第 71 章：Marfan 综合征骨骼肌异常的分子发病机制（Molecular Pathogenesis of Skeletal Muscle Abnormalities in Marfan Syndrome）

引言

法国儿科医生 Antoine Marfan 在 100 多年前首次描述了 Marfan 综合征（MFS）——他从一位 5 岁女孩身上观察到了非同寻常的肌肉骨骼异常，由此奠定该综合征的命名基础。MFS 是一种常见的常染色体显性遗传的系统性结缔组织病，估计患病率为 1/5000–1/10000，由编码细胞外基质蛋白 fibrillin-1 的 FBN1 基因突变所致。MFS 的临床表现横跨多个器官系统：骨过度生长（表现为细长指、高个子等骨骼特征）、眼晶状体脱位（ectopia lentis）、肺气肿以及心脏并发症如主动脉瘤。FBN1 编码 fibrillin-1——一种广泛分布于细胞外基质中微纤维的主要组分，在弹性组织的弹性蛋白沉积中起重要作用，因此 fibrillin-1 缺陷在结构上直接影响主动脉壁等富含弹性蛋白的组织。相当大一部分 MFS 患者存在明显的肌肉量减少，常伴肌张力低下，特别是在幼年期最为突出；此外，远端关节的关节活动度过大也是常见体征，最明显于远端关节且常伴蜘蛛指（趾）（arachnodactyly）；肘关节的先天性挛缩发生率中等。MFS 患者经常报告肌肉疲劳，以及较轻程度的肌无力、肌发育不全（hypoplasia）、肌痛（myalgia）和肌肉痉挛。尽管营养和运动充足，绝大多数 MFS 患者终生无法增加肌肉量。fibrillin-1 在骨骼肌的 endomysium 和 perimysium 中高度表达，提示肌肉症状与原发的 fibrillin-1 异常之间存在因果联系。最初的研究者曾推测主动脉内的 fibrillin-1 突变通过异常形成由弹性纤维和邻近平滑肌细胞组成的层状单位而导致动脉瘤——结构弱化是该病理表现的最初解释，把 fibrillin-1 看作纯结构性 ECM 组分。后续研究则把视角转向 fibrillin-1 作为 TGF-β 活性调控者的一面，从结构完整性问题转入细胞信号失调问题，重新定位 fibrillin-1 在微环境中的生物学角色。

Marfan 综合征中 TGF-β 信号活性升高

fibrillin-1 是一种 350 kDa 的糖蛋白，由多个串联排列的表皮生长因子（EGF）样模体组成，共 47 个模体，其中 43 个含钙结合序列称为钙结合 EGF 样（cbEGF）结构域。cbEGF 模块执行多种功能：稳定 fibrillin-1 单体的伸展构象、促进微纤维内单体的侧向堆积、抑制蛋白水解及介导蛋白-蛋白相互作用。cbEGF 模体的串联阵列（1–12 个重复）之间被 7–8 个 8-cys/TB 模块分隔，这些模块与潜伏转化生长因子结合蛋白（LTBPs）具有高度同源性。弹性纤维发育成熟过程中，原弹性蛋白（tropoelastin）沉积在微纤维网络上。微纤维还参与基质-细胞附着，至少部分通过 fibrillin-1 与细胞表面整合素的直接相互作用实现。因此最初推测主动脉内的 fibrillin-1 突变通过异常形成由弹性纤维和邻近平滑肌细胞组成的层状单位而导致动脉瘤，引发组织结构弱化。新近证据表明 fibrillin-1 和微纤维调控转化生长因子-β（TGF-β）的生物利用度、激活和局部活性。TGF-β 以 prepropolypeptide 形式合成，在 post-Golgi 区室中被切割，生成成熟生长因子分子和无活性切割片段——潜伏相关肽（LAP）。TGF-β 和 LAP 的同源二聚体相互作用形成生物学上无活性的复合物，称为小潜伏复合物（SLC）。随后 SLC 与三种潜伏转化生长因子结合蛋白（LTBP-1、-3 或 -4）之一共价结合形成大潜伏复合物（LLC），分泌到细胞外后介导潜伏 TGF-β 靶向细胞外基质（ECM），并有与 fibrillin-1 和纤连蛋白相互作用的报道。TGF-β 必须从 LLC 释放（TGF-β 激活）才能激活其细胞表面受体并启动信号转导。已知的生理激活剂包括蛋白酶（如基质金属蛋白酶和纤溶酶）、基质细胞蛋白（如 thrombospondin-1）、整合素（如 αvβ6 和 αvβ8）、极端 pH、活性氧和机械牵拉。基质结合潜伏 TGF-β 已被认为具有多重功能，对 TGF-β 信号具有互补和分歧两方面后果：首先，以稳定的潜伏形式进行细胞外储存使 TGF-β 能对微环境中多种刺激产生快速信号响应；其次，基质隔离提供了一种浓缩 TGF-β 的手段——这对组织形态发生时达到信号阈值可能尤为关键；最后，基质丰度、组成和完整性的动态变化可能影响 TGF-β 的呈递和/或激活生物利用度的其他方面。MFS 中 TGF-β 信号改变的首个证据来自 fibrillin-1 缺陷小鼠发育性肺气肿的研究：Neptune 等人证明围产期远端肺泡分隔失败与发育肺中游离和活性 TGF-β 增加以及 TGF-β 信号增强相关，潜伏 TGF-β 的同步减少提示 TGF-β 激活增强是主要事件。系统递送泛特异性 TGF-β 中和抗体以剂量依赖方式改善 fibrillin-1 缺陷小鼠的肺泡分隔，由此确立了增强的 TGF-β 信号对 MFS 发病机制的贡献。Fbn1 错义突变杂合小鼠（Fbn1C1039G/+）的后续研究在二尖瓣、硬脑膜和升主动脉等其他受累组织中提供了 TGF-β 信号增加的证据：包括磷酸化 Smad2 的核内积累以及胶原和结缔组织生长因子等 TGF-β 驱动基因产物的输出增加。TGF-β 中和抗体同样能减弱或预防 MFS 的重要表现，包括二尖瓣黏液瘤样变性和进行性主动脉根部扩张。图 71.1 以示意方式总结了该机制：fibrillin-1 缺失导致微纤维缺乏，引起潜伏 TGF-β 复合物的异常激活，释放的 TGF-β 与细胞表面受体结合并通过 R-Smad（Smad2/3）磷酸化、与 Smad4 形成复合物并转位到核内启动转录因子（TF）驱动的靶基因表达；TGF-β NAB 或 losartan 可在此通路上游或下游阻断这一信号。Habashi 等人证明用血管紧张素 II 1 型受体阻断剂（ARB）氯沙坦治疗可降低 TGF-β 信号、保留主动脉壁结构并预防 Marfan 小鼠的主动脉瘤。在用氯沙坦治疗的重度 MFS 儿童小样本观察队列中观察到类似的保护作用。这些研究共同表明增强的 TGF-β 信号与 MFS 临床表现之间存在强因果联系。

TGF-β 信号在骨骼肌中的功能性作用

TGF-β1 在肌生成过程中表达，其时空表达与周围肌管的纤维型组成相关。在成熟成年肌肉中，TGF-β 已被证明对骨骼肌再生有负面影响——抑制卫星细胞增殖、肌纤维融合以及肌纤维分化所必需的肌特异性基因表达。此外，TGF-β1 在损伤后诱导成肌细胞向纤维化细胞转化。骨骼肌损伤后会发生由卫星细胞精确协调的修复过程，包括生长因子和细胞因子的释放以及巨噬细胞和成纤维细胞的迁移和增殖——它们增加 ECM 组分的产生；这些组分在正常再生过程中被降解。炎症反应负责清除肌纤维碎片并调节再生。TGF-β1 是组织伤口愈合和纤维化的强效调节因子，在损伤和运动后骨骼肌再生过程中生理性上调，被认为参与肌损伤后的瞬时炎症反应。炎症反应的持续暴露会导致 ECM 改变以及生长因子和细胞因子（包括 TGF-β1）水平升高，从而促成纤维化组织的形成。因此 TGF-β1 是损伤后成肌细胞向纤维化组织转化的主要因子之一。图 71.2 把这一过程绘制为：受伤的肌肉释放生长因子和细胞因子，募集巨噬细胞和成纤维细胞；卫星细胞被激活、增殖并分化为肌母细胞（myoblasts），在 TGF-β1 影响下分化为肌细胞（myocytes）并融合形成肌纤维；同时部分细胞在持续性炎症暴露下转化为肌成纤维细胞（myofibroblasts），沉积纤维化组织。在与肌肉稳态和再生相关的各种生理和病理条件下降低 TGF-β1 水平已被证明对多种肌病有益，提示通过抑制该信号可能改善以纤维化或再生障碍为特征的肌病状态。

Marfan 综合征小鼠骨骼肌中的 TGF-β 信号

评估 MFS 骨骼肌功能障碍的大多数研究使用了在小鼠 Fbn1 基因第 25 外显子中携带靶向错义突变（1039 位密码子的半胱氨酸→精氨酸，C1039G）的杂合小鼠。Fbn1C1039G/C1039G 纯合小鼠在 10–14 日龄之间因主动脉夹层死亡。10 日龄野生型和纯合突变同窝仔畜分析显示体重存在显著差异，这与所检查的所有骨骼肌群（股四头肌、膈肌、腓肠肌、胫骨前肌、比目鱼肌和肱二头肌）的结构异常相关。这些异常包括肌纤维大小和纤维数量明显减少以及肌纤维束之间结缔组织和脂肪增加，为明显的肌肉发育不全（hypotrophy）以及肌肉形成不全（hypoplasia）提供了证据。Fbn1C1039G/+ 杂合小鼠表现出明显的纤维大小变化和 endomysium 纤维化，这在 MFS 患者的骨骼肌中也可观察到。此外，对 fibrillin-1 的免疫组化染色显示 Fbn1C1039G/+ 小鼠和 MFS 患者骨骼肌中 endomysium 表达降低。鉴于先前在其他组织中存在 TGF-β 信号异常的证据，进一步的实验通过磷酸化 Smad2/3（pSmad2/3）的免疫组化染色评估 fibrillin-1 缺陷小鼠的骨骼肌 TGF-β 信号是否增强。配体激活的 TGF-β 受体诱导 Smad2 和 Smad3 磷酸化，后者与 Smad4 形成异源复合物并转位到核内介导靶基因响应。免疫荧光评估显示 Fbn1C1039G/+ 小鼠肌纤维中存在 pSmad2/3 的核内积累。periostin 是一种已知在肌肉中由 TGF-β 诱导的蛋白，其表达分析进一步提供了 TGF-β 信号增加的证据——与野生型小鼠相反，Fbn1C1039G/+ 动物在成熟且未受伤的骨骼肌中表现出 sarcolemma 的 periostin 表达。为了评估 Fbn1C1039G/+ 小鼠中过量 TGF-β 信号与肌病发展之间的因果关系，通过从 7 周龄开始每两周一次腹腔注射 1 mg/kg 或 10 mg/kg TGF-β 中和抗体（TGF-β NAb）进行体内全身 TGF-β 拮抗。该抗体在体内和体外均中和 TGF-β1 和 TGF-β2 两种同种型。后续的形态学和形态计量学评估显示，使用 TGF-β NAb 治疗 2 个月后突变动物的异常肌肉形态得到挽救，与所用剂量无关。此外，在 TGFβ NAb 处理的 Fbn1C1039G/+ 小鼠中既未观察到 pSmad2/3 的核内积累也未观察到 sarcolemma 的 periostin 染色。Marfan 小鼠和患者肌肉活检中的一个有趣观察是多处萎缩和分裂纤维的存在，提示异常和/或不完全的肌肉再生。由于 TGF-β 信号对肌肉发育和再生有负面影响，有人提出异常肌肉再生反应可能是 Marfan 综合征肌病表型的促成因素。Fbn1C1039G/+ 小鼠在注射蛇毒心脏毒素后的再生反应详细分析显示再生延迟，损伤后 4 天仅见散在的新形成肌纤维。此外，在心脏毒素注射后 18 天（此时野生型小鼠已成功完成肌肉重塑），Fbn1C1039G/+ 小鼠表现出多个萎缩和小型纤维伴局灶性纤维化区域，提示存在异常肌肉修复。所有动物组在心脏毒素注射后 4 天均显示 pSmad2/3 的核内积累和 sarcolemma 的 periostin 表达，这与肌再生最初 5 天内 TGFβ1 和 periostin 表达瞬时增加的先前观察一致。相比之下，pSmad 2/3 的核内积累和 periostin 表达在 Fbn1C1039G/+ 小鼠损伤后 18 天持续存在，而在野生型或 TGFβ NAb 处理的 Fbn1C1039G/+ 小鼠中未观察到。在心脏毒素注射时及注射后 2 周系统性给予 TGF-β NAb 显著改善了 Fbn1C1039G/+ 小鼠的肌肉再生能力。这些数据表明，伴随肌损伤和修复的生理性 TGF-β 信号尖峰的放大和/或延长可限制再生并最终导致 Marfan 综合征的肌病表型。鉴于无法在损伤响应中充分补充受损肌纤维，有人推测 TGF-β 信号增加改变了卫星细胞的表现。在肌肉再生过程中，卫星细胞退出正常的静止状态并开始增殖；经过数轮增殖后，大多数卫星细胞分化和融合，形成新肌纤维或修复受损纤维。在损伤后 48 小时对 M-钙黏蛋白（增殖中卫星细胞的标志物）和 Pax7 进行免疫组化评估显示，与野生型或 TGFβ NAb 处理的 Fbn1C1039G/+ 小鼠相比，Fbn1C1039G/+ 小鼠胫骨前肌连续切片中这些标志物染色的卫星细胞数量显著减少。此外，肌生成素（参与肌纤维形成晚期分化过程的成肌细胞调节因子）在心脏毒素攻击后 5 天的 Fbn1C1039G/+ 小鼠胫骨前肌中表现出类似的减少，而野生型或 TGFβ NAb 处理的 Fbn1C1039G/+ 小鼠则无此表现。

治疗转化：losartan 与向其他肌病的扩展

如上所述，先前证据表明 losartan（一种血管紧张素 II 1 型受体（AT1）拮抗剂）在 MFS 以及慢性肾病和心肌病等其他疾病状态中引起临床上相关的 TGF-β 拮抗。Losartan 因此被作为 fibrillin-1 缺陷小鼠骨骼肌异常的一种潜在治疗选择进行了研究。事实上，长期使用 losartan 治疗使 Fbn1C1039G/+ 小鼠稳态肌肉结构完全正常化，这与成熟骨骼肌中 TGF-β 信号的消除相关。此外，在心脏毒素诱导损伤前给予 losartan 显著改善 Fbn1C1039G/+ 小鼠的肌肉再生。综合来看，这些发现表明增强的 TGF-β 信号通过抑制卫星细胞增殖和分化导致 Marfan 小鼠模型中肌肉修复受损。这些观察具有重要意义，因为它们可能解释了 MFS 中先天性肌病和终生无法增加肌肉量。在紧邻围产期，骨骼肌主要通过卫星细胞调节的肌纤维数量增加而经历肌肉量的显著增加；此后，骨骼肌变得分化，卫星细胞仅在响应生理和非生理需求（如运动或损伤）时被激活。生理性卫星细胞介导的新生儿期肌肉量扩增因此代表了特别容易受 TGF-β 抑制影响的脆弱时期。这可以解释为什么 MFS 幼儿肌发育不全和肌病的发生率和严重程度增加，并通常随时间逐渐改善。在生命后期，鉴于 TGF-β 活性持续增加，卫星细胞可能仍无法充分响应生理刺激如运动。MFS 骨骼肌研究得出的数据代表了 TGF-β 活性增加对受损肌肉再生和肌病表型的原发贡献的首个证据。此前已有描述性证据表明 TGF-β 活性增加与各种遗传和获得性肌肉疾病的纤维化相关。各种退行性肌病（包括某些形式的肌营养不良）发病机制中的一个重要机制是卫星细胞表现和肌肉再生能力随时间下降，随后逐渐形成纤维化。TGF-β 因此成为这些影响的有吸引力的候选介导因子，后续研究表明 TGF-β 信号增加确实在各种形式的肌营养不良中起重要作用。在 dystrophin 缺陷 mdx 小鼠（Duchenne 肌营养不良的动物模型）骨骼肌中已证明 pSmad2/3 核内积累增加和 sarcolemma 的 periostin 表达。解释这些数据的一个复杂因素是 myostatin（TGF-β 超家族的另一成员）也通过 pSmad2/3 级联发出信号。该变量通过在 myostatin-null/mdx 动物中显示 pSmad2/3 核内和 periostin 表达的持续增加而消除。Myostatin 是卫星细胞活性的负调节因子，其功能丧失在动物和人类中引起显著肌肉肥大。尽管 myostatin 拮抗已被证明可改善 mdx 小鼠中的肌营养不良样肌病表型，但有证据表明恢复不完全。此外，与 TGF-β 相反，有证据表明在肌营养不良中 myostatin 表达降低，可能作为不充分生理补偿尝试的组分。果蝇肌营养不良模型中的近期研究支持 SMAD 信号作为肌营养不良发病机制中重要 TGF-β 信号下游靶点的发现。使用 δ-sarcoglycan 缺陷的果蝇，作者证明了 TGF-β 活性增加与骨骼肌和心肌损伤相关。使用了单倍体不足等位基因以降低 SMAD 信号，该处理足以挽救该突变体中的骨骼肌和心肌功能障碍。因此，虽然以 myostatin 拮抗为目标的策略可能通过靶向平行通路提供一些益处，但 TGF-β 拮抗靶向的是似乎直接参与疾病发病机制的通路。关于 TGF-β 信号在肌营养不良发病机制中重要作用的其他证据来自鼠肌营养不良形式中修饰基因的研究——这些研究确定 Ltbp4（编码 TGF-β 隔离蛋白的基因）作为肌营养不良的遗传修饰因子，表明降低的 TGF-β 信号与减少的膜渗漏和减少的纤维化相关。鉴于 TGF-β 信号在肌营养不良发病机制中的重要作用，几项研究分析了 TGF-β 拮抗在 dystrophin 阴性 mdx 小鼠中的潜在益处。TGF-β NAb 给药改善了 9 月龄 mdx 小鼠的再生能力。使用 TGF-β NAb 的其他研究表明纤维化减少但也在 mdx 膈肌中产生不利的细胞因子谱。后续研究探索了 losartan 作为 mdx 小鼠中 TGF-β 信号拮抗剂的治疗药物。长期给予 losartan 减少骨骼肌纤维化并改善 mdx 小鼠体内和体外骨骼肌功能。此外，证明 losartan 改善 mdx 小鼠的心肌纤维化和功能。综合来看，这些累积数据表明 TGF-β 活性增加并非如先前所推断的仅驱动 dystrophin 缺陷 mdx 小鼠中的晚期纤维化，而更重要的是在多种遗传定义的肌病中对于阻止卫星细胞再生肌肉的生理反应是必需且充分的——这一过程对于肌肉结构和性能的保持至关重要。新近证据表明 TGF-β 信号增加也在获得性肌病状态中起关键作用。特别地，TGF-β 信号增加驱动由裂伤诱导的严重肌损伤模型中的纤维化反应，并已被证明在年龄相关的肌肉再生能力下降和肌肉量减少（肌少症）中起作用。这些数据表明通过美国 FDA 批准的药物 losartan 进行的 TGF-β 拮抗可能成为 MFS 和 Duchenne 肌营养不良等遗传形式肌病以及获得性肌病状态的有前途的治疗策略。

本章个人批注

读完本章后最深的感受是：fibrillin-1 这个 ECM 蛋白的功能远不只是"结构性支架"——它通过对 TGF-β 潜伏复合物的隔离来调节信号微环境，是一个把"结构"和"信号调控"绑在一起的分子。这与 Ch70 中读到的 collagen VI、laminin-211、perlecan 等的"结构性"角色形成有趣对比——Ch70 的 ECM 肌病基本都是从"力传递/膜完整性丧失"角度理解病理，而本章则完全跳到"信号失调"角度。两章合起来构成了一个更完整的 ECM 病理学视野：基质蛋白既通过物理结构也通过信号调控双重作用于肌细胞。第二个让我印象深刻的点是 treatment 部分的"老药新用"故事——losartan 本来是降压药（ARB），通过阻断 AT1 受体在多个组织中引起 TGF-β 信号下调，从一个意想不到的入口进入了肌病治疗领域。文中提到 losartan 在 mdx 小鼠中改善骨骼肌纤维化、在 MFS 小鼠中挽救肌病表型，这说明 TGF-β 过度激活是许多肌病的共同终点通路，针对它的拮抗剂具有跨疾病的潜力。第三个关键点是 disease mechanism 的层次：TGF-β 对卫星细胞既有抑制增殖的作用（acute phase）又有诱导成纤维细胞转化的作用（persistent phase）——这与第 67 章 statin-induced myotoxicity 章节中"急/慢两相"的肌损伤模式有结构上的相似性（也是 Ch67-Feng 那条 line 的呼应）。时间窗口（围产期卫星细胞扩增 vs 成年卫星细胞激活）是这章给的"为什么早期最严重"的解释。Nab 抗体实验的"exaggeration/prolongation of physiologic spike"这个 framing 也很精确——TGF-β 信号在正常肌损伤后本来就有一过性升高，fibrillin-1 缺陷让这个 transient spike 变成了 persistent signal，从"生理反应"变成"病理反应"——这是信号动力学的时间维度而不是简单的"高低"问题。本章未涉及的点：MFS 患者的 losartan 临床试验（Habashi 那条线）实际结果如何，剂量和长期效果？minoxidil、valsartan 等其他 ARB 是否等效？fibrillin-1 与 LTBP 之间的相互作用位点是什么？这章没有展开，需要后续在 Ch72+ 中找答案。

与上下章的衔接（一段话）

本章位于 Part III Skeletal Muscle 的中间位置，紧接 Ch70（Bönnemann/Voermans 的 ECM 相关肌病与肌营养不良）。Ch70 重点在"ECM 结构完整性丧失"导致的肌病谱系（laminin-211/collagen-VI/perlecan 等结构性蛋白的突变→力传递失败→肌膜破坏→肌营养不良），而 Ch71 把视角从"结构 ECM 蛋白"转向"信号调控 ECM 蛋白"——fibrillin-1 缺陷不是破坏肌纤维的机械完整性，而是通过 TGF-β 过度激活导致肌病。这是一个概念上的扩展：ECM 不只是"被动支架"，它还主动调节生长因子的生物利用度。Ch70 末尾已显式 forward-reference Ch71（Bönnemann-Voermans 在 §70 Camurati-Engelmann 和 §70 inherited-connective-tissue 处已点出 Marfan 综合征），而 Ch71 末尾又把 TGF-β 拮抗的概念推广到 Duchenne 肌营养不良（mdx 小鼠）以及获得性肌病（撕裂伤、肌少症），向 Ch72+ 的核纤层疾病（diseases of the nucleoskeleton，lamin A/C 相关）和 Ch73 骨骼肌离子通道病（channelopathies）做好铺垫。Ch72 将引入 laminopathy 谱系（Emery-Dreifuss 肌营养不良、扩张型心肌病合并传导系统疾病等），这与本章末尾提到的 DMD（dystrophinopathy）和 MFS（fibrillin-1）共同构成 Part III 骨骼肌病三联的结构 vs 膜 vs 信号三大范畴。