第 46 章：心脏基因治疗（Cardiac Gene Therapy）

引言、非病毒载体与递送系统总论（Introduction, Non-Viral Vectors, and Delivery System Overview）

本章由 Roger J. Hajjar 撰写，背景是 Mount Sinai 医学院心血管研究中心。作者指出，再生医学在治疗心力衰竭、难治性心肌缺血和功能障碍等常见心血管问题方面已显现出可观潜力，而心脏的解剖学分隔性（anatomical compartmentalization）以及它对外科和经皮入路的可及性，使心肌成为基因治疗高度可操作的目标系统。近二十年对心衰分子机制理解的不断深化，加之新一代更安全的基因递送载体的开发，推动了心血管疾病基因治疗的整体进展。本章聚焦于通过基因转移调控心功能的若干新策略。

作者开篇即点出三件决定递送方案选择的根本问题：其一，靶细胞占比问题——为获得全局性基因递送并对心功能产生正向影响，需要成功修饰的心肌细胞在靶组织中占多大比例？其二，基因转移技术的效率与递送方式——这两个因素共同决定心肌细胞的实际修饰率；其三，目标疾病的自然史决定转基因表达的时序要求——对瞬时表达的需求（如血管生成因子的治疗性血管新生）只需质粒介导的短暂递送即可，但对心衰这类不可逆的病理过程，则要求持久、广泛的转基因表达。作者强调，对心肌这类以肌组织为基础的病理状态，低效且瞬时的基因转移并不足以奏效。

基因递送系统可分为非病毒理化系统和重组病毒系统两大类。非病毒系统的优势在于制备简便、对表达盒（expression cassette）大小限制少、生物安全风险相对低；其短板是转染效率低，且表达产物易被胞内降解而呈瞬时性。病毒系统则具有相对较高的基因转移效率，整合型载体还具备长期转基因表达的能力；其不足包括包装容量有限、不同批次间生物活性与纯度的不一致、以及生物安全风险（可复制型病毒产生、病毒基因产物毒性、整合型载体的插入诱变）。四种最成熟的病毒载体系统将在下文讨论。其他病毒系统（如基于单纯疱疹病毒 HSV-1、塞姆利基森林病毒 SFV、杆状病毒、痘苗病毒、泡沫病毒等）的临床前应用因固有的重大局限或缺乏对成熟基因转移技术的推进，短期内预计不会扩大。表 46.1 列出了心血管基因转移中最常用的三种载体及其优缺点比较（基因组类型、插入容量、整合特性、表达模式、宿主-载体相互作用、是否已有获批临床试验）。

非病毒载体可大致分为质粒 DNA、脂质体-DNA 复合物（lipoplexes）和聚合物-DNA 复合物（polyplexes）三大类。寡核苷酸及其类似物（单独或以复合物形式）也属于非病毒载体的范畴。相当数量的人类心血管基因治疗方案以质粒介导的基因转移为基础；尽管心肌质粒介导的基因转移效率偏低，但已被多项治疗性血管新生试验作为载体平台——在此场景中，少量细胞短暂分泌的血管生成因子足以产生所需的表型效应。然而，对于多数基于肌组织的心脏病理状态，低效且瞬时的基因转移则难以奏效。合成寡核苷酸用于调控生物系统中的基因表达具有巨大的研究与治疗潜力。治疗性寡核苷酸有反义分子、转录因子诱饵（decoy）、催化性寡核苷酸和嵌合寡核苷酸（chimeroplasts）等多种形式，每一类在心血管疾病模型中均有探索。除非病毒载体的一般局限外，寡核苷酸还受生物半衰期短、与非预期序列发生非特异性结合等问题制约。脂质体-DNA 复合物在体外转染效率较高，但在体内针对血管内皮细胞（血管内递送后）和心肌细胞（直接心肌注射后）的表现则较差，具体局限包括体内性能差、血清中不稳定、血管内递送后清除迅速。

近年来，可降解聚合物纳米颗粒被开发用于基因递送。聚（乳酸-羟基乙酸）共聚物（PLGA）等羟基酸聚合物能够在较长时间内持续释放 DNA 物质；PLGA 经非酶水解为乳酸和羟基乙酸（人体正常代谢产物），最终降解为 CO₂ 和水。PLGA 已获 FDA 批准，广泛用于多种人体应用。纳米颗粒非常适合基因递送：核酸载荷量大，可规避标准腺病毒转染的安全风险。但常用非病毒聚合物载体（如 PLGA 和聚乙烯亚胺 PEI）的转染效率通常很低。为解决此问题，Langer 课题组开发了由末端修饰的聚（β-氨基酯）（poly(b-amino ester)）制成的可降解聚合物纳米颗粒——合成简便，可通过组合修饰在很宽范围内调整递送与降解性能以优化效果。这类聚（β-氨基酯）能与 DNA 结合并自组装为直径约 150 nm 或更小的稳定纳米颗粒，有效进入细胞并从内体逃逸，经主链酯键水解而降解。但这些递送系统尚未在血管内或心肌中测试。

腺病毒与腺相关病毒（AAV）载体（Adenoviral and AAV Vectors）

病毒载体在临床前基因治疗模型中的主导地位反映了它们在基因转移效率上的优势——这种效率源于载体保留了亲代病毒生物学元件以保证转入基因的命运。重组人腺病毒载体是临床前基因治疗模型与心血管基因治疗临床方案中最常用的载体。其优势包括：相对易于生产、可达到较高的功能性载体滴度、靶细胞趋向性广（尤其在心血管系统内）。所有主要心脏细胞类型均可在体外和体内被腺病毒载体高效转导。在体内实验中，心肌转导的模式反映了递送方式——例如直接心肌注射在注射部位产生强烈转导，而冠状动脉内递送则呈现注射血管分布范围内的较广泛转导。腺病毒借 coxsackie 腺病毒受体（CAR）整合入细胞，β-整合素也参与此过程。近期研究表明，β-整合素的减少是老化心肌细胞中腺病毒基因转移效率下降的原因。数种操作已被证实能增强冠状动脉内递送后腺病毒载体对心肌的基因转移效率：物理方法包括依赖导管或手术诱导的跨冠脉压力梯度以增加对心肌的基因递送，或借助超声能量分散流经心肌的循环载体。血管系统的靶细胞还包括血管内皮和平滑肌细胞；在完整内皮存在下，血管内递送腺病毒载体会优先转导内皮细胞；平滑肌细胞则仅在血管损伤后才能被中等效率地转导。腺病毒载体是非常有用的研究工具，但从研究向临床的转化面临多重挑战——其广泛认可的限制是激发的强烈免疫与炎症反应，限制了表达持续时间。在动物模型中，腺病毒载体还可引起心肌与血管炎症、内皮细胞功能障碍、血管增殖和血管内血栓形成。重组腺病毒载体即便从远端器官递送也容易感染肝脏。提高腺病毒载体生物安全性的方法包括：逐步减少载体中亲代病毒基因（目前的"剔空型"gutted 腺病毒载体已几乎不含病毒基因），以及通过工程化改造纤维外壳蛋白以修饰载体趋向性、避免转导抗原递呈细胞等非预期细胞、增加对靶细胞的基因转移效率。

重组腺相关病毒（rAAV）载体来源于依赖性细小病毒 AAV2 型，具有多项临床有利的属性：亲代病原体无致病性、载体相关细胞毒性低、免疫原性极小、并能通过基因组整合和/或稳定的染色体外维持实现长期转基因表达。这些载体对横纹肌具有趋向性，能在免疫活性宿主的骨骼肌和心肌中提供稳定长期的转基因表达。rAAV 载体系统的主要局限包括：高滴度、一致纯度与生物活性载体的大量生产、4.8 kb 的有限包装容量、人群中可能预存的中和抗体。AAV 具备多项特别适合作为心脏靶向基因转移载体的特性：第一，AAV 能高效转染缓慢或非分裂细胞，是心肌细胞基因转移的理想载体；第二，AAV 已知不引起人类疾病，对患者、医务工作者和公众的风险低；与腺病毒载体不同，AAV 制造的载体不含任何病毒基因，进一步提高了安全性——这种无病毒基因的特点使细胞免疫反应不太可能被载体所激发，从而允许载体在细胞中长期存在并表达转基因。一项在肌肉内注射表达 FIX 因子转基因的 AAV2 试验中已证实长期表达（>4 年）；但同一剂量（同为 ≤1.4 × 10¹⁴ vg（DRP）/患者）经肝动脉给药于血友病患者时，仅观察到 FIX 的短期表达。AAV 载体在广泛的物理与化学条件下保持稳定。

已知存在 12 种不同的 AAV 血清型（AAV1-AAV12），各有不同的组织趋向性。AAV1 已被证实能高效转导骨骼肌和心肌。某一试验中使用的假型 AAV2/1 含有 AAV1 的衣壳序列和 AAV2 的反向末端重复（ITR）序列；之所以选择 AAV2/1 载体，是因为 AAV1 已被证实是已知血清型中转导心肌细胞最优秀的。AAV2 ITR 被纳入是因为它们已在许多既往临床试验中使用，安全性已建立。AAV 载体已在数百例患者中研究，总体显示出优秀的安全性。近年来，AAV8 和 AAV9 两种新型 AAV 载体对心肌组织显示出极强的趋向性，因此对心肌疾病的靶向治疗具有重大前景。AAV 载体包装单链基因组，需要宿主细胞合成互补链才能完成转导。但当基因组为野生型大小的一半时，AAV 可包装两个拷贝或二聚体反向重复 DNA 分子（scAAV）。二聚体或自互补分子能自发重新退火，免除了宿主细胞 DNA 合成的需要。Samulski 及其同事在北卡罗来纳大学工程化了这种载体，发现 scAAV 比传统单链载体产生更快、更高水平的转基因表达。这些新型 scAAV 载体代表了 rAAV 转导的生化中间体，应能提供对载体转导生物学的新洞见。但其盒大小须为正常单链载体的一半（即 2.3 kb），进一步限制了可与 scAAV 配合使用的基因数。虽然 AAV9 全身递送在心脏中达到的高表达水平令人鼓舞，但转基因在其他器官（尤其肝脏）的表达令人担忧。将转基因表达限制于心脏无疑对临床应用有益。实现心脏特异性表达的一种方法是使用心肌细胞特异性启动子；但更理想的是通过将载体本身靶向心脏——载体靶向可能允许使用比非靶向 AAV 更低的载体剂量。输注较低剂量不仅在生产角度更可取，更关键的是对患者更安全。已知嵌合病毒（由多种血清型衣壳蛋白组成的病毒颗粒）呈现不同的转导谱；由多种血清型衣壳蛋白杂合构成的病毒应能产生独特的趋向性。为鉴定能在体内选择性转导心肌细胞的杂合病毒，作者采用了组合方法：将通过 DNA shuffling 产生的多种 AAV 变异体库与"生物纳米颗粒（BNPs）"——即通过定向进化富集的心肌趋向性 AAV 变异体——相结合。

整合型病毒载体、表达盒设计与靶向核酸酶（Integrating Vectors, Expression Cassette Design, and Targeted Nucleases）

基于 Moloney 鼠白血病病毒（MoMLV）的逆转录病毒载体于二十年前开发，已广泛用于临床前模型，并于 1989 年首次进入人体临床试验；最近在 X 连锁重症联合免疫缺陷病（X-SCID）的法国基因治疗试验中获得成功。逆转录病毒载体的主要局限是无法转导非分裂细胞且载体滴度低。由于需要细胞分裂，已分化的心肌细胞和静息细胞群（如完整血管内皮与平滑肌细胞）无法被这些载体高效转导。因此，许多研究者求助于在体内诱导靶细胞增殖或采用体外策略。由于这些限制，该载体系统在心血管模型中的使用已大幅下降，而能够转导非分裂细胞的腺病毒载体和其他整合型载体（rAAV 和慢病毒载体）的使用则相应增加。

最近，法国 X-SCID 试验中 10 名儿童中有 3 名发生了直接归因于前病毒整合位点基因失调的恶性克隆性 T 细胞增殖。整合型载体使用带来的插入诱变风险此前曾被认为极小——这一观点现在需要修正。作为这一事态的结果，整合型载体设计出现了新的兴趣以改进生物安全性：自失活（self-inactivating）载体的使用、绝缘子序列的引入、以及对基因组整合位点的靶向，是降低插入诱变风险的潜在手段。

慢病毒载体与基于 MoMLV 的逆转录病毒载体类似，通过基因组整合转导靶细胞；与逆转录病毒载体不同的是，它们能够转导有丝分裂静止细胞——这一特性扩大了靶细胞范围，在心血管系统中尤其重要。最常使用的慢病毒载体系统基于 HIV-1。对亲代病毒致病性的关切推动了非人源慢病毒载体系统的探索。针对 HIV-1 来源的当代慢病毒载体的生物安全顾虑的载体改造包括：从包装系统中删除所有附属蛋白基因、将包装元件分拆到多个质粒、以及在载体质粒中使用嵌合的 5' 长末端重复（LTR）和自失活的 3' LTR。这些改造几乎消除了通过重组产生可复制型病毒的风险，并使前病毒 LTR 在转录上失活——这一特征降低了由整合位点附近宿主细胞基因的转录激活所引起的插入诱变概率。载体主链的优化改造包括纳入中央嘌呤束（cPPT）和转录后调控元件（PRE），分别增强核输入和 mRNA 翻译。这些改造已被报道能提高体内转导效率，包括成熟心肌。在未损伤血管中，慢病毒载体的直接体内血管内递送能转导内皮与平滑肌细胞；但这些研究未包括血管壁转导效率的测定。这种相对新型载体系统在临床前模型中的实验应用正迅速扩展，其在人体基因治疗中的潜在应用尚未被探索。其优势包括能提供长期稳定的转基因表达、可经 VSV-G 假型化后通过简单离心浓缩、与 rAAV 相比具有更大的包装容量。其主要局限涉及上述生物安全性。

预计当前的基因转移系统将被混合系统所取代——混合系统结合了非病毒系统的简便与安全性以及病毒载体的理想特性。病毒体（virosomes）是此类混合系统的例子，其中日本血凝病毒（HVJ）-脂质体在心血管基因治疗模型中研究最为深入。该混合载体在基于寡核苷酸的基因治疗模型中尤其有用。其临床应用仍待载体生产问题（包括稳定性）以及大动物模型中疗效与安全性评估的解决。

表达盒的基本元件包括启动子/增强子元件、目的基因和适当的 mRNA 稳定化多聚腺苷酸化信号。其他常用的顺式作用元件包括：允许两个或多个基因在无额外启动子下表达的内核糖体进入位点（IRES）序列；以及用于提高转基因表达的内含子和转录后调控元件。其中，启动子选择受到了文献的最大关注。基因治疗模型通常使用含有强病毒启动子的表达盒，这些启动子在广泛的细胞类型中呈组成型活化。出于若干原因，由此产生的基因表达模式对多数临床应用不太可能是最佳的。转基因表达的时空调控可通过启动子的选择实现。组织特异性启动子可用于将转基因表达限制在所需靶细胞群，避免非预期细胞（如抗原递呈细胞）。例如，心肌细胞特异性启动子如 α-肌球蛋白重链已被用于将基因表达限制于心肌。同样，平滑肌特异性启动子 SM22α 也已被证实能将基因表达限制于此类型细胞。在许多情形下，需要对体内治疗性基因表达进行精确调控。天然和合成的增强子-启动子可被利用，以热休克、缺氧、辐射、化疗或表观遗传剂等时空或环境信号诱导的方式驱动基因转录。为实现紧密调控的表达，也可使用可调控的基因表达系统。多数此类系统基于对小分子（药物）响应的人工反式激活因子。利用生理学调控的系统可设计为：启动子转录活性依赖于目标病理生理学所提供的信号。缺氧、血管内剪切应力和左室应变都已被用于此类调控的模型。在心衰情境下，如果需要短期开启或关闭目标基因，可调控系统将非常重要——这包括驱动血管生成或干细胞募集/扩增的基因。

巨核酸酶（meganucleases）和锌指蛋白可被工程化以在特定 DNA 序列诱导双链断裂。这些断裂由同源重组或非同源末端连接修复，导致数个碱基对的插入或缺失。它们随后可用于恢复具有特定突变的基因的正常阅读框。同样，工程化的锌指蛋白转录因子可特异性激活或抑制几乎任何基因。巨核酸酶和锌指蛋白已被用于通过基因转移靶向 dystrophin 突变和 VEGF 表达。随着扩张型和肥厚型心肌病中遗传突变的不断扩展，这些核酸酶未来可用于通过基因治疗在受影响器官中修复 DNA。

递送方法：前向注射、V-Focus、逆行、直接与心包（Delivery Methods: Antegrade, V-Focus, Retrograde, Direct, and Pericardial Routes）

除载体工程的重大进展外，近二十年来也见证了基因递送新策略的开发。导管技术已被用于通过前向冠状动脉内注射、逆行冠状静脉输注和直接心内膜或心包注射靶向心肌。本节侧重于临床前模型的递送方法。外科递送至心肌或心包在特定临床情境下也可能是首选途径。无论采用何种递送方法，已使用包括血管扩张剂和渗透剂在内的化学方法以促进载体从血管腔向心肌的转移。事实上，许多增加血管床通透性的药物已在临床前试验中使用，包括硝酸甘油、硝普钠、5-羟色胺、缓激肽、组胺、P 物质和 VEGF。在临床上和心衰情境下，这些药物必须谨慎使用以避免降低全身血压。

前向冠状动脉内注射是将载体递送至心肌最直接的方法，具有将载体均匀递送至整个心肌的潜力。前向冠状动脉注射有多种技术：(1) 不阻断冠状动脉的前向注射——这种简单但有效的技术最适合 AAV 载体，无血流阻塞，对可能无法耐受冠状动脉阻断的心衰患者是一种优化方法。尽管该方法不能感染所有心肌细胞（约 60% 的心肌细胞），但它遵循冠状动脉内正常血流模式，并已被证实能改善大动物心衰模型的室功能。这是严重心衰患者接受 AAV1.SERCA2a 临床治疗时所使用的方法。(2) 阻断冠状动脉的前向注射——在球囊阻断冠状动脉血流的同时向球囊下游注射，使病毒载体可在不被稀释的情况下流动；但阻断前向血流即使在短时间内也可能不耐受。(3) 循环灌注技术（V-Focus 系统）——V-Focus 系统是最近开发的允许靶向递送基因治疗的新型灌注技术。它允许通过微创经皮入路在心肌建立局部灌注，将冠状动脉循环与全身循环实质性隔离开来。该技术旨在将所选基因治疗药物几乎专门地投送并吸收至心肌，最大限度地减少治疗药物向全身循环的暴露。唯一不可避免的循环损失发生在通过 Thebesian 静脉（其直接与心腔而非冠状窦相通）的途径——在多数患者中，这些血管的血流量不到冠状动脉总循环的 10%。心循环通过左和/或右冠状动脉供给，经冠状窦回到全身循环。V-Focus 系统能在冠状动脉与冠状窦之间经皮建立闭合环路，选择性隔离并循环冠状动脉循环内的基因转移药物。在循环过程中通过膜式氧合器（ECMO）维持心肌充分氧合。一旦建立闭合环路，载体即被直接注入环路中，在心肌中循环约 10 分钟。该技术已使腺病毒和 AAV 基因转移在绵羊心衰模型中实现 SERCA2a 的广泛转导并使收缩力实质性增加。V-Focus 系统由两根用于右和左冠状动脉灌注的标准经皮介入导管、一根专有的冠状窦回收导管（CPB）元件（带注入歧管的氧合器）、灌注滚压泵、回路压力监测器以及血液温度控制模块组成。增加血管床通透性的药物如 P 物质、组胺或血管内皮生长因子已成功用于提高该技术的转导效率。

(a) 经冠状窦的逆行递送——使用冠状静脉作为递送治疗物质的路径在临床上尤其具有吸引力，尤其在患者具有病变冠状动脉时。该路径通过使用专门装置的压力调节逆灌注已实现效力提升。然而，简单的冠状静脉系统闭塞后进行逆行注射的病毒分布由于前向流压力的影响而有限。为实现病毒的广泛分布，必须同时闭塞冠状动脉以消除前向流压力的影响。使用逆行流的优势在于：在冠状动脉疾病患者中前向注射可能导致流动和表达不均时，逆行流无此障碍。该逆行方法已被许多研究者有效用于大动物模型。然而，该方法在不能耐受冠状动脉阻塞的患者中可能存在一些问题。(b) 经导管装置（TransAccess/IntraLume）——复合导管系统（TransAccess）整合了相控阵超声头端用于引导和一根可伸缩的镍钛诺针用于经血管心肌入路，从冠状窦逆行前进。微型输注（IntraLume）导管通过针头深入到远端心肌，自体细胞-水凝胶悬液被注入正常心脏。这允许将载体直接递送至经冠状窦可达的特定心肌区域。

载体直接注入心肌可通过外科或经皮途径实现。它克服了血管内路径可能遇到的多个潜在缺陷，包括肝和脾的"首过效应"、中和抗体的作用、T 细胞反应和内皮屏障的不可渗透性。外科基因转移可通过剑突下或经胸入路进行，在心肌容易接近时（如心胸外科手术期间）是一种有吸引力的入路。基于导管的心内膜内针注射可在多种导管类型和不同引导模式（包括透视、电磁和 3D 标测系统）下进行。最近，已开发出一种允许在原位完全手术隔离心脏同时逆行（经冠状静脉循环）投送载体和内皮渗透剂以提高心肌细胞转导效率的外科手术。外科和经皮入路均因注射区域受限以及心肌注射部位的泄漏而具有有限的载体递送局限。动物模型中的外科递送通常涉及开胸手术——在低温下停跳心脏，或在啮齿动物模型中夹闭主动脉和肺动脉，或在大动物模型中将动物置于体外循环。在体外循环下，病毒载体可经前向或逆行方式递送。最近，Bridges 等人开发了一种原位完全手术隔离心脏并逆行投送载体的方法，产生了非常高的心肌细胞转导效率。但对晚期心衰患者是否能耐受此类用于基因转移的手术尚不清楚。

心包囊是一个紧邻心肌的闭合腔，可经外科和经皮途径接近。该腔内的载体优先转导心包细胞而心肌表达极少。经皮心包入路允许安全有效的心包入路用于治疗药物的递送。最佳递送方法在很大程度上取决于待基因修饰的靶组织比例。局部转导可能适合挽救缺血区域，而弥漫性基因表达更可能逆转全心功能障碍。

靶向 β-肾上腺素能系统（Targeting the β-Adrenergic System）

过去 20 年见证了我们对心衰病理生理学在分子和细胞层面理解的显著进展，扩大了基因治疗可用的干预范围。本部分讨论针对恢复衰竭心肌细胞功能的一些最重要的系统。为验证靶点，重要的是它们在动物模型中能挽救心衰已建立时的功能、这种挽救不伴有心律失常发生、并能建立基因剂量效应——即随目的基因表达的增加，功能也有相应的改善。

心肌 β-肾上腺素能受体（β-AR）主要为 β1 亚型，与刺激性异源三聚体 G 蛋白（Gs）偶联，Gs 刺激腺苷酸环化酶（AC）产生第二信使环磷酸腺苷（cAMP）。cAMP 通过涉及第三信使蛋白激酶 A（PKA）的一系列细胞内信号起作用，PKA 反过来磷酸化许多靶点——包括肌钙蛋白-I 和 L 型 Ca²⁺ 通道——这些都是 β-AR 刺激的生理效应的媒介。心肌中也有 β2 受体（虽丰度较低），它们也与 Gs 偶联，还与抑制性 G 蛋白（Gi）偶联，Gi 负责抑制腺苷酸环化酶。β2 受体被认为与 Gs 偶联更强，但在心衰中它们对 Gi 的效应增加。慢性心衰与增加的交感神经传出相关。虽然这起初看似代偿机制，但长期而言则更为有害。β-肾上腺素能系统受到多重改变的影响，包括 β-AR 下调、β-AR 激酶上调以及 Gi 功能增强。这些改变导致 β-AR 脱敏及其信号通路的信号传导减少。

多项基于基因的实验检验了心肌 β-AR 系统的基因操纵可增强心功能的假说。β-AR 过表达最初被作为克服 β-AR 下调的简单方法进行测试。过表达人 β1-AR 的转基因小鼠出现严重心肌病——这一发现强化了β-AR 下调是衰竭心脏保护机制的假说。相反，心脏过表达 β2-AR 的小鼠表现出基础心肌腺苷酸环化酶活性增加伴左室功能增加。对不同程度 β2-AR 过表达的转基因小鼠的研究表明，心脏能在长达 1 年时间内耐受 60 倍 β2-AR 过表达带来的增强的收缩功能而不发生损害，且更高水平的表达导致侵袭性或延迟性纤维化心肌病。基于这些提示 β2-AR 增强有潜在益处的发现，腺病毒介导的 β2-AR 基因递送在更大动物中进行了研究。含人 β2-AR 转基因的腺病毒在兔中经直接和冠状动脉内心肌递送均导致心功能增强。

活化的 β-AR 与 G 蛋白之间的相互作用受激酶调节——激酶通过磷酸化受体羧基端调节受体活性。激动剂依赖性的脱敏由 GRKs 家族介导，后者磷酸化激动剂占用的受体，导致功能性失偶联。GRK2 是心脏中表达最高的 GRK。它已被牵涉于病理性心肌 β-AR 信号转导中，是衰竭心脏中的有害活动。关于消除 GRK2 活性的结果在文献中存在争议。然而，最近使用小鼠（心衰由心肌梗死诱导）的研究显示，梗死后 10 天选择性消融 GRK2 增加了生存率、阻止了心室重构并增强了心肌收缩性能。一种称为 βARKct、能抑制 GRK2 介导的 β-AR 脱敏的肽已在动物体内被评估。在兔中诱导心肌梗死后 3 周使用冠状动脉内腺病毒介导 βARKct 转基因递送的研究证明了心室功能障碍的显著逆转。

虽然用 β-肾上腺素能系统多个元件改善 cAMP 表达的尝试均显示了有害结果，AC VI 型（AC VI）的激活似乎具有独特的有利特性。转基因小鼠中 AC VI 过表达导致对肾上腺素能刺激的心功能反应改善和分离心肌细胞中 cAMP 产生增加。重要的是，AC VI 对基础心功能具有中性效应，不与任何结构性心脏异常相关。这与 β-AR 或 Gs 基因转移后 cAMP 持续增加和心脏不良结果形成对比。在急性心肌梗死小鼠模型中增加 AC VI 表达降低了死亡率并保存了左室收缩力。除改善 cAMP 生成外，该研究中 AC VI 的表达还与对 Ca²⁺ 处理的有利效应相关。在猪的起搏诱导心衰模型中，冠状动脉内递送编码 AC VI 的腺病毒导致左室功能和重构的改善，与 cAMP 生成能力增加相关。AC VI 在临床前研究中的有利效应令人鼓舞，该方法目前正在被研究以启动心衰患者的临床试验。尽管文献中存在一些争议，有大量临床前研究明确表明靶向 β-AR 系统的基因治疗在治疗心衰中具有治疗价值。在更多研究尤其是临床试验进行之前，靶向 β-AR 系统被视为有前途的领域。

靶向 Ca²⁺ 循环蛋白（Targeting Ca²⁺ Cycling Proteins）

Ca²⁺ 在心动周期的收缩和舒张期扮演关键角色。Ryanodine 受体（RyR）是连接心肌细胞 T 小管与肌浆网（SR）的蛋白。在被称为"Ca²⁺ 诱导的 Ca²⁺ 释放"的过程中，去极化激活 T 小管的电压门控 L 型 Ca²⁺ 通道使 Ca²⁺ 进入心肌细胞。Ca²⁺ 到达 RyR 蛋白，改变其分子构象，进而打开 SR 的 Ca²⁺ 释放通道，将 Ca²⁺ 释放入胞质。该过程大幅增加胞质中 Ca²⁺ 浓度，使其能与肌钙蛋白 C 相互作用触发收缩过程。舒张发生在 Ca²⁺ 从肌钙蛋白 C 解离、并被 SR 通过肌浆/内质网 Ca²⁺ ATP 酶（SERCA）摄取，或经肌膜 Na⁺/Ca²⁺ 交换体（NCX）从心肌细胞排出时。在人类中约 75% 的 Ca²⁺ 由 SERCA 移除。该蛋白是一种 Ca²⁺-ATP 依赖性泵，存在于 SR 膜上并伸入胞质。它存在不同同工型，其中 SERCA2a 是心肌中的主要形式。该泵每用一个 ATP 将两个 Ca²⁺ 跨 SR 膜转运。相比之下，NCX 每消耗一个 ATP 移除一个胞质 Ca²⁺（Na⁺-K⁺-ATP 酶用一个 ATP 泵出三个 Na⁺，这些 Na⁺ 已被 NCX 介导的 Ca²⁺ 内流被动交换入细胞）。受磷蛋白（PLN）是参与 SERCA2a 活性调节的蛋白。在其非磷酸化形式，PLN 可抑制 SERCA2a。相反，PLN 的磷酸化解除其抑制效应，导致 SERCA2a 活性增加和 Ca²⁺ 处理改善。蛋白磷酸酶 1（PP1）是一类在 PLN 心脏去磷酸化中具有主要作用的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。特别是，β-肾上腺素能轴的刺激诱导磷酸酶抑制剂蛋白-1（I-1）的磷酸化，导致 PP1 抑制和心肌收缩功能增强。心衰以多重 Ca²⁺ 处理蛋白缺陷为特征，伴有 SR Ca²⁺ 加载和释放的受损。通过基因治疗技术逆转这些缺陷已显示出非常令人鼓舞的结果。

一致降低的 SERCA2a 活性已在衰竭人类心脏中被确认。SERCA2a 基因转移后短期心收缩力改善已在心衰大鼠中证实。更重要的是，通过冠状动脉内递送携带 SERCA2a 的 AAV 实现 SERCA2a 的长期过表达与心衰猪容量超负荷模型中收缩功能的保存和心室重构的改善相关。心衰中 SERCA2a 活性降低由心肌细胞将 Ca²⁺ 通过 NCX 排至胞外空间的增加所代偿。NCX 消耗的能量是 SERCA 摄取同量 Ca²⁺ 所用能量的两倍。心衰中改变的 SERCA2a/NCX 活性比可导致兴奋-收缩偶联期间能量消耗的有害增加。在糖尿病继发心衰的大鼠中，SERCA2a 基因转移被显示可将左室收缩力氧耗降至正常水平，同时恢复正常的收缩和舒张功能。虽然 β-肾上腺素能激动剂以增加能量消耗和死亡率为代价改善收缩力，SERCA2a 过表达是通过优化心脏机械-能量状态来改善死亡率的非常有前途的方法。一项用 SERCA2a 基因转移治疗扩张型心肌病的首次人体临床试验正在进行中，将在本章最后一节讨论。

改善 Ca²⁺ 处理的另一种方法涉及 PLN 抑制。PLN 消融的报告结果不一致——从心功能恶化到心肌收缩力和 Ca²⁺ 稳态恢复。在绵羊心衰模型中沉默 PLN 表达导致 SERCA 活性改善以及左室收缩和舒张功能改善。此外，用编码 PLN 反义序列的腺病毒感染人心肌细胞显示收缩和舒张速度的改善，与 SERCA2a 基因的腺病毒转移所见获益类似。除上述常规基因治疗策略外，RNAi 治疗首次用于心脏病模型——具体为心衰大鼠中——试图抑制受磷蛋白表达。rAAV-RNAi 载体在心衰大鼠中产生心脏的稳定调控 RNA 序列，该序列继而抑制受磷蛋白表达。SERCA2a 蛋白随后增加，伴随心脏收缩和舒张功能的恢复。

心衰与人类 PP1 活性升高相关，导致 PLN 的去磷酸化。PP1 过表达或 I-1 消融在小鼠心脏中与 β-AR 介导的收缩反应降低、心功能抑制和与心衰一致的过早死亡相关。转基因小鼠中组成型活性 I-1 的表达导致 PP1 抑制伴 PLN 磷酸化增加和心肌收缩力改善。最近一项在表达活性 I-1 转基因小鼠中进行的研究证实了 PLN 磷酸化与 SERCA2a 活性之间的关系。I-1 表达通过减小梗死面积和改善收缩恢复（同时减少凋亡生物标志物和 ER 应激反应）改善了缺血/再灌注损伤。S100 是参与细胞内外调节活动的钙调节蛋白多基因家族。S100A1 是心脏中含量最丰富的 S100 同工型。它通过增强 RYR 和 SERCA2a 的活性促进心肌收缩和舒张功能。S100A1 在转基因小鼠中缺失与对急性 β-肾上腺素能刺激（异丙肾上腺素注射）的收缩反应降低相关，并与对通过胸主动脉缩窄的慢性压力超负荷的收缩功能的快速恶化相关。在大鼠冷冻梗死心衰模型中，rAAV6 介导的 S100A1 长期表达导致左室功能障碍和重构的持续在体内逆转。此外，该模型在与药物性 β-AR 阻断（美托洛尔）比较和联合应用时显示出叠加性有益效应——这一特征具有高度临床相关性，提示两种治疗最终可对心衰具有叠加效应。最近，Most 等人显示 S100A1 的基因转移在心衰临床前模型中引起显著而长期的有益反应。

临床试验、靶向细胞死亡与免疫反应、结论（Clinical Trials, Cell Death, Stem Cell Homing, Immune Response, and Conclusion）

凋亡是参与正常器官发育的程序性细胞死亡过程。在急性缺血/再灌注模型中，转基因小鼠中抗凋亡蛋白 Bcl-2 的过表达降低了心肌细胞凋亡率并改善了心功能。Ca²⁺ 处理的调节也作为限制凋亡的潜在途径出现。如前节所述，小鼠缺血/再灌注模型中活性 I-1 表达改善了 Ca²⁺ 处理并减少了凋亡，同时抑制了 SR 应激标志物（caspase 12、Grp 78 和肌醇需求酶 1α）。另一方面，β-肾上腺素能系统似乎也是凋亡的重要调节因子。两项在啮齿动物心肌细胞上的不同研究显示，β2-AR 刺激通过 Gi 介导的通路减少凋亡，而 β1-AR 刺激通过 cAMP 依赖机制增强凋亡。

尽管动物研究中的早期结果令人鼓舞，抗凋亡策略在被考虑用于人体试验前面临多重挑战。目前用于估计凋亡细胞死亡率的技术的可靠性仍存在一些不确定性。凋亡所提供的正常细胞调节作用的丧失可能产生恶性细胞增殖和自身免疫损伤的严重风险。虽然缺血/再灌注损伤似乎易于干预，但其他形式的心脏损伤和心衰是否能从抗凋亡策略中获益仍不太清楚。

受损和发炎组织发出信号以吸引干细胞至受损组织已被充分确立——其中许多信号已被识别，包括基质细胞衍生因子 1（SDF-1）。越来越多的证据表明，SDF-1:CXCR4（其受体）轴在心肌缺血损伤后心肌修复的调节中起重要作用。SDF-1 已被显示在心肌缺血后增加，多项研究显示增强梗死周围 SDF-1 水平改善了梗死后心肌重构。目前通过经皮方法将 SDF-1 裸 DNA 递送至梗死周围区域的策略正在临床上被开发利用。

病毒基因转移面临的挑战之一是中和抗体的预存。在不同研究中显示，显著比例的成人对 AAV2（最多 80%）、AAV1（约 50%）、AAV5（约 40%）和 AAV6（约 30%）呈血清阳性。预存抗体的存在对心血管基因治疗有重大影响——因为多项研究已显示这些 AAV 特异性抗体是中和性的，能严重损害该方法的实用性。这些结果突显出必须在患者群中针对所用特定载体测定中和抗体滴度的必要性。细胞可能在其细胞表面瞬时表达 AAV 衣壳蛋白——T 细胞反应可发生在任何器官，但对肝脏或心脏（注射部位）最为关注。该反应具有剂量依赖性——在治疗血友病或脂蛋白脂肪酶缺乏症的临床试验中，较高剂量（>10¹³ 病毒基因组）与衣壳特异性 T 细胞的激活和转基因的消除相关。在临床试验中评估 T 细胞反应潜在发展时，重要的是使用 ELISPOT 试验检测抗 AAV 衣壳 T 细胞反应（当患者外周血单核细胞暴露于衣壳肽时 IFN-γ 释放）。

心衰患者基因治疗的首次临床试验于 2007 年在美国启动。CUPID（Calcium Up-Regulation by Percutaneous Administration of Gene Therapy in Cardiac Disease）是设计用来评估在晚期心衰患者中通过递送携带 SERCA2a cDNA 的重组 AAV1（AAV1.SERCA2a）实现基因转移的安全性和生物效应的多中心试验。试验参与者以开放标签方式接受单次冠状动脉内输注 AAV1.SERCA2a。1-4 队列各 3 名患者连续接受单次剂量递增的 AAV1.SERCA2a。对这些患者的 12 个月随访显示出可接受的安全性。在数名患者中检测到改善，反映在症状（5 名患者）、功能（4 名患者）、生物标志物（2 名患者）和左室功能/重构（6 名患者）参数上。虽然这是涉及少数患者的 I 期研究，早期结果显示 AAV1.SERCA2a 治疗赋予了定量生物学获益。

在 II 期试验中，39 名晚期心衰患者被随机分配接受冠状动脉内腺相关病毒 1（AAV1）介导的 SERCA2a 基因递送（三种剂量之一：低剂量 6 × 10¹¹ DRP；中剂量 3 × 10¹² DRP；高剂量 1 × 10¹³ DRP）或安慰剂。患者的症状（NYHA 分级、明尼苏达心衰患者生活问卷 [MLWHFQ]）、功能状态（6 分钟步行测试 [6MWT] 和 VO2 max）、NT-proBNP 水平和超声心动图指标在 6 个月内被评估。治疗成功由组别和个体比较以及临床结局中上述终点的一致性趋势确定。AAV1.SERCA2a 高剂量组在组别和个体患者水平均达到了预先设定的成功标准。与安慰剂相比，AAV1.SERCA2a 治疗的患者在 NYHA 分级、MLWHFQ、6MWT、VO2 max、NT-proBNP 水平和左室收缩末期容积方面显示出改善或稳定。在所有接受 AAV1.SERCA2a 的患者中观察到裁定心血管事件的时间显著延长以及每位患者心血管事件频率的降低。与安慰剂相比，AAV1.SERCA2a 治疗的患者未观察到不良事件、疾病相关事件、实验室异常或心律失常的增加。此外，在接受单次 MYDICAR 输注 12 个月后，与安慰剂相比，最高剂量治疗的患者在重大心血管事件（死亡、需要左室辅助装置 [LVAD] 或心脏移植、心衰恶化发作次数以及心衰相关住院次数）方面的风险降低了 88%（风险比 = 0.12，P = 0.003）。最近，长期随访的 18 个月 CUPID 数据显示了预防重大心血管事件的持久获益。

目前还有两项其他靶向 SERCA2a 的临床试验正在入组患者。第一项试验在晚期心衰、接受左室辅助装置至少一个月并将在英国接受 AAV6.SERCA2a 或生理盐水的患者中进行。第二项 II 期单中心双盲随机安慰剂对照研究将在法国 Pitié-Salpêtrière 医院进行，主要目标是调查 AAV1.SERCA2a 对严重心衰患者心脏重构参数的影响。

对心衰分子机制知识的增加以及基因治疗技术的改进已导致在大量靶点的临床前测试中的重大投入，最近更在心衰基因治疗 II 期试验的成功完成中达到顶点。现在 AAV 载体在心衰治疗中的安全性已与 SERCA2a 在心衰治疗中的疗效一同建立，该领域已开放用于测试新靶点——这些新靶点用更先进的基于 AAV 的载体系统在药理学上难以调节。总之，许多与心衰相关的分子和细胞机制目前都在基因治疗的范围之内。我们试图总结的大量临床前经验是基因治疗（最初被设想为单基因遗传病的治疗）可靶向获得性多基因疾病（如心衰）的额外概念证明。分子靶点的不断扩展以及基于基因的疗法的创新（如最近 RNAi 策略的使用）是基因治疗可能达到的广泛治疗范围和高效率的有希望指标。在临床前数据继续扩展的同时，我们目前正见证人类心衰基因治疗的诞生。

本章个人批注

Hajjar 写这一章时（2012 年），SERCA2a 基因治疗的临床转化路径已经走到了 II 期——CUPID 高剂量组的 88% 风险降低（HR=0.12, P=0.003）当时是令人激动的数字。但凡读过后续文献的人都知道 CUPID 在 III 期（CUPID2, n=250, NEJM 2015）失败了：主要终点（心衰相关住院或死亡时间）无显著差异（HR=0.93, P=0.81）。作者在此章中的乐观语气是有时代印记的。SERCA2a 路径虽然最终未通过 III 期验证，但它在 2007-2014 年间确实确立了心血管基因治疗在监管和手术路径上的可行性——这个"先驱"贡献是真实的。

我对本章的双栏对照写法特别有共鸣：上半部几乎全是技术、载体、递送，下半部是靶点和临床。这正是一个从 bench 到 bedside 的典型研究综述骨架。值得注意的是，作者在 β-AR 系统小节中既呈现了"过表达 β1 → 心肌病"这种惊吓性阴性结果，又呈现了"过表达 β2 → 60 倍过表达仍能耐受"这种出乎意料的阳性结果——这是一个非常学术化的对照设计，告诉读者基因治疗不像小分子药物那样有可预测的剂量-效应单调关系。单一受体亚型的过表达可能因下游不同 G 蛋白偶联（Gs vs Gi）而走完全相反的表型。

关于 S100A1 那一小节里"与美托洛尔联用有叠加效应"的说法，我对此保持怀疑——原文作者引的 Pleger 2007 是 AAV6-S100A1 单独给药，并未真正做联用设计。这可能是该章的一个过度推论。对未明确引用的"协同/叠加"声明保持谨慎——这是阅读此类综述时的一条护身符。

关于 V-Focus 系统的描述，作者写得相当详细（回路组成、各管线功能、Thebesian 静脉泄漏 < 10%）。这是作者实验室（Mount Sinai / Preovolos / Byrne / Kaye）的核心技术贡献，所以详写并不奇怪，但读者需要意识到这是作者自己的方法学高地，对其客观性应有自然折扣。

另外，本章的 scAAV / self-complementary AAV 解释密度高，但读者需要知道这是一种"以表达水平换装填容量"的策略——scAAV 装填量上限是 2.3 kb，这对 SERCA2a 没问题（其 cDNA 约 1.7 kb），但对很多更大的基因（dystrophin 14 kb）就完全不可行。这是为什么心肌基因治疗首批临床突破都集中于小基因。

最后，作者多次使用"under investigation for initiation of clinical trials"这种被动态语态，给读者一种"马上要进入临床"的暗示——这在 2012 年是事实陈述，但 2026 年回顾看，CUPID 失败后整个 AAV-SERCA2a 路径已大幅降温。这类综述对"即将转化"的乐观语气需要折扣对待。

与上下章的衔接（一段话）

从上下文看，第 45 章（Liggett 关于肾上腺素能受体多态性在心衰中的角色）收束于对 β-肾上腺素能系统的药理学认识——Hajjar 接手后，转向基因治疗这一"绕过小分子药物受体调控"的方法学新大陆。第 45 章讲"现成的药物为什么在不同基因型患者中疗效不同"，第 46 章讲"既然小分子难以调控某些下游环节，就直接换一种递送物质——DNA"——两章共同构成了"心衰分子病理 → 治疗学响应"的纵贯逻辑。下章（第 47 章）按 Hill 这套书的传统是 Protein Kinases in the Heart（蛋白激酶在心衰中的角色），会承接"心衰治疗新靶点"这条线，可能作为基因治疗靶点谱系的另一支（激酶抑制剂药理学，与本章的"直接递送 cDNA"形成方法学对照）。读者把第 44（老化）、45（多态性）、46（基因治疗）、47（激酶）连起来读，会更清楚地看到 Hill 这套书在 Part II（心肌）后半段呈现的"病理-机制-新治疗学"三段式收尾。