和单核细胞具有激活表型。Dysferlin 通常在 CD14+ 单核细胞中表达,LGMD2B 和 Miyoshi 肌病中 CD14+ 细胞显示 dysferlin 缺陷。近期研究显示 dysferlin 缺陷单核细胞吞噬活性增加;在 J774 巨噬细胞系中通过 siRNA 介导的 dysferlin 表达抑制与显著增强的吞噬作用相关。这些数据表明 dysferlin 缺陷肌肉中的轻度肌纤维损伤会刺激炎症级联反应,可能启动、加重并持续潜在的肌纤维特异性营养不良过程。
促炎分子的外泌和分泌
质膜修复由伤口处钙离子内流启动,导致损伤部位钙水平增加。这种内流进而触发囊泡积累,囊泡通过可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)复合物和突触体相关蛋白(SNAP)家族蛋白彼此融合,然后与质膜融合,从而封闭受伤的质膜。在 LGMD2B 活检中,超过 50% 的健康外观肌纤维显示小的肌膜下空泡,其中一些正在进行外泌。对 LGMD2B 肌肉活检中炎症通路的查询显示,versican 和 tenascin 等促炎分子以及肌肉中通常不观察到的囊泡运输通路蛋白(synaptotagmin 样蛋白 Slp2a/SYTL2 和小 GTPase Rab27A)表达增加。
近期研究提示 thrombospondin 1 在 dysferlin 缺陷肌纤维和巨噬细胞中显著增加,提示 TSP-1 等内源性趋化触发因素在维持肌肉炎症中具有作用。已知炎性小体组分(pro-IL-1β 和 pro-caspase-1)共定位于溶酶体,直到接受外泌诱导刺激;在缺乏此类刺激的情况下,这些前体分子可能经历溶酶体降解。pro-IL-1β 和 pro-caspase-1 的共定位以及 ATP 刺激后溶酶体中成熟 IL-1β 的分泌提示活性 caspase-1 切割 pro-IL-1β 并促进成熟 IL-1β 的分泌。细胞外 ATP 与 P2X7 受体的结合促进溶酶体外泌和 IL-1β 分泌。实际上近期实验证明,正常原代骨骼肌细胞能够在脂多糖和 P2X7 受体激动剂苄基化 ATP 联合处理下分泌 IL-1β。这些数据表明骨骼肌是炎症蛋白的主动贡献者,干扰肌肉源和巨噬细胞源促炎分子的策略可能对 LGMD2B 患者具有治疗价值。
关于突变 dysferlin 积累与 dysferlin 病炎症之间关系的研究非常少。一项近期研究显示,突变型而非野生型 dysferlin 在内质网(ER)中自发聚集,并诱导未折叠蛋白反应和 LC3(自噬体形成标志物)的转化。这些数据加上 dysferlin 在小鼠骨骼肌过表达导致管状聚集体积累和 ER 应激反应的近期数据,提示突变 dysferlin 聚集可能激活内质网超载反应(EOR)。已知 EOR 触发 NF-κB 激活和炎症,尤其在多种炎症性肌肉病中。此外,dysferlin 突变患者肌纤维中肌膜和间质淀粉样沉积的存在提示 LGMD2B 与继发性淀粉样变相关,而 dysferlin 蛋白是这些淀粉样沉积的组成成分,促炎介质如 IL-1 诱导 β-淀粉样相关肌肉变性。
补体在疾病发病机制中的作用
初始电子显微镜研究显示在分离的非坏死肌纤维表面存在膜攻击复合物(MAC),提示补体激活在疾病进展中具有作用。对补体介导损伤的易感性部分归因于 dysferlin 缺陷肌纤维缺乏补体抑制因子 CD55/DAF。在 dysferlin 和中枢补体成分 C3 均缺乏的小鼠中进行的近期基因实验证实,补体激活的缺失确实导致小鼠模型中肌肉疾病的减轻。
dysferlin 缺陷中肌纤维损伤和炎症的模型
尽管生来就具有 dysferlin 基因的遗传缺陷,LGMD2B 患者在其青少年晚期前表观正常。至今,启动并延续疾病的因素尚不甚了解。由于 dysferlin 在骨骼肌和巨噬细胞中均有表达,该表型很可能是两种细胞类型异常的综合结果。我们推测在 LGMD2B 中,囊泡运输增加和质膜修复缺陷导致 ATP 和其他内源性危险/警报信号(如 HMGB1 和 S100 蛋白)释放。这些分子进而与细胞受体(toll 样受体、P2X7 受体)结合,激活炎性小体和 NF-κB 通路。已知的细胞外 ATP 和补体成分也会被激活,在质膜上诱导额外的孔,导致钙内流,可能激活钙依赖性蛋白酶。此外,该疾病中 NF-κB 的激活不仅可能诱导肌纤维消耗,还可能抑制肌源性生成。所有这些下游过程除炎症和纤维化外,还引起显著的肌纤维损伤和功能障碍。
虽然很少有研究评估炎症对遗传性肌营养不良发病机制的贡献,但从 DMD 和 LGMD2B 的研究工作中可以明确,这些肌肉病中肌肉炎症的机制差异显著。因此,每种营养不良都必须使用合适的遗传模型和适当的人活检组织进行研究。此外,由于病毒载体递送基因、外显子跳跃恢复阅读框架和终止密码子读通正在成为治疗现实,大量工作需要评估 T 细胞在排斥免疫系统而言为新表位方面的作用。因此,即使在成功基因治疗的时代,免疫治疗也需要被开发出来,既减少瘢痕组织形成和其他疾病特征,又确保新递送基因的成功恢复。
本章个人批注
这一章是肌营养不良领域里少有的把"免疫"和"遗传"两条线拧在一起的章节,作者群(UCLA + Children's National Medical Center)恰好代表了神经-免疫-基因治疗三栖视角。最让我警醒的细节是关于 dystrophin 蛋白作为移植排斥抗原的发现(Ohtsuka 1998),以及 Mendell 2010 临床试验中 4/6 患者产生 dystrophin 反应性 IFN-γ+ T 细胞——这两件事彻底改变了基因治疗界对"成功转导 = 治疗终点"的简单假设。它们提示任何让 dystrophin 在 DMD 患者中"重新出现"的策略(包括外显子跳跃、读通框架、HAC、iPS 分化)都必然面对一群在胸腺中未被删除、对外来 dystrophin 序列有潜在反应能力的 T 细胞;而 revertant 纤维作为"内源性预致敏源"的概念,把"自然发生的少量 dystrophin 表达"从积极(任何拯救都好)重新定性为消极(喂养未来的排斥反应)。这与 Ch77 提到的 mesoangioblast 异体移植需要 HLA 匹配、Ch76 提到 rAAV 临床试验需要短暂免疫抑制的临床策略互为印证——三章其实在讲一个共同主题:在 DMD 治疗里,免疫学不再是"附带考虑",而是治疗成败的决定性变量。
另一个我特别想标注的概念是 LTBP4 的"非偏倚筛选"价值。McNally 团队不是从"先验假说 TGF-β 是关键的纤维化因子"出发,而是从 129 背景 vs D2 背景的表型差异出发,锁定到 LTBP4 12 氨基酸插入这个自然变异,反过来证明 TGF-β 是 dystrophic 表型的强效修饰因子。这种"基因背景 → 表型 → 通路"的研究路径,和前面几章中常见的"已知通路 → 验证 → 临床"形成对比。它也呼应了 Ch70 ECM-myopathies 中 Bönnemann-Voermans 提到的 fibrillin-1 调控 TGF-β 可用性、Ch71 Marfan 中 Cohn-Dietz 的 losartan 抗 TGF-β 治疗——把 TGF-β 轴定位为整个肌营养不良治疗的核心节点之一。
在 dysferlin 病那一半,作者们提出了一个清晰的"双细胞模型":dysferlin 既在肌纤维又在 CD14+ 单核细胞中表达,缺陷的巨噬细胞吞噬活性增强,缺陷的肌纤维膜修复失败——两者协同造成"肌纤维损伤 → 内源性危险信号释放 → 巨噬细胞/补体二次攻击"的正反馈环路。这与 DMD 主要由"肌膜结构性脆弱 → 反复撕裂"驱动的模型不同:LGMD2B 更像是"原发膜修复失败"+"免疫细胞内在异常"的双重打击。这种"双细胞模型"是营养不良免疫学里较新的概念框架,也提示未来的免疫治疗可能需要分疾病设计——DMD 的策略集中在抗炎 + 抗纤维化,LGMD2B 可能还要考虑调节单核细胞/巨噬细胞本身的功能。
最后我想标注一个章节里的明显不对称:DMD 部分占了 70% 篇幅,LGBM2B 部分约 30%——这反映了两种病的研究深度差异,而不是它们的临床相对重要性。实际上 LGMD2B 在所有肌营养不良中相对罕见,但其作为"非 dystrophin 缺陷营养不良中免疫学研究的领头羊"地位非常清晰(全文唯一一段明确提出"双细胞模型"的就是这一段)。作者也在 CONCLUSION 部分坦承:"each dystrophy must be investigated using suitable genetic models and appropriate human biopsies"——这一句是整章最值得读者记住的方法论提示。
与上下章的衔接(一段话)
本章向上承接 Ch77(Vallese/Yada/Butler-Browne/Mouly 细胞疗法),向下衔接 Ch79(myostatin 调控)以及后续的 Ch80(IGF-1)与 Ch81(治疗新靶点)。Ch77 集中讨论了基于细胞的 dystrophin 替代策略(成肌细胞自体移植、间皮细胞、肌内皮细胞、CD133+、iPS-HAC、SMALD、PIC、hMAD 等),但本章从 Ch77 的"细胞被注入 → dystrophin 重新表达 → 期望治愈"这一乐观叙事中抽出一支冷流:在 DMD 患者体内,新出现的 dystrophin 蛋白(无论是来自细胞移植、外显子跳跃、读通还是 rAAV)都会被一组未在胸腺中被删除的 dystrophin 反应性 T 细胞识别,IFN-γ+ CD4 和 CD8 反应已在 4/6 患者 PBL 中被检测到,且 revertant 纤维作为内源性预致敏源会强化这种反应——这意味着 Ch77 列出的几乎所有"细胞 + 基因"组合策略在临床上都需要伴随免疫调节(短暂免疫抑制、致耐性载体、Treg 诱导)。同时本章在概念上与 Ch76(Arnett/Ramos/Chamberlain 病毒载体基因治疗)形成姊妹篇:Ch76 讲载体设计与转导效率,本章讲宿主免疫如何决定临床结局,两者合在一起构成"基因治疗的工程端 vs 免疫端"的完整图景。向下,本章关于"肌纤维损伤 → 危险信号 → NF-κB/炎性小体 → M1/M2 极化 → 纤维化"的整体框架,与 Ch79(myostatin 作为 TGF-β 超家族成员、对肌肉量与纤维化同时调控)和 Ch80(IGF-1 作为 M2 巨噬细胞分泌的修复因子、抗炎抗纤维化作用)直接呼应——三个生长因子轴(myostatin、IGF-1、TGF-β)加上免疫细胞,构成营养不良肌肉再生失败的核心四元网络,也正好是 Ch81"新治疗靶点"章节将要展开的概念地图。