第 52 章：骨骼肌发育（Skeletal Muscle Development）
引言
作者 Margaret Buckingham 与 Alicia Mayeuf 在引言中概述了骨骼肌发育研究的历史脉络和本章的定位。研究从经典形态学观察和实验胚胎学起步，最初描述了骨骼肌的体节来源；1970 年代起骨骼肌细胞系的分离使该体系成为研究组织分化分子机制的首选，由此发现了 MyoD 家族的生肌调控因子——这一发现使骨骼肌成为被研究得最深入的脊椎动物分化系统之一，至今体外研究（in vitro studies）仍在持续推进对肌生成基因调控的精细认识，相关研究也为肌生成决定因子在染色质重塑和基因调控网络层面的作用提供了重要洞见（"such in vitro studies still provide sophisticated insights into myogenic gene regulation"）。1980 年代初克隆探针（cloned probes）的应用使在体（in vivo）基因表达分析成为可能——研究者可以在胚胎肌生成过程中直接检测基因的时空表达模式；随后小鼠及其他物种（鸡、斑马鱼、非洲爪蟾）的基因操控技术（gene manipulation techniques）开启了功能性研究，通过基因敲除、条件性突变、Cre-loxP 谱系示踪等手段阐明基因在骨骼肌发育中的因果作用。在过去 10 年中，研究焦点集中在躯干和四肢骨骼肌形成的上游调控因子——典型代表是 Pax3/7 基因家族（在躯干和四肢中起主导作用）以及 Pitx2（在头部起主导作用）；同时肌肉干细胞（包括胚胎期和出生后卫星细胞）行为的基因调控网络也开始被系统刻画——这些工作逐步描绘出从转录因子组合到信号通路、染色质状态、细胞行为的整合图谱（"gene regulatory networks that underlie the behaviour of muscle stem cells are emerging"）。下一节将进入躯干和四肢骨骼肌形成的具体讨论。本章的定位是综述性介绍：以"为肌肉生物学研究者提供总览"为目标，不深入每个细节（"without entering into all the more detailed aspects of this fast-moving field"）；除未综述过或最近发表的内容外，引用均指向综述文献以避免重复罗列原始文献（"we reference reviews where the primary literature can be found, except if the subject has not been reviewed or in the case of recent publications"），使读者可以直接从综述获取进一步资料。本章分为躯干/四肢和头部两大主题——前者的生肌程序以体节为基础、后者以前部颅中胚层为基础，两者在转录因子配置和信号输入上有部分重叠但也有显著差异，反映骨骼肌生成作为一个"程序"在不同解剖位置被重新部署的现象。本章其余部分按以下顺序展开：先讨论躯干/四肢的体节起源与早期肌发生，再讨论该部位的肌肉成熟与二次肌生成，然后进入转录因子调控网络（MRFs + 上游调控因子）、信号通路与肌肉发育后期，最后进入头部肌肉的起源与头肌肌发生的调控——这一结构使读者先掌握"主程序"（躯干/四肢）再接触"变体"（头部）。
躯干和四肢骨骼肌的起源与早期肌发生
躯干和四肢的骨骼肌来源于体节（somite）（图 52.1A）。体节由轴旁中胚层沿头尾梯度逐次分节形成，分节过程随胚胎发育从头侧到尾侧推进；这一分节产生了一系列沿前后轴排列的暂时性上皮结构。新形成的体节具有上皮结构：背部上皮维持为皮肌节（dermomyotome），腹部体节经历上皮-间充质转化形成生骨节（sclerotome）腔室——后者分化为脊柱和肋骨的软骨与骨。生骨节的最背侧部分形成另一个腔室——腱节（syndetome）——是包括躯干肌相关肌腱在内的结缔组织来源。鸡胚实验结合小鼠克隆分析表明，皮肌节细胞是多能的：它们产生躯干所有骨骼肌（来自生肌节）以及背部的真皮、棕色脂肪细胞和血管的内皮与平滑肌细胞——这种多能性是骨骼肌与其他中胚层衍生物（真皮、脂肪、血管）共享共同祖细胞的关键证据。
第一块形成的骨骼肌是位于体节中央的生肌节（myotome）。生肌节的形成来自皮肌节边缘（主要是靠近神经管的背轴侧唇、然后是靠近外侧中胚层的腹轴侧唇）细胞分层迁移（delamination）——一旦离开皮肌节的上皮结构，这些细胞即分化为肌细胞，沿体轴方向延展并定位。鸡胚的早期生肌节形成有详细描述，存在分层迁移的连续波次：先是来自背轴域的"先驱细胞"（pioneer cells）形成肌细胞支架组织其他边缘分化细胞的到来——这是一个高度协调的形态发生事件，先驱细胞可能为后续细胞提供位置和方向线索。后续细胞从皮肌节其他边缘（腹轴唇）分层、定向到由先驱细胞搭好的支架中。
随着发育推进，皮肌节中央上皮域经历上皮-间充质转化（EMT），将肌肉祖细胞释放到下方的生肌节中。这些细胞提供增殖性祖细胞群，为胚胎和胎儿发育晚期的肌肉生长做贡献——它们是生长中肌肉团的细胞来源，而不是早期结构形成的来源。在小鼠胚胎约 16 天时（即小鼠胎龄 E16），这些细胞开始定位于肌纤维下方的"卫星细胞"位置（紧贴肌纤维质膜外的基底层内）——这是出生后卫星细胞群体的胚胎起源。鸟类体节移植实验结合哺乳动物的基因示踪和基因工程细胞消融实验表明，出生后肌肉的卫星细胞确实来源于这一胚胎祖细胞群，提示卫星细胞池在出生前已经预置。
在前后肢水平，细胞从腹轴皮肌节分层迁移进入早期肢芽（limb bud），随后分化为骨骼肌或作为祖细胞群持续增殖（图 52.1B）。肢芽中早期肌生成祖细胞的数量扩张依赖于细胞的持续增殖与分化的平衡。该过程发生于 E9 到 E11.5 之间（小鼠）。分层迁移后的迁移也是膈肌形成细胞的行为：膈肌祖细胞从颈部体节的腹轴皮肌节迁移，最终到达胸腔和腹腔之间的位置。泄殖腔肌祖细胞则是这一主题的变体——它们先进入后肢芽再迁出到达最终位置（位于腹侧体腔，控制泌尿生殖功能）。在胸段水平，一种过渡性结构——舌下索（hypoglossal chord）——由肌生成细胞层构成，从某些枕部和颈段体节的腹轴皮肌节向前延伸，贡献咽部来源的肌细胞（包括部分舌肌），其结构短暂存在于胚胎期、随后重组为成熟肌肉。
骨骼肌成熟与二次肌生成
大多数躯干肌从最初的生肌节生长而来：生肌节中的肌细胞经细胞融合形成多核肌纤维（图 52.2），随后发生肌肉质量的分割和重组。背轴生肌节将分化为附着于椎骨的后部深层肌肉；最新研究显示 syndecan 来源的结缔组织与肌纤维的紧密关联可能在肌肉生长过程中塑造其形态。腹轴皮肌节是生肌节细胞的主要来源，腹轴生肌节构成躯干体壁肌肉的主体；同样由生肌祖细胞池供给。肢体肌肉也遵循类似的发育进程——分离各个肌肉团块，在这一过程中结缔组织的角色更为清晰：鸡胚经典实验形成"原始生肌祖细胞由肢体的结缔组织决定其定位与分化"的观点；初始背侧和腹侧肌肉团块的分割以形成肢体各独立肌肉也依赖于与结缔组织的相互作用（详见 signaling 一节）。
随着发育推进，神经元向肌纤维方向生长，肌纤维在轴突引导和神经支配建立中扮演吸引因子的角色，包括肌梭内梭内纤维（intrafusal fibers，肌梭内的特化纤维）的感觉神经支配——这些纤维保留更胚胎期的收缩蛋白表型甚至到成年，反映它们与胚胎期肌纤维在转录程序上的连续性；以及肌纤维的躯体运动神经支配驱动收缩。明确神经肌肉接头（neuromuscular junction）和兴奋-收缩耦联（excitation-contraction coupling）的建立与所谓的"二次或胎儿肌生成（secondary or fetal myogenesis）"相联系，生成出生后肌肉中大多数纤维。该转换时机依赖于神经支配的开始时序，而神经支配的开始时序在胚胎不同位点有差异。这发生在第一批分化肌肉出现约两天后（以小鼠后肢为例约 E14.5），其特征是出现次级肌纤维——最初明显更细（其细胞核被形容为"串上的珍珠"，pearls on a string）——围绕在之前形成的主要纤维周围（图 52.2）。这些纤维可通过收缩蛋白区分：主要纤维同时含有慢肌球蛋白和胚胎期快肌球蛋白同种型，而次级纤维只含快肌球蛋白同种型。次级纤维也具有肌肉特异性代谢酶同种型（如 β-烯醇化酶）的表达，反映其代谢程序与主要纤维的差异。胚胎肌生成的时间进程从小鼠 E8.5（早期生肌节）开始，经历 E10.5（晚期生肌节）、E12（胚胎肌管）到 E14.5（主要肌纤维），随后在 E17 出现次级肌纤维（图 52.2）。先前关于二次肌生成的工作显示其前有一波祖细胞增殖产生次级成肌细胞，这些次级成肌细胞在培养中行为不同且转录组与原代或胚胎期成肌细胞有别——它们对 TGFβ/BMP 信号敏感度也不同（见 Later Stages 一节）。这一增殖波在主要肌纤维形成之后启动。出生后肌肉中，慢运动神经元（slow motor neurons）支配的纤维呈现典型慢表型，据信这些多来自胚胎期肌肉的主要纤维，而次级纤维获得成熟的快表型。肢体肌肉也遵循类似的发育进程——走向各个独立肌肉的分离（separation of individual muscle masses）；此时结缔组织的角色更为清晰，鸡胚经典实验建立了"原始生肌祖细胞由肢体的结缔组织决定其定位与分化（naïve myogenic progenitor cell that is instructed where to locate and differentiate by the connective tissue of the limb）"的观点。在大型哺乳动物（如绵羊、猪）有人提出存在更晚的第三波肌生成产生额外的第三级肌纤维——这是大型动物肌肉生长模式与啮齿类不同的一种表现。
控制骨骼肌发育的转录因子网络：MRFs 与上游调控
进入肌生成程序依赖于 MyoD 家族碱性螺旋-环-螺旋（b-HLH）转录调控因子。小鼠基因敲除实验确立 Myf5 和 MyoD 是肌生成决定（myogenic determination）所必需的，Mrf4 也在体节肌生成起始时扮演该角色。肌肉发育过程中肌生成决定基因呈现不同的时空调控模式与不同功能（图 52.3）。早期生肌节的形成依赖于皮肌节边缘 Myf5 和 Mrf4 的激活（这一分层过程本身不依赖于肌生成因子）；MyoD 在腹轴域然后在背轴域被激活，最初需要 Myf5/Mrf4；之后在缺乏这些因子情况下 MyoD 表达、肌生成启动而无早期生肌节形成。在缺乏 MyoD 的情况下，Myf5（正常在胚胎晚期下调）持续表达，骨骼肌发育推进。基于 Cre 介导的消融实验，有人提出存在不同的 MyoD 和 Myf5 依赖性肌生成系，但这一解释取决于 Myf5 调控的 Cre 表达水平。尽管肌生成决定因子可以互相替代，某些肌生成位点对单一成员的缺失更敏感：如 MyoD 突变体的膈肌功能正常但不够强壮，在 mdx（肌营养不良）突变背景下部分丧失，提示两个成员对发育中膈肌的肌肉稳定有协同作用。肌生成决定因子 Myf5、MyoD 和 Mrf4 含有参与染色质重塑的蛋白结构域（肌生成分化因子 Myogenin 缺乏该结构域）。这些决定因子的下游靶标（在 Myogenin 和肌肉分化激活之前）尚未完全刻画；最近工作显示 MyoD 和 Myf5 对 DNA 损伤反应不同：MyoD 的磷酸化导致 MyoD 激活基因表达暂时阻断以进行 DNA 修复，而 Myf5 没有该酪氨酸残基因此无此反应。
肌生成因子通常作为异源二聚体与普遍表达的 E12 家族 b-HLH 转录因子结合。已鉴定若干干扰肌生成因子功能的蛋白：包括 Id HLH 蛋白，作为异源二聚体隔离肌生成因子；Id2/3 在生肌节周围的体节域中高表达从而防止肌生成因子过早的转录活性。Id2/3 的下调由分化肌肉中存在的转录抑制因子 RP58（Zfp238）加强。microRNA 代表另一层调控：microRNA 31 已被证明靶向 Myf5 mRNA 的 3' UTR 从而阻止 Myf5 蛋白翻译；该 microRNA 不存在于分化的肌肉（如生肌节），但存在于皮肌节尤其是其边缘——这些位置 Myf5 已被转录；Myf5 蛋白的缺乏与 Myf5 突变体中这些细胞初始分层迁移缺乏 Myf5 功能的现象一致。microRNA 31 也在中枢神经系统的某些区域表达——这些区域曾检测到 Myf5 的意外转录（但无可检测蛋白、无 Myf5 突变体表型）。这是 microRNA 防止组织决定因子在不适当表达时行使功能的例子。Myf5 调控序列延伸超过 100 kb（位于同时含 Mrf4 的紧密连锁基因座中）已被广泛研究：不同的增强子元件控制 Myf5 在发育中不同肌生成位点的激活，反映骨骼肌形成不是单一基因调控级联，而是依赖于胚胎中肌生成的时序和位点的不同调控输入。肌肉对肌病相关突变的不同反应部分可能源于不同的调控历史。
Pax3 与 Pax7 作为肌肉干祖细胞的上游调控因子。Pax3 是躯干和四肢中生肌祖细胞的关键上游调控因子（图 52.3）。Pax3 与同源蛋白 Pax7 除特征性的 paired 结构域外还含有同源结构域（homeo-domain）。Pax3 和 Pax7 表达不局限于肌生成位点——Pax3 也是神经嵴细胞的重要早期调控因子。在肌生成背景下，Pax3 在前体节中胚层被激活，然后在新形成的上皮体节中表达，最终被限制在皮肌节；此阶段 Pax7 被激活并在皮肌节中央域高水平表达（图 52.1A）。
Pax3/Foxc2 调控细胞命运选择。Foxc2 和 Pax3 在上皮体节细胞中共表达。随后 Foxc2 在将形成软骨和骨的生骨节细胞中保持高表达（且转录因子 Foxc2 对该过程必需）；Foxc2 转录物在皮肌节中保持低水平。遗传降低 Pax3 水平时 Foxc2 转录增加，反之 Foxc2 突变体中 Pax3 转录增加——两基因在皮肌节多能细胞中相互抑制。非肌源性细胞命运（如血管内皮和平滑肌）依赖 Foxc2；当 Foxc2 或 Pax3 下调，更多细胞分别可获得肌生成或血管细胞命运。Pax7 和 Foxc1 也参与这一场景，模型是"多能性维持依赖于因子平衡、外部信号的扰动将引导细胞进入 Pax 依赖的肌生成命运或 Foxc 依赖的非肌生成命运"。
Pax3/7 靶基因。在肌生成背景下 Pax3 作为转录激活因子（对 Foxc2 的抑制可能是间接的，可能通过 Hdac5）。Pax3 和 Pax7 在肌肉发育中功能重叠，预期共享许多靶标：当 Pax7 编码序列被引入 Pax3 等位基因时，表达 Pax7 替代 Pax3 的胚胎在躯干中经历正常肌生成，仅在某些肢体肌肉有微小扰动。从皮肌节迁移出去的细胞分层依赖于 c-Met，该酪氨酸激酶受体基因是 Pax3 靶标。肌生成中许多其他信号通路组分（如 Fgfr4 是直接靶标）和转录调控因子的基因被鉴定为胚胎中 Pax3 潜在靶标。遗传学上 Pax3/7 位于 Myf5 和 MyoD 上游：Myf5 肢体和腹轴体节表达所需的关键调控元件是 Pax3 直接靶标；Dmrt2（皮肌节表达的转录激活因子）是 Pax3 直接靶标，间接靶向 Myf5 早期背轴激活的增强子，说明 Pax3 也间接调控该 Myf5 表达方面。胚胎中 Pax3/7 直接激活 MyoD 尚未证明，但 MyoD 上游调控序列被证明是卫星细胞中 Pax7 靶标。遗传上 MyoD 位于 Pax3 下游（Pax3/Myf5 双突变体中无任何躯干和肢体肌肉）（图 52.3）。
Six1 与 Six4 作为肌生成祖细胞的调控因子。Six 同源结构域蛋白是肌生成中具重要上游作用的另一家族（图 52.3）。如同 Pax 家族，Six 蛋白参与多种组织特异性程序的调控——这些功能在进化中保守，果蝇眼形成是因子合作的例子：Eyeless（Pax）作为眼形成的主调控因子控制 sine oculis（Six），Six 又与其辅因子 eyes absent（Eya）配合反馈调控 eyeless 并激活下游基因。鼠哺乳动物模型中，Six1/4 在皮肌节中表达，双突变体胚胎有重大肌肉缺陷——腹轴躯干肌和肢体肌缺失；存活的细胞中 Pax3 下调、肌生成因子激活受损，Mrf4 缺失而 Myf5 激活仅在背轴和皮肌节后缘保留（Pax3 也在这些位置持续表达）。Six 辅激活因子 Eya1/2 基因突变有类似的腹轴表型；皮肌节中央来源的肌生成细胞（这些基因不表达处）不受影响，提示这些域中可能存在尚未鉴定的其他 Six 辅激活因子。Six4 单突变体中肢体肌生成异常，Myf5 激活受影响。Myf5 基因同一肢体调控元件（依赖 Pax3）也含 Six 结合位点——突变后转录活性受损但未消除。尽管 Six 和 Pax 潜在可通过其同源结构域相互作用，但没有证据支持；这些因子通过相邻 DNA 结合位点独立作用。开放问题是"为何在迁移的 Pax/Six 阳性细胞到达肢体前肌生成决定基因未被激活"——可能涉及其他转录因子，但 Six 共抑制因子 Dach 在这些细胞中的存在可能贡献于防止过早进入肌生成程序。
迁移到肢体的体节细胞的其他上游调控因子：Lbx1、Meox2。除 Pax3 和 Six1/4 外，其他转录因子也参与肌生成细胞从体节迁移的过程。同源框基因 Lbx1（潜在 Pax3 靶标）在肢芽和舌下索水平的腹轴皮肌节中激活，在迁移细胞中表达。Lbx1 突变体中细胞迁移失败、堆积在体节旁；后肢和腹侧前肢肌缺失。Meox2 编码另一同源结构域蛋白，与 Meox1 一起在轴旁中胚层表达，后在皮肌节和迁移到肢体的细胞中表达。Meox2 突变体中肌肉祖细胞迁移正常但特定肢体肌缺失（尤其是前肢），肢体肌生成细胞中 Pax3 和 Myf5 表达降低；该表型因 Meox2 在结缔组织中也有表达而复杂化——突变体中结缔组织可能未正确向肌生成祖细胞发出信号。
Pitx2 作为上游肌生成调控因子。在躯干和肢体的肌生成位点，Pitx 转录因子在 Pax3 下游起作用，Pitx2 是潜在 Pax3 靶标（图 52.3）。Pitx2 在肌生成祖细胞和分化肌细胞中均表达。缺乏 Pitx2 时，肢体中肌生成祖细胞中 MyoD 不被激活——证明是 Pitx2 通过 MyoD 胚胎增强子直接作用。Myf5 激活不依赖 Pitx2，早期生肌节正常形成并正确启动 MyoD 表达（图 52.3）。但缺乏 Myf5 和 Mrf4 时，Pitx2 贡献于 MyoD 表达的补救，表明其在该 Pax3 依赖遗传通路中起作用。
骨骼肌分化所涉及的因子。骨骼肌分化有非常广泛的文献，主要基于生肌细胞系实验，包括肌生成调控因子与基本转录机器的相互作用数据。在胚胎体内肌肉发育中，Myogenin 是 MyoD 家族中负责激活下游肌肉基因的成员；Myogenin 突变小鼠有严重胎儿肌肉缺陷。骨骼肌分化起始时 Mrf4 执行该功能并可替代 Myogenin：复合突变体显示 Myf5 单独不能激活分化，而 MyoD 以及 Mrf4 和 Myogenin 具有此能力。
Mef2 家族与肌生成决定因子合作在 Myogenin 激活中起作用；之后 Mef2 因子（结合 A/T 富集位点）对许多下游肌肉基因的激活很重要；它们也可与肌生成因子相互作用提高反式激活效率。多个 Mef2 基因在胚胎骨骼肌分化中共表达；Mef2c 对早期心脏功能必需使突变体分析困难，但骨骼肌中 Mef2c 的靶向缺失揭示其对肌节基因调控（特别是 M 线蛋白）的重要性。斑马鱼胚胎肌肉中 morpholino 敲降显示 Mef2d 和 Mef2c 对编码粗肌丝蛋白的基因转录必需。SRF（与 Mef2 一样是广泛表达的 MADS box 因子）也参与许多肌肉基因激活，包括细肌丝的肌节肌动蛋白基因；SRF 靶向缺失导致早期骨骼肌缺陷，随肌肉成熟而加重。其他广泛表达的转录因子如靶向 MCAT 位点的 Tead/Taf1 因子和肌肉特异性 Vestigial-like 共因子也参与骨骼肌基因调控，但该背景下突变体表型尚未描述。microRNA 也参与调控肌肉分化相关转录因子，如 miR133 或 miR1-1 直接或间接影响 SRF 或 Mef2 活性。
Pax 因子在肌肉分化中不起作用——它们干扰该过程。Pax3 下调由 miR27 保证；胚胎中操控该 microRNA 影响肌生成祖细胞和分化肌肉之间的平衡。与 Pax3/7 相反，上游调控因子 Pitx2 和 Six1/4 也在肌肉分化中起作用。Pitx2 在分化肌肉中正常下调，而 Pitx3 在全身和头部表达；Pitx3 表达依赖于肌肉特异性增强子（由肌生成因子调控）。Pitx3 突变体中 Pitx2 水平保持高，提示 Pitx3 对 Pitx2 的负反馈调控。缺乏显著突变体表型表明这些 Pitx 因子功能重叠。Myogenin 激活依赖于肌生成因子（如 Myf5）通过 E-box 基序作用，并依赖于 Mef3 位点（结合 Six 因子）；下游肌肉基因的激活也依赖于 Six1/4 以及肌生成和其他因子。
快肌与慢肌基因调控。在成年肌肉中，Six1 和 Eya1 在快肌纤维中积累，在慢型比目鱼肌中异位过表达这些因子导致慢氧化表型向快酵解表型转化。快型纤维中 Six1/Eya1 的更高活性在出生后立即可见，提示其在慢/快运动神经元活性之前的快型程序激活中具有早发作用。胚胎中转录组分析显示在 Six1/4 双突变体剩余生肌节中许多快肌同种型基因下调。Six1/4 与胚胎和成年中快肌基因调控区的结合支持这些因子的直接调控。小鼠中，快慢同种型在胚胎肌细胞中共同表达——不同于斑马鱼在早期快慢肌祖细胞中分离的情况：斑马鱼中 Hedgehog 信号诱导转录抑制因子 Prdm1/Blimp1 在轴旁细胞中表达，防止快肌基因激活和 Sox6（慢型基因转录抑制因子）的基因激活——赋予这些细胞慢表型。Prdm1 在小鼠生肌节中表达但突变体无快表型，反映在生肌节细胞中慢肌基因调控的差异。Sox6 缺失胚胎仅在胎儿阶段显示慢肌基因表达上调。
胚胎型与胎儿型肌发生所涉及的因子。在肌肉发育的胎儿阶段（次级肌生成启动时），一系列次级肌纤维特征基因被激活，胚胎肌发生中原代纤维中表达的另一些基因被下调。该转变的分子机制长期不甚清楚，尽管已描述 Myosin light chain（Mlc）1/3 基因中导致 Mlc3 同种型后期表达的调控序列。基于胚胎与胎儿成肌细胞的转录组分析，鉴定了许多差异表达序列编码潜在调控因子。同源结构域转录因子 Arx 仅存在于胚胎成肌细胞中，其与 Mef2c 的相互作用促进肌肉分化。转录因子 Nfix 在胎儿肌肉中积累，与 PKCθ（也是胎儿肌生成的标志）形成复合物；该复合物结合并磷酸化 Mef2（此处是 Mef2a 同种型），导致后期肌肉基因如 M-CPK 的转录激活。Nfix 在胚胎成肌细胞中过表达导致慢肌球蛋白重链基因转录下调和胎儿基因上调，而 Nfix 的肌肉特异性突变导致胚胎肌肉程序维持。Nfi 因子也被报道结合 Myogenin 启动子并增强 Myogenin 对下游肌肉基因的结合——可能在多个水平影响肌肉分化。然而 Nfix 同种型在发育中肌肉的操控指出其在胎儿二次肌生成中的作用。Pax7（胎儿期在肌生成祖细胞中占主导）被认为激活 Nfix，但 Pax7 在更早的来自皮肌节中央的肌生成祖细胞中已存在，提示胎儿阶段还有其他因子参与。
影响肌发生的信号通路与肌肉发育后期
体节由周围组织信号图案化，这些信号也调控骨骼肌形成的起始（图 52.4A）。总体而言，Wnt 信号促进而 Tgfβ/BMP 信号抑制肌生成；其他信号也参与，包括 Sonic hedgehog（Shh）、Notch、Integrins 和 Neuregulin 介导的信号。
背轴生肌节。在背轴皮肌节中，来自背侧神经管的经典 Wnt 信号（与 β-catenin 一起作用）通过 Myf5 基因早期背轴增强子中的 Tcf/Lef 位点直接激活 Myf5 表达（图 52.4A）。Wnt 信号也促进背轴体节中细胞增殖，从而帮助维持肌生成祖细胞群。鸡胚背轴皮肌节中经典 Wnt 信号已被证明激活肌生成祖细胞中非经典 Wnt11 表达——该 Wnt11 随后通过平面细胞极性通路在组织生肌节中分化肌细胞方向中起作用。神经管 BMP 信号的抑制效应被背轴皮肌节中 BMP 拮抗因子 Gremlin 和 Noggin 的表达抵消。Sonic Hedgehog（Shh）从脊索和神经管底板发出的信号作为存活因子起主要作用：缺乏 Shh 时存在体节细胞死亡、大部分生骨节细胞丢失；背侧体节受影响较小，但皮肌节中肌生成祖细胞存活也受影响（后果是生肌节图案化）。Shh 通过 Gli 结合位点直接调控 Myf5 背轴增强子，因此早期 Myf5 表达也依赖于该信号通路。从皮肌节分层进入生肌节的肌生成细胞响应 Myf5/Mrf4 上调 α6β1 整合素；编码整合素配体的 Lama1 表达受 Shh 调控。肌生成细胞在分化前的正确定位、生肌节图案化以及将该腔室与生骨节分隔的基板形成也依赖于这些层粘连蛋白受体。Notch 信号也已被证明参与背轴体节肌发生的起始：从背侧神经管分层的神经嵴细胞穿过该体节部分（皮肌节中细胞表达 Notch 受体）；神经嵴细胞表达 Notch 配体 Delta，以"kiss and run"模式接触皮肌节细胞时激活该信号通路、促进背轴皮肌节中 Myf5 表达（图 52.4A）。干扰神经嵴和相关 Notch 信号负向影响肌发生起始。这些实验在鸡胚中进行，Notch 信号如何直接或间接调控小鼠中已表征的 Myf5 早期背轴增强子仍有待观察。
腹轴生肌节。腹轴皮肌节受来自外侧中胚层的信号影响——尤其是 BMP 信号，被认为延迟该体节域肌发生的起始（图 52.4A）；BMP 拮抗因子的存在随后减弱这种负效应。鸡胚腹轴皮肌节多能细胞中操控 BMP 信号已被证明促进 Pax3 阳性祖细胞的内皮细胞命运；在该背景下 Notch 信号以骨骼肌为代价促进平滑肌细胞命运。覆盖皮肌节的背侧外胚层也是信号来源：Wnt6 对维持皮肌节上皮结构和 Pax3 表达重要；PKC 活性激活（依赖于外胚层存在）也影响 Pax3 磷酸化并增强其转录活性，导致下游 MyoD 激活。腹轴皮肌节中迁移的神经嵴细胞通过来自神经嵴到肌生成祖细胞上 ErbB3 受体的 Neuregulin 信号延迟肌发生起始、促进 Pax3 阳性祖细胞维持。
皮肌节中央的崩解与肌生成祖细胞的释放。随着体节成熟，皮肌节中央域发生的上皮-间充质转化（EMT）与外胚层中 Wnt6 转录下调时间一致。除了 Wnt 信号丧失对皮肌节完整性的影响外，皮肌节上皮崩解（伴随 Pax3/7 肌生成祖细胞释放）被下层生肌节发出的 FGF 信号促进——鸡胚实验显示：FGF 信号触发 MAPK/ERK 通路，导致皮肌节中转录因子 Snail 激活（已知促进 EMT）。
腹轴体节肌生成祖细胞的迁移与肢体肌生成。从腹轴皮肌节细胞的脱层和迁移依赖于通过酪氨酸激酶受体 c-Met 和信号转导分子 Gab1 的信号（响应 HGF/Scatter 因子）。该配体由体节旁及沿肌生成祖细胞迁移路线（包括进入肢芽或前往膈肌和舌肌形成位点）的间充质细胞产生。趋化因子受体 CXCR4 也在肢体水平腹轴皮肌节的 Pax3 阳性细胞中表达；该基因是 Lbx1 靶标，c-met 则由 Pax3 调控。CXCR4 响应趋化因子 SDF1（也由间充质产生）。缺乏 c-Met 或其配体时，没有肌生成细胞分层并迁移离开皮肌节；缺乏 CXCR4/SDF1 时细胞能分层但迁移失败，后肢肌和前肢背侧肌不形成。突变体中泄殖腔肌也缺失。肢体内，Wnt 信号下游靶标 Tcf4 标记的间充质结缔组织对肌生成祖细胞定位和发育中肌肉团块图案化很重要。肢体中的不同信号中心（如来自背侧外胚层的 Wnt 或来自极化活性区的 Shh）参与肢体发育和图案化。
祖细胞自我更新与分化的调控。躯干或肢体肌肉中 Pax3/7 阳性祖细胞在发育中肌肉生长中起关键作用，因此维持"向骨骼肌分化"和"该群体自我更新"之间的平衡至关重要（图 52.4B）。Notch 信号过度激活已被证明导致 MyoD 阳性细胞减少；从 Pax3 表达细胞中突变 Notch 信号转录效应因子 RBP-J 或其配体 Delta1 的突变体分析清楚显示该信号通路确保肌生成祖细胞自我更新。FGF 信号操控提示其也参与该平衡维持：通过 Fgfr4 受体（促进进入肌生成程序）的信号被该通路的胞内抑制因子 Sprouty1/2（主要存在于祖细胞中）调节。Myostatin（TGFβ 超家族成员）也在胚胎骨骼肌祖细胞中表达，并被显示促进分化（图 52.4B）。Myostatin 突变体胚胎中肌生成祖细胞数量增加，导致晚期次级纤维形成增加；到出生后阶段 Myostatin 受体 ActRIIB 在肌生成祖细胞上被下调，因此对 Myostatin 信号敏感性降低。出生后阶段，Myostatin 的主要作用转向骨骼肌纤维——其缺失导致肌肉肥大。Follistatin（存在于胚胎肌肉中）结合胞外 Myostatin 从而调控其活性；Follistatin 突变小鼠出生时骨骼肌减少（因祖细胞过早分化未参与肌肉生长）。
肌肉发育后期。后期肌肉发育的大多数研究集中于肢体。肢体肌肉胚胎与胎儿成肌细胞的比较显示前者的分化对 TGFβ/BMP 信号不敏感，而次级成肌细胞分化被这些 Smad 介导的通路阻断。与胚胎肌生成相反，胎儿期次级成肌细胞依赖 Wnt/β-catenin 信号促进增殖。肌肉团块成熟也涉及相邻细胞类型的信号——结缔组织的后期作用可作例证：Tcf4 在该组织中的遗传操控揭示结缔组织成纤维细胞在肌纤维型发育和成熟中的重要性。Tbx4/5 突变体中 N-cadherin 和 β-catenin 减少影响结缔组织行为，导致部分骨骼肌缺失和其他肌缺陷。肌肉成熟时与发育中骨骼形成关节；生肌腱连接（myotendinous junction）在发育中肢体的建立依赖于肌纤维尖和相邻间充质（将形成肌腱原基）之间相互依赖的 FGF 信号。肌腱与发育中肌肉的分离揭示这些组织间的相互作用，涉及视黄酸信号在肌腱介导的肌肉存活中的作用。肌肉和骨骼成分互作的另一例是肌肉收缩对关节祖细胞维持的必需——依赖于收缩依赖的 β-catenin 信号通路调控（该通路对关节形成必需）。
头部肌肉的起源
在胚胎前部区域不形成体节，轴旁与外侧中胚层的区分不那么明显——部分反映中胚层的整体减少。头部的骨骼肌来源于该颅中胚层（cranial mesoderm）（图 52.5A）。所有躯干和肢体肌肉（包括部分颈部肌肉）来源于体节轴旁中胚层，而颈部其他肌肉从第一至第三体节旁的外侧中胚层（occipital lateral mesoderm）形成（图 52.5A 中紫色域，文献 60）。图 52.5A 还标出"非体节颈部肌肉"（non-somitic neck muscles）由枕部外侧中胚层贡献，"舌肌和体节颈部肌肉"（tongue and somitic neck muscles）则由轴旁/体节中胚层贡献——这一分层显示了头颈肌在中胚层来源上的多样性。
咽部水平，过渡性结构——鳃弓或咽弓（branchial or pharyngeal arches）——作为轴两侧的突起形成，含核心颅（咽）中胚层（被内胚层和外胚层包围）。第一弓将形成上颌（maxillary）和下颌（mandibular）突起随后形成上下颌的肌肉骨骼结构（图 52.5A）；下颌骨骨由侵入第一弓中胚层核心的神经嵴细胞形成，而颅中胚层是下颌肌（如咬肌 masseter、颞肌 temporalis）的来源。第二弓的中胚层核心产生面部表情肌；更后部弓的中胚层贡献于颈部的喉肌（laryngeal）和咽肌（pharyngeal）。咽中胚层也构成第二心区（second heart field）的前部——后者是流出道（outflow tract）和右心室心肌祖细胞的来源。第二弓中胚层核心贡献于心脏流出道心肌；回顾性克隆分析（retrospective clonal analysis，通过低密度标记追踪单个细胞后代的方法）显示其与面部骨骼肌共享共同祖细胞。第一鳃弓来源的下颌肌显示与右心室心肌细胞的克隆关系——这种骨骼肌与心肌的紧密关联（58, 61）也由心脏与骨骼肌生成主要上游调控因子重叠的基因表达模式所指示。在小鼠中用遗传学示踪（genetic tracing）追踪曾表达心脏调控基因（如 Islet1）的细胞后代展示该重叠——心脏祖细胞位于弓中胚层核心更远端区域（distal region），骨骼祖细胞延伸更近端（proximal）（图 52.5B），构成同一解剖结构中心脏和骨骼肌祖细胞的位置分布。
头部最前部的肌肉——眼外肌（extraocular muscles）——来源于脊索前颅中胚层（prechordal cranial mesoderm）（图 52.5A 中红色域），与位于脊索两侧的颅/咽中胚层不同。回顾性克隆分析指示眼外肌也与第一弓衍生物显示克隆关系，提示其有双重来源（two origins）：部分来自脊索前颅中胚层，部分与第一弓衍生物共享谱系（文献 61）。鳃弓来源的肌肉（branchiomeric muscles）则来自第一弓（深蓝）或第二弓（浅蓝）的中胚层核心（图 52.5A）。遗传示踪实验显示这些不同肌肉的祖细胞都来自 Mesp1 表达细胞；只有鳃弓肌祖细胞表达过心脏标记基因 Isl1 和 Nkx2.5，眼外肌祖细胞则不表达——这是图 52.5B 揭示的头肌祖细胞分子分界。颈部肌肉由枕部外侧中胚层（紫色）和轴旁/体节中胚层（绿色）共同贡献；舌肌也部分由体节轴旁中胚层贡献（图 52.5A）。头部肌肉的发育与神经嵴（neural crest）紧密相关——后者参与肌细胞定位（positioning）和肌肉团块塑形（shaping），提供头部的结缔组织成分，神经嵴的作用贯穿头肌发育的整个过程（文献 57）。
头肌肌发生的调控
在头部肌肉中肌生成因子也是必需的，但在鳃弓或眼外肌生成位点差异表达，这些肌肉在对 Myf5/Mrf4 或 MyoD 的依赖性上有差异（图 52.5B）。眼外肌的肌生成决定主要依赖 Myf5 和 Mrf4，不能被 MyoD 补救（MyoD 起次要作用），而鳃弓来源的肌肉依赖 Myf5/Mrf4 和 MyoD。
头颈部非体节肌生成祖细胞的上游调控因子与躯干不同。Pax3 不表达，Pax7 仅在较晚阶段被激活。Pitx2 在这些细胞的上游调控中起关键作用：Pitx2 存在于将形成眼外肌的肌生成祖细胞中；其缺失时这些细胞凋亡，不进入肌生成程序。Pitx2 在较晚阶段的条件性突变损害肌生成基因表达，据推测对 Myf5 和 MyoD 启动子活性有直接影响。Pitx2 也是第一鳃弓中胚层核心中肌生成祖细胞分化和存活所必需的。除下颌肌表型外 Pitx2 突变体还有心脏动脉极畸形（反映这些弓缺陷）以及心脏左/右图案化缺陷导致的其他心脏缺陷。
头肌肌生成早期阶段，鳃弓中胚层核心表达的 T-box 因子 Tbx1 在确保 Myf5 和 MyoD 强激活中起作用；其缺失时肌肉发育不全且常为单侧。喉肌和部分斜方肌下颌肌特别依赖 Tbx1。Tbx1 发育不全表型在 Myf5 也缺失时严重得多——表明 Myf5 正常驱动 Tbx1 非依赖的肌生成方面，而通常补偿 Myf5 缺失的 MyoD 是 Tbx1 依赖的（图 52.5B）。Tbx1 突变体中受影响的头肌亚群与从 Islet1 表达细胞来源的相同（如遗传学示踪所示）。该心脏联系也表现为 Tbx1 突变体胚胎心脏中严重的动脉极缺陷（特别是肺动脉干）。TBX1 涉及 DiGeorge 综合征（患者有心脏和颅面肌缺陷）。
鳃弓肌生成中，b-HLH 转录因子 MyoR（Msc）和 Capsulin（Tcf21）也起特定作用。它们都是第一鳃弓（下颌弓）中 Myf5 激活所需——该部分产生闭颌肌；其缺失时中胚层核心中细胞死亡发生。Pitx2 在控制增殖和存活上遗传学上位于 Msc 上游（图 52.5B）。Six1/4 在颅肌生成中表达：斑马鱼鳃弓发育中 Six1 在 Myf5 后被激活且似乎是 Tbx1 非依赖的，也遗传学上位于 MyoD 上游。肌肉分化的下游调控似乎涉及与躯干中相同的因子。
肌生成在头部与躯干中上游调控因子的显著差异也见于信号通路。已知经典 Wnt 信号激活 Pitx2；但除该潜在作用外，Wnt 信号延迟咽弓中胚层肌发生的起始，促进肌生成祖细胞维持——这可能贡献于头肌肌生成分化的晚起始（头肌依赖于下颌和头部形态发生的复杂过程正确定位）。BMP 激活心肌生成，因此偏向心肌而非骨骼肌细胞命运。FGF 信号（由 Tbx1 调控）在上游调控因子特化后维持肌生成程序必需。头部与躯干肌生成激活程序的差异以及与心脏祖细胞的系谱关系具有有趣的进化含义。头部的发育与神经嵴出现相联系是脊椎动物的特征，头肌因此比躯干肌进化更晚，但肌生成策略可能反映心脏和骨骼肌生成之间的更古老联系。
本章个人批注
本章是 Buckingham 实验室对自己研究领域的一份"地图式综述"——结构非常清晰但叙述密度极高，覆盖了躯干/四肢和头肌两个独立但共享部分调控语言的生肌程序。从信息组织看，本章有意识地按"解剖部位（躯干/四肢 vs 头）+ 调控层次（转录因子 vs 信号通路）+ 时间轴（早期胚胎 vs 胎儿 vs 出生后）"三个轴展开，最后把读者引向"基因调控网络如何在不同解剖位置被同一组因子重新部署"这一统一图景。第一，最值得停下来想的事实是"骨骼肌生成是单一分子程序的多个解剖变体"——MyoD 家族 MRFs 在所有肌生成位点都必需，但它们的上游调控因子（Pax3/7 在躯干/四肢、Pitx2/Tbx1 在头肌）以及协同的信号输入（Wnt、BMP、Shh、Notch、FGF、HGF/SDF1 的时空组合）随位点不同而重新配置。这意味着不同肌病对同一突变反应不同的部分原因就在调控输入的差异——这是引言末尾"不同肌病对同一突变反应差异部分源于调控历史"那句话的真正分量。第二，Pax3/Foxc2 双向抑制这一段格外值得记住——它把"多能祖细胞如何在两个命运间分配"这个抽象问题具体化为一个双向开关，并且把"非肌源性命运（如血管内皮、平滑肌）依赖 Foxc2"这种跨胚层谱系关系以最简单的方式呈现出来。Pax7/Foxc1 在同一框架内进一步支持这一平衡模型。第三，本章对头肌与心脏肌的系谱关联着墨很多——第二弓中胚层核心来源的细胞与右心室心肌共享克隆，第一鳃弓下颌肌与右心室心肌共享克隆，第二心区前部由咽中胚层组成，Islet1 遗传学示踪显示头肌祖细胞曾表达心脏标记——这些观察累积起来暗示"骨骼肌和心肌的边界比教科书呈现的更模糊"，这与 Tbx1 突变体同时表现心脏流出道缺陷和颅面肌缺陷的临床表型（DiGeorge 综合征）直接对应。第四，本章多次回到"基因调控历史决定肌病表型异质性"这一概念——这是一个比单基因-表型模型更有解释力的视角，对肌营养不良这类"同基因型不同表型"疾病的机制研究有指导意义。第五，本章信息密度极高但"信号通路"和"头部肌肉"两节相对其他综述章节更"罗列"——这是因为相关领域实验分散在不同物种（鸡、斑马鱼、小鼠）和不同发育时间点，尚未形成统一图景；这是"快速移动领域"这一章首句的实证。第六，与 chapter 51 风格相比，chapter 52 更接近"教科书章节"（逻辑层层递进、概念定义清晰、图注承载一半信息），chapter 51 接近"研究路线综述"（自传式回顾 + 临床转化讨论）；前者适合教学，后者适合写研究计划。
与上下章的衔接（一段话）
本章紧接 chapter 51（心肌疾病的新治疗靶点与策略）之后，标志 Part II Cardiac Muscle 的结束、Part III Skeletal Muscle 的开启。Part II 的章 1-26（生理、发育、转录调控、信号、代谢、力学、神经支配）建立心脏作为"短跑型收缩单元"的分子-细胞-器官基础；章 27-37（蛋白质量控制、缺血预适应、心肌纤维化、自噬、microRNA、表观遗传、心肌重塑、肥厚、衰竭）建立心脏病理的细胞分子机制；章 38-46（心肌再生、microRNA、microRNA 治疗、长非编码 RNA、祖细胞、干细胞、移植）建立心脏再生与细胞治疗的现状；章 47-51（激酶、心肌细胞移植、化学遗传学、器械治疗、新治疗策略）回到治疗工具箱。从 ch52 开始，Part III 将以同构方式展开骨骼肌主题——按发育（ch52）→ 膜系统（ch53）→ 神经肌肉接头（ch54）→ 神经机械耦合（ch55）→ 钙调控（ch56）→ 兴奋-收缩耦联（ch57）→ 收缩机器（ch58）→ 代谢（ch59）→ 生长调控因子（ch60-62）→ 衰老（ch63 之后）→ 再生（ch70+）→ 病理（ch80+）。Chapter 52 在 Part III 中承担"建立骨骼肌作为'长跑型收缩单元'的发育基础"的角色——把心脏在 ch1-4 中已经建立过的"上游调控因子（Pax/Isl/Tbx 家族）→ 肌生成决定因子（MyoD 家族 MRFs）→ 收缩蛋白执行"这一基本框架复制到骨骼肌，但同时突出骨骼肌的几个独有特征：体节来源（vs 心脏的前心区/第二心区）、卫星细胞系统（vs 心脏的低水平更新）、Pax3/7 的主导上游地位（vs 心脏的 Isl1/Nkx2.5）、以及头肌与心肌共享调控因子的进化联系。Chapter 52 末尾提到"头肌祖细胞曾表达 Islet1/Nkx2.5 等心脏标记"这一观察预告了 Part III 中后续涉及心脏-骨骼肌跨界调控的章节（如 ch60s 的生长因子部分可能再次回到这一联系）。