第 76 章：骨骼肌疾病的病毒载体基因治疗（Gene Therapy of Skeletal Muscle Disorders Using Viral Vectors）

引言

许多遗传性疾病在骨骼肌中表现，对受累个体往往带来毁灭性后果。因此骨骼肌是基因治疗的重要靶标，但也面临诸多挑战。横纹肌体积大、分布广泛，对基因构建物的递送构成难以克服的障碍，但最近的研究表明，源自病毒的可递送载体能够促进系统性基因转移。此外，骨骼肌的再生特性也给矫正性转基因的持久性带来独特挑战。尽管如此，已有若干以骨骼肌为靶标的病毒载体介导治疗策略推进到临床前和临床试验阶段，使人们有理由相信它们可能成为多种肌病的治疗方法。

腺病毒载体

早期针对骨骼肌疾病的基因治疗尝试集中于源自腺病毒（Ad）的载体。腺病毒是一种非包膜的双链 DNA 病毒，基因组大小约 36 kb。已鉴定的人类血清型超过 50 种，但绝大多数重组腺病毒载体以血清型 2 和 5 为基础。腺病毒可转导多种细胞类型，但对呼吸道、眼部和胃肠上皮具有强烈嗜性。此外，血管内给药后肝脏被大量靶向，这一特性已被用于治疗犬和小鼠的甲型与乙型血友病模型。然而腺病毒对成熟骨骼肌的嗜性有限。包绕肌纤维的细胞外基质和基底膜的组成与结构构成了大型病毒载体扩散的障碍；此外，成熟肌纤维上腺病毒入胞所用的主要细胞表面受体（CAR）表达下降，阻碍了腺病毒对骨骼肌的转导。尽管存在这些屏障，宿主免疫反应仍是腺病毒介导基因治疗最大的障碍。第一代腺病毒缺失 E1a 和 E1b 基因，使其复制能力严重受损；但在哺乳动物细胞中的残余复制仍可导致病毒基因低水平表达，从而引发增强的免疫反应并限制了转基因表达的持续时间。这一情况随后通过开发"去内脏"（gutted）腺病毒载体而得到改善——后者仅保留病毒的反向末端重复（ITR）和包装信号。但去内脏腺病毒载体需通过辅助病毒共感染以反式提供病毒蛋白，载体中残留的辅助病毒污染构成了大规模腺病毒制剂临床应用的障碍。研究观察到，使用肌肉特异性启动子可显著限制转基因表达于肌肉，并通过阻止免疫效应细胞的转导来防止免疫反应针对腺病毒转导的细胞。

慢病毒载体

源自逆转录病毒科的整合性慢病毒也已被用于基因治疗策略。慢病毒是包膜型单链 RNA 病毒，直径约 100 nm。工程化的慢病毒载体保留最低限度的包装和整合信号，除此之外不含可能导致复制 competent 病毒产生的病毒基因。不幸的是，通过肌内注射或系统性注射在成体骨骼肌中只能获得低至中等水平的转导。然而，新生骨骼肌可被更高效地转导，子宫内注射可在成熟纤维和卫星细胞中实现广泛的转基因表达。作为整合性载体，慢病毒优先整合入宿主基因组中转录活性高的位点。整合虽存在插入致突变的风险，但也具有提供永久矫正的干细胞池的潜力，可在正常肌肉更新过程中补充丢失的肌纤维。在这方面，慢病毒已被证明可在 Duchenne 肌营养不良（DMD）的小鼠模型中，将经过修饰的 dystrophin 构件高效转导至肌肉祖细胞之后再进行移植。因此，干细胞的体外修饰仍是慢病毒介导治疗的重要方面。

腺相关病毒载体

AAV 载体是肌病基因治疗策略中非常有前途的工具。野生型病毒具有 4.7 kb 的单链 DNA 基因组，是细小病毒科成员。AAV 最初是作为腺病毒制剂中的污染物被发现的，没有辅助病毒（如腺病毒或疱疹病毒）的协助就无法在体内复制。野生型病毒无已知致病性，是 AAV 载体的一个吸引人的安全特性。AAV 可转导多种组织，并且引发宿主 T 细胞免疫反应的能力显著低于腺病毒载体。使用 rAAV 载体进行肌肉基因治疗的广泛兴趣来源于两点观察：这些载体可在被转导的横纹肌中表达数年，以及它们可以通过血管系统递送至全身肌肉。rAAV 载体主要的限制是约 5 kb 的有限克隆容量，限制了较大基因盒的递送。不幸的是，通过突变和血清型嵌合改造 AAV 衣壳的尝试并未显著扩大其包装容量。

许多 AAV 血清型对不同组织显示出独特的嗜性谱。rAAV 6、8 和 9 血清型在小鼠系统性递送后已表现出对横纹肌的广泛转导。迄今最全面的横纹肌转导血清型比较出自 Rabinowitz 小组的两项研究：rAAV 1、6、7、8 和 9 血清型经尾静脉注射后均能高效转导心肌和骨骼肌；其中 rAAV 8 和 rAAV 9 在肌肉和非肌肉组织中均观察到最为普遍的转导；rAAV 7 和 rAAV 9 转导动力学最快，是最先达到表达平台期的血清型。在心肌基因递送实验中，rAAV 6 始终显示出所有血清型中最高的表达水平，并且相较 rAAV 8 和 9 更不易发生非肌肉转导。

虽然 rAAV 载体能够整合入宿主基因组，但整合频率很低；rAAV 基因组主要以游离 DNA 形式存在于细胞中。然而，rAAV 的系统性或血管递送可导致广泛组织的转导，必须在载体设计中纳入适当的组织特异性调控元件。此外，人类对野生型 AAV 的免疫性是 rAAV 介导治疗的重要障碍。成年人口中相当大比例对多种 AAV 血清型存在预先免疫，这些因素必须被仔细考虑，并可能使需要再次给药的治疗设计变得复杂。

肌营养不良的基因治疗

肌营养不良症是一组异质性的遗传性疾病，其特征是骨骼肌且常常包括心肌的功能受损和萎缩。其中 DMD 是最常见的，几乎完全由 dystrophin 基因中的无效等位基因突变所致。Becker 肌营养不良（BMD）是 DMD 的一种较温和形式，由允许表达减少量或部分功能性 dystrophin 蛋白的突变所致。DMD 是基因治疗的主要靶点，研究者在开发安全有效的载体递送方法上投入了大量努力。Dystrophin cDNA 的庞大体积（约 13.9 kb）给基因递送策略带来独特挑战，因其超出 rAAV 和慢病毒载体的携带容量。然而，某些截短型 dystrophin 仍可保留较高功能。在病情较轻的 BMD 中，dystrophin 基因中的缺失突变可导致表达截短但部分功能性的 dystrophin。这一观察促使研究者开发用于治疗的微/小型 dystrophin，并已通过 rAAV 介导的基因递送在小鼠中实现全身性肌营养不良表型的改善。工程化的微 dystrophin 构建物保留了 dystrophin 功能所必需的结构域，同时又足够小以能被包装入 rAAV 衣壳。

创建一个可被包装入 rAAV 基因组的新型截短型 dystrophin 基因需要仔细选择纳入构建物的结构域和亚结构域。为保留机械功能和蛋白稳定性，微 dystrophin 必须同时结合 γ-肌动蛋白丝和 β-肌营养不良蛋白聚糖。Dystrophin 缺失的 mdx 小鼠是研究 DMD 的成熟啮齿动物模型，已被用于评估多种截短型 dystrophin 构建物的功能。评价构建物质量的检测通常包括定量分析中央核纤维百分比（经历再生的肌纤维的标志）、肌膜完整性、对肌纤维坏死的保护以及与野生型和 mdx 小鼠相比的相关力学性质。在转基因 mdx 小鼠中表达具有 C 端结构域缺失且 hinge 2 直接连接 spectrin 样重复 24 的微 dystrophin（ΔR4-23,ΔCT）的小鼠未显示出肌营养不良组织病理学迹象，且中央核纤维频率接近正常。与未处理对照相比，其特异力产生增加，但仍低于野生型水平。虽然更大的小型 dystrophin 可获得更强的肌肉功能，但这些较大的克隆只能通过 rAAV 递送，方法是或将基因拆分入两个重叠的 rAAV 载体使其在体内重组，或使用具有更大携带容量的病毒（即腺病毒或慢病毒）。

大动物模型中横纹肌的 rAAV 介导转导

在小鼠中采用 rAAV 载体系统性递送基因至横纹肌的令人鼓舞的结果促使一系列大动物可行性研究的开展。在犬中进行的早期基因转移研究采用 rAAV 2 隔离后肢血管内递送后实现了持续三年以上的强表达。然而随后的研究使用 AAV 2、6、8 和 9 血清型时，由于针对载体的细胞免疫反应，难以获得类似成功。转基因产物和 rAAV 衣壳蛋白均被提出可引起炎症并清除犬肌肉中的转导细胞。但也发现暂时性免疫抑制可规避细胞免疫反应并允许犬骨骼肌中转基因的长期表达。rAAV 6 在免疫抑制犬中于 2 月龄时给药可成功实现横纹肌的广泛转导。

将 rAAV 1-CMV-红细胞生成素肌内注射入恒河猴产生了 6 年以上的强健转基因表达。免疫抑制是否将成为 rAAV 介导基因治疗中的必需环节目前尚不明确，也未就最佳的免疫抑制方案达成共识。一个研究小组发现，由 rAAV 2 递送至猴的转基因产物的耐受性可能受免疫抑制药物影响。另一项研究比较了 rAAV 1 与 rAAV 8 载体在猴中的安全性，肌内和血管内注射均未引起细胞免疫反应。与这些发现一致的是，另一研究小组报告了在无免疫调节情况下成功转导 rAAV 8-CMV-eGFP。各研究间的差异可能反映了剂量和载体生产方法的不同，进一步的研究对于阐明 rAAV 介导的免疫反应在大动物和人类中的性质是必要的。

调控肌肉特异性表达

在转基因小鼠中超生理水平表达全长或截短型 dystrophin 并未与有害效应相关。然而，表达这些蛋白的转基因小鼠模型主要使用非普遍活性的启动子生成，将转基因表达限制在横纹肌。相反，病毒介导的 dystrophin 替代研究通常使用具有强普遍性病毒启动子（如劳氏肉瘤病毒和巨细胞病毒启动子及增强子）的载体。这引发了对外源表达经载体递送至非肌肉组织后产生脱靶效应的担忧。实现组织特异性转基因表达最常用的机制是使用肌肉特异性启动子和增强子。源自肌肉肌酸激酶（MCK）基因的调控元件仅在分化的成肌细胞中具有活性，并已在腺病毒和多种 rAAV 血清型递送后展示出在骨骼肌和心肌中的限制性表达。包含 α-肌球蛋白重链和 M-肌酸激酶基因的增强子和启动子区域的杂合启动子表现出类似的表达模式，并已历经数代改良。合成启动子 C5-12 也已在 AAV 1 和慢病毒载体中展示组织特异性表达。这些发现表明利用组织特异性调控元件降低载体递送至非肌肉组织的脱靶效应风险是可行的。

rAAV 载体用于 DMD 的临床试验

数个实验室目前正计划在人体临床试验中测试 rAAV 载体用于 DMD 的治疗。这些初步试验设计旨在以相对低剂量确定安全性和有效性。一项研究已经完成，其中 6 名 DMD 男孩接受 rAAV 2.5-CMV-微 dystrophin 肌内注射而未使用免疫抑制。在任何患者中均未观察到转基因产物的表达。但在部分肌肉活检中检测到了载体基因组。导致未能实现表达的因素尚不清楚，但作者在 6 名患者中的 2 名中检测到针对 dystrophin 的 T 细胞介导免疫反应。如果这种 T 细胞介导免疫反应确实导致了 dystrophin 表达的丧失，那么 DMD 的基因治疗方法将需要被修改以防止免疫排斥受治肌肉。值得注意的是 dystrophin 免疫性是否促成表达的丧失仍不清楚，因为大多数患者显示恢复纤维（revertant fiber）表达 dystrophin 而无有害后果，且 rAAV 试验中 6 名受治患者之一在临床试验开始前已对恢复纤维 dystrophin 具有 T 细胞反应性。仍然，如果 dystrophin 免疫原性被证明是基因治疗策略的限制因素，那么至少可以考虑三种方法来防止表达丧失。第一，dystrophin 基因递送可在长期免疫抑制下进行。第二，基因治疗载体可纳入肌肉特异性启动子以防止免疫效应细胞中的抗原呈递。第三，可通过递送非免疫原性的替代转基因（如微 utrophin）进行基因治疗。

结论

针对肌病的基因治疗开发工作利用了多种不同的载体系统、基因调控元件和转基因。目前，唯一显示出对骨骼肌和心肌进行全身基因递送显著潜力的病毒载体系统是源自 AAV 的载体。这些载体能够实现对横纹肌的系统性基因转移，并已在动物模型中用于治疗由多种隐性遗传突变引起的多种疾病。目前递送表达抑制性 RNA 的基因构建物的努力也可能使该系统被应用于显性遗传性肌病。肌病治疗的主要遗留障碍仍是与给药途径、剂量、免疫抑制策略的使用以及总体安全性相关的挑战。尽管如此，过去十年间在治疗小鼠和犬的肌病模型方面取得的巨大进展使骨骼肌病毒基因治疗的临床应用似乎已触手可及。

本章个人批注

本章是肌肉疾病"治疗篇"的奠基章节，由 Arnett、Ramos 和 Chamberlain（华盛顿大学）撰写，把焦点从前面 75 章层层铺陈的"机制—缺陷—分子—信号"链条切换到"如何把矫正基因真正送进去"这一工程问题。三大载体系统（Ad、慢病毒、rAAV）的横向比较很清晰：Ad 容量大但免疫原性强且对成熟肌纤维嗜性差，慢病毒可整合入祖细胞实现永久修正但有插入致突变风险且对成体骨骼肌效率低，rAAV 免疫原性低、可系统性全身递送、表达持久但容量只有 5 kb——这个 5 kb 直接决定了 dystrophin（13.9 kb cDNA）必须被工程化为 micro-/mini-dystrophin。

Chamberlain 实验室在 micro-dystrophin 上的工作是本章的隐性主线——从 Koenig 1989 观察 BMD 患者中截短型 dystrophin 仍有功能，到 Harper 2002 设计 ΔR4-23/ΔCT，再到大动物验证和 rAAV 2.5 临床试验，可以看出一条"截短设计 → 小鼠 mdx 验证 → 犬 GRMD 验证 → 人临床试验"的二十年转化路径。读完后我印象最深的是免疫问题——Ad 的免疫原性、rAAV 在犬中的细胞免疫、人群对野生型 AAV 的预先免疫、还有 Mendell 2010 临床试验中两名男孩出现 dystrophin 特异 T 细胞反应——这是反复出现的瓶颈，且显然尚未被完全解决。

还有一个有意思的小细节：CAR（柯萨奇-腺病毒受体）在成熟肌纤维上表达下降，这是为什么早期第一代 Ad 载体的肌肉转导效果不好的细胞学解释；同时"gutted Ad"只能通过辅助病毒共感染来制备，所以残留辅助病毒污染成为临床放大的障碍。这两点把"为何最终 rAAV 占主导"的工程逻辑交代得很清楚。

与上下章的衔接（一段话）

本章承接第 75 章代谢性与线粒体性肌病（Haller/DiMauro），把焦点从"能量供给障碍"切换到"治疗性基因递送"——前 75 章基本是在讲"各种肌病的分子机制是什么"，从本章开始进入"我们怎么把矫正基因送进肌纤维"的工程问题。本章也是后续两章（第 77 章细胞疗法、第 78 章肌营养不良的免疫组分）的总览铺垫：第 77 章将讨论基于干细胞和肌源祖细胞的体外基因修饰与移植——这正是本章末段提到的"慢病毒体外修饰肌源祖细胞"的延伸；第 78 章则将聚焦 Duchenne 肌营养不良（DMD）和肢带型肌营养不良（LGMD）中由基因突变触发的免疫病理，把本章末段提及的 dystrophin 免疫原性问题进一步展开。第 79 章（myostatin）、第 80 章（IGF-1）和第 81 章（肌病新靶点）则构成"基因治疗/细胞治疗/分子治疗"三足并立的治疗策略拼图。回到本书结构层面——第 76 章与第 46 章（心脏基因治疗）形成"骨骼肌 vs 心肌"基因治疗的平行章节，两章都把 rAAV 推到了最优载体的位置，但骨骼肌的关键挑战是体积大、分布广、需要系统性递送，而心肌的关键挑战是外科路径（冠脉灌注）；第 78 章还会再度呼应第 66 章（DGC/肌营养不良）和第 70–72 章（ECM/核骨架相关肌病），把"分子缺陷 → 病毒递送 → 免疫排斥"这条治疗学主轴延伸到所有肌营养不良亚型。