第 39 章：哺乳动物心肌再生（Mammalian Myocardial Regeneration）

作者：Bin Zhou（Children's Hospital Boston, Department of Cardiology, Boston, MA；Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China）、Zhiqiang Lin（Children's Hospital Boston；Harvard Stem Cell Institute, Cambridge, MA）、William T. Pu（Children's Hospital Boston；Harvard Stem Cell Institute, Cambridge, MA）

39.1 引言与背景：心肌再生领域的争议与方法学挑战（Introduction: Controversy in Cardiac Regeneration and Methodological Caveats）

每年死于心力衰竭的患者数以百万计，而 HF 在最根本的层面源于心肌细胞数量和功能的不足；典型一次心肌梗死可丢失十亿或更多的心肌细胞（2）。存活心肌细胞在短期内可适应并承担更大工作负荷以维持心功能，但这些适应导致心肌细胞功能障碍和额外的细胞死亡，形成"超负荷心肌病"（cardiomyopathy of overload）的恶性循环（3,4）。目前 HF 治疗旨在中断维持这一恶性循环的神经体液因素，从而缓解但不能逆转进行性 HF。根本改变 HF 自然史需要生成新的心肌细胞。长久以来学界接受"哺乳动物心肌细胞仅在胎儿期生成（cardiogenesis）"的教条，认为出生后心脏的生理或病理性增大源于心肌细胞肥大（hypertrophy，即细胞体积增大）而非增生（hyperplasia，即细胞数量增多或祖细胞分化）（5）。过去十年间突破性研究挑战了这一教条，证明成年哺乳动物心脏确实具有——尽管有限——内源性再生能力。这一发现促使研究者尝试增强心脏天然再生机制。本章将批判性地综述成年心脏内源性再生能力的研究，而外源细胞群体移植用于治疗性心肌再生的广泛文献则不在本章范围之内（2,6）。心肌再生领域充斥着争议和看似矛盾的结果，这种局面的根源是测量新生心肌细胞的技术局限——读者需要了解这些技术挑战、克服挑战的方法以及方法的局限，才能最好地把握该领域快速增长的文献。

39.2 正常心肌生长与细胞周期活动（Normal Myocardial Growth and Cell Cycle Activity）

胎儿心肌通过心肌细胞增殖生长。出生后心肌细胞分裂在大鼠生后 3 天基本停止（7），其后心肌细胞数目恒定但细胞体积在第 3 至 12 天之间增大 2.5 倍，表明出生后心肌生长主要通过细胞体积增大完成。DNA 合成是细胞增殖的标志，因此心肌细胞 DNA 合成被广泛研究（8）。在啮齿类，DNA 合成在出生后第 10 天（P10）达高峰，P20 时降至成年水平（7,9）。P3 至 P12 期间，心肌细胞不再进行胞质分裂（cytokinesis）但继续合成 DNA 并进行核分裂（karyokinesis）——一种称为无胞质分裂有丝分裂（acytokinetic mitosis）的核内复制（endoreduplication）形式；到第 12 天心肌细胞达 90% 的成体水平双核化（7,10）。无胞质分裂有丝分裂伴随稳定、有序的肌节形成，提示有序的收缩结构妨碍了胞质分裂（11,12）。除多核化带来的倍性增加外，心肌细胞还可经 DNA 合成而无核分裂而成为多倍体——即 endocycling 或 endomitosis。FACS 排序测量小鼠心肌细胞核显示胎儿心肌细胞核为单核二倍体；出生时仅 65% 心肌细胞核保持二倍体，其余大多为四倍体；P21 时二倍体核比例达稳态约 55%（13），时间与 DNA 合成停止一致。核内复制可被心肌细胞应激和特定信号通路激活（14,15），因此研究心肌损伤模型中细胞周期标志物上调时，必须证明新心肌细胞的产生性形成而非更有限的细胞周期活动形式。在人心中，心肌细胞生长同样在婴儿期从增生转变为肥大，但这一转变的时序尚不明确（16）；婴儿期至成年期正常人心肌细胞数目保持恒定（17,18），与小鼠不同，人心肌细胞中单核细胞占主导（77%），双核细胞占少数（22%）（18），这一比例不随年龄或缺血/肥厚性心脏病而变化（18）。通过 endocycling 的人心肌细胞多倍体化可持续到 10 岁（19），比啮齿类更持久；心肌损伤同样可刺激 endomitosis 并增加心肌细胞倍性（20）。新生心脏也通过非心肌细胞组分扩张而生长——小鼠胎/新生心肌中非心肌细胞稀少，出生后非心肌细胞比例从 P1 的 13% 快速升至 P20 的 80%（10），成体小鼠中非心肌细胞比例约 85%；这种扩张涉及成纤维细胞扩张及血管床的快速增长（增加超过 4 倍）（17）。一系列蛋白促进或抑制细胞周期进程（Figure 39.1，综述见 21）。研究出生后心肌细胞细胞周期退出机制时，细胞周期调节因子的表达在人和啮齿类心脏中被调查（综述见 11,22）。促进细胞周期活动的细胞周期调节因子——包括 Cyclin A、B、D1/D2/D3 以及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）CDK1（即 CDC2）和 CDK2——在胎心高表达，在成年心显著下调（10,13,23-25）。E2F 转录因子家族是 G1/S 期转变的关键调节因子，也在新生与成年心肌细胞之间显著下调（26）。E2F 活性通常被口袋蛋白家族（含 Rb 及其同系物 p107、p130）抑制；增生性生长期间 CDK2/CyclinE/CyclinA 和 CDK4/CyclinD 复合物磷酸化口袋蛋白，释放 E2F 抑制并驱动细胞周期活动；肥厚性生长期间这些激酶下调导致口袋蛋白低磷酸化和抑制 E2F（27,28）。CDK 抑制因子 p21 和 p27 通过抑制 Cdk2/CyclinE/CyclinA 和 Cdk4/CyclinD 活性、抑制 E2F，成为细胞周期活动的重要"刹车"；p21 和 p27 在增生性向肥厚性生长转变过程中显著上调（25,29）。总结而言心肌细胞细胞周期调节因子的表达受到精确调控，使得增生性生长期间因子谱有利于细胞循环，肥厚性生长期间谱系反转导致细胞周期退出；未来重要方向将揭示协调调节细胞周期调节因子谱系的分子通路。基于细胞周期调节因子在增生性向肥厚性心肌细胞生长转变过程中的表达变化，研究者尝试通过直接操控细胞周期调节因子来促使成年心肌细胞重新进入细胞周期（Figure 39.1）。细胞周期抑制因子 p27 以及冗余的口袋蛋白基因 Rb 和 p107 的敲除增加了心脏大小、心肌细胞数目和成年心肌细胞 DNA 合成（28,30）。转基因过表达 SV40 T 抗原强烈刺激心肌细胞重新进入细胞周期，但这些小鼠出现广泛的心脏病变并在断奶前死亡（31）。异位表达 E2F 家族成员 E2F1 引起 DNA 合成增加，但同时造成心肌细胞凋亡和死亡（32）。强制心肌细胞表达 Cyclin B 和 Cdk1 在细胞培养中驱动成年心肌细胞重新进入细胞周期（33），但该发现在体内的延伸尚未报道。D-cyclins 被视为细胞外环境的感受器，将有丝分裂通路与细胞周期机器连接，cyclins D1-3 是胎儿心肌细胞增殖所必需（34）；转基因过表达 cyclin D1、D2 或 D3 促进了心肌细胞 DNA 合成和多核化而不影响心肌细胞分化（24,35）；心肌细胞特异性 cyclin D2 过表达使成年心脏中 ³H-胸苷标记的心肌细胞比例提高超过 500 倍。LAD 冠状动脉结扎后即刻，cyclin D2 转基因小鼠与同窝对照之间梗死面积无差别；但 2 和 6 个月后转基因小鼠的梗死面积明显更小，提示发生了显著的心肌修复（35,36）。同样，cyclin A2 转异位表达增强了早期产后心肌细胞细胞周期活动——尽管此效应未在正常成年心脏中持续；心肌梗死诱发了新心肌细胞形成，改善了心室功能（37）。这些转基因 cyclin D2 和 A2 小鼠的有希望结果提供了概念证明：驱动心肌细胞重新进入细胞周期可能是刺激心肌再生的可行策略。

39.3 低等脊椎动物的心肌再生（Myocardial Regeneration in Lower Vertebrates）

一些低等脊椎动物如蝾螈和斑马鱼能够再生包括心脏在内的许多器官。理解这些模式生物中的再生过程将通过定义再生机制和调控通路为哺乳动物心脏再生提供洞见。斑马鱼是进行正反遗传学研究的成熟平台，因此成为研究心肌再生的主要模型。截除多达心室 20% 后，成年斑马鱼完全再生心脏且无残余瘢痕（38）。心室顶端截除后，截除部位周围形成胚基（blastema），胚基中的祖细胞增殖、表达心前体标志物并分化（39）。早期研究提示再生心肌的新心肌细胞由心脏祖细胞分化而来；近期 Poss 和 Belmonte 课题组的研究表明再生心肌的新心肌细胞来自已存在的心肌细胞（40,41），这一结论基于在斑马鱼中应用 Cre/loxP 遗传命运图谱技术：tamoxifen 激活的 Cre 重组酶 CreERT2 仅在已分化心肌细胞中表达（在同时携带 Cre 报告转基因的鱼中），该转基因在 Cre 重组后表达绿色荧光蛋白（GFP）。对鱼进行单次 tamoxifen 脉冲处理选择性地、遗传地标记已分化心肌细胞为 GFP⁺；心尖截除后（无 tamoxifen），再生心肌细胞表达 GFP（40,41），表明再生心肌细胞起源于已分化心肌细胞。虽然这些数据看似与早期提示新心肌细胞来源于未分化心脏祖细胞的研究矛盾，但如果已分化心肌细胞在形成再生心肌细胞前经过一个初始去分化阶段，则结果可被调和；未来研究将致力于解决该问题并探查在正常成年心脏中止心肌细胞增殖、在心脏损伤后刺激心肌细胞增殖的信号通路。蝾螈具有有限的心肌再生能力——心室尖端截除导致瘢痕形成，但心肌细胞填充瘢痕，可能是新生心肌细胞的产物（42）；将截除的尖端以切碎的心肌移植形式回植时心脏修复增强，这些移植块合并形成主要含有心肌的再生心室壁（43）；成年蝾螈心肌细胞在心脏损伤后去分化，下调肌节基因如肌球蛋白重链（44），去分化心肌细胞再增殖并重新表达心肌细胞肌节基因，参与心脏的功能性再生（45）。与心肌细胞去分化产生多能祖细胞样细胞一致，注射到再生蝾螈肢体中的心肌细胞去分化并通过再分化为骨骼肌参与肢体再生；相反注射到完整蝾螈肢体中的心肌细胞保持其作为心肌细胞的身份（44）。阐明刺激损伤心脏和肢体中心肌细胞去分化与增殖的机制是未来研究的重要方向。

39.4 哺乳动物中的心肌再生：小鼠和人（Myocardial Regeneration in Mammals: Mouse and Human）

胎哺乳动物心脏具有强健的内源性再生能力。这一事实在最近的一个遗传小鼠模型中得以证明，其中胎心再生能力代偿了 50% 心肌组织的有效丢失（46）。全细胞色素 c 合成酶（HCCS）是正常线粒体呼吸所必需的酶；Hccs 基因位于 X 染色体上。心脏特异性失活 Hccs 的雄性和纯合雌性因心脏线粒体异常死于 E10.5 至 E14.5；相反，雌性 Hccs 杂合子正常存活。这令人惊讶——雌性胚胎发育早期两条 X 染色体之一失活，失活状态在后续细胞分裂中遗传维持——因此雌性 Hccs 杂合子预期为遗传嵌合体，约 50% 细胞为 Hccs 缺陷。确实 E12.5 雌性 Hccs 杂合子中线粒体复合物 III 活性下降 50%，E10.5 时观察到正常和 Hccs 缺陷心肌细胞的预期 50:50 分布。然而正常心肌细胞比例此后逐渐增加，出生时达 90:10——正常心肌细胞的选择性增殖是这种扩张的原因，表明健康心肌细胞的再生反应；正常心脏祖细胞增强的心脏分化未被排除为可能机制。该研究揭示了哺乳动物胎心的再生能力；调节胎心肌细胞再生的信号通路可能治疗性地应用于产后心脏，因此开辟了解决成年心脏再生问题的新途径。小鼠能够再生丢失心肌的窗口似乎延伸至出生后早期。Sadek 及其同事证明 1 日龄小鼠能够再生心尖截除所丢失的心肌，恢复心脏形状和质量且无纤维化（47）；谱系追踪研究表明，与斑马鱼一样，再生心肌细胞主要通过已存在心肌细胞的增殖产生。然而这种再生能力在出生后第一周内迅速丧失——7 日龄小鼠心尖截除导致瘢痕形成而非新心肌形成。再生能力期与产后心肌细胞增殖期（7）一致，止于出生后 3 天，提示心肌细胞增殖能力的丧失和再生能力的丧失是关联的。成年哺乳动物心脏的再生能力在过去十年中已被详尽研究。这些研究大体上推翻了"该器官缺乏再生能力"的教条，但内源性心肌细胞更新和再生的程度仍存在争议（2,48）。争议直接源于在非心肌细胞增殖背景下测量罕见心肌细胞增殖的技术挑战。心肌细胞增殖按定义增加心肌细胞数目，但由于技术原因测量绝对心肌细胞数目很少进行；研究者通常测量表达增殖标志物的心肌细胞比例。成人心脏中非心肌细胞至少占细胞的 80%（10），这些细胞可能以比心肌细胞更大的程度增殖。因此心肌细胞增殖比例的测量易受多种伪迹影响（Figure 39.2）：必须有强健而客观的方法区分心肌细胞与非心肌细胞增殖（49）；一些研究者使用转基因心肌细胞标志物以方便且客观地识别心肌细胞（2），另一些研究者建议不必如此（48）。增加难度的是心肌细胞经历核内复制产生每细胞多核以及每个核超过两个基因组拷贝；因此 DNA 合成增加、细胞周期活动增加乃至核分裂并不必然表示新心肌细胞的产生。需要处理的其他重要伪迹包括：组织切片中信号重叠（除非进行三维分析否则可能造成共表达的错觉）（50）；自体荧光导致信号识别不准确（2,50）；祖细胞与心肌细胞融合（产生转分化的不准确印象）（51）；以及炎症细胞可定位于心肌细胞胞质内（2）。Richard Lee 课题组进行了一项重要研究，处理了心脏祖细胞对正常和损伤心肌贡献程度的问题。该研究基于遗传"脉冲-追踪"方法，使用同时含有 MHCα-MerCreMer 和 Z/EG 转基因的小鼠（52）。MHCα-MerCreMer 在已分化心肌细胞中表达 tamoxifen 诱导型 Cre 融合蛋白（MerCreMer），Z/EG 转基因仅在 Cre 重组后表达 GFP。因此单次 tamoxifen 脉冲短暂激活 Cre 并不可逆地、遗传地标记高比例已分化心肌细胞为 GFP⁺。"追踪"期间不再给予 tamoxifen。如果心肌细胞由祖细胞分化产生，则 GFP 标记心肌细胞比例将在追踪期间下降；反之如果不生成新心肌细胞或新心肌细胞由现有心肌细胞增殖产生，则标记比例不变。在 1 年追踪期间未观察到遗传标记的稀释，表明心脏祖细胞对正常小鼠心脏稳态没有实质贡献。该结论基于"心脏祖细胞未被 MHCα-MerCreMer 标记"的关键假设，虽然为该假设提供了合理证据，但因对要研究的适当祖细胞群体缺乏共识，无法完全排除该可能性。同样的遗传脉冲-追踪方法被用于研究心肌梗死后内源性心肌再生。面对心肌梗死带来的心肌损伤，MI 边缘区 GFP⁺ 心肌细胞比例在 3 个月内从 82.8 ± 1.5% 下降到 67.5 ± 2.0%（52），结果提示约 18%（（82.8-67.5）/82.8）的边缘区心肌细胞由未标记心肌细胞前体新生成。远离梗死区的心肌区域标记稀释较小但仍显著，与约 7% 心肌细胞来自未标记心肌细胞前体一致。对照实验提示 GFP⁺ 细胞优先死亡或 GFP⁺ 心肌细胞增殖下降不太可能是稀释原因。然而该方法无法完全排除由其他方式引起的标记稀释，例如 GFP⁺ 和 GFP⁻ 心肌细胞群体对心肌损伤的差异反应。该实验策略的另一个局限是未考虑来自 MHCα 表达心肌细胞增殖的心肌再生，因此可能低估了心肌损伤期间新肌细胞出生的程度。综合而言该研究提供了损伤背景下祖细胞产生新肌细胞的证据，但未告知这些祖细胞的身份。该结果还提示成年和新生心脏再生机制不同——前者源自祖细胞扩张，后者源自心肌细胞增殖（47,52）。人心中同位素心肌细胞"出生日期"提供了支持持续心肌细胞更新的证据（53）。由于地面核试验，生物可利用的碳-14（¹⁴C）在 1955 至 1963 年间全球急剧增加；1963 年后停止地面核试验使生物可利用 ¹⁴C 指数清除。细胞 DNA 的 ¹⁴C 含量与细胞出生时生物可利用 ¹⁴C 水平相关，因此测量人心肌细胞 DNA ¹⁴C 浓度可进行回顾性出生日期判定。在 1955 年前出生的受试者中，心肌细胞 ¹⁴C 浓度高于其出生时环境水平，与出生后心肌细胞显著出生一致（53）。在研究的 5 位最年长个体中，心肌细胞 DNA ¹⁴C 浓度仍低于当前水平，提示即使在老年人中心肌细胞中相当一部分从早期持续存在（53）。定量建模提示每年心肌细胞更新率为 0.2-2%，且与年龄呈负相关——根据该模型，50 岁时约一半心肌细胞从出生时持续存在，其余为后来生成（53）。虽然这一精巧研究或许是人心肌细胞更新程度的最佳评估，但它的局限持续造成人心肌细胞更新程度的不确定性。该实验中的一个重要技术障碍是分离纯化心肌细胞 DNA。这通过心肌细胞核的 FACS 分选实现，通过存在肌节蛋白 TNNT2 或 TNNI3 鉴定心肌细胞核。虽然 TNNT2 或 TNNI3 主要在胞质中，但核中存在足够量以用于 FACS。分选核富含心肌细胞标志物并耗尽非心肌细胞标志物，心肌细胞核纯度被判定为 96%（53）。然而 Anversa 及其同事辩称 TNNI3⁺ 核部分偏向衰老心肌细胞由于核通透性增加，因此低估了可能更具增殖性的年轻心肌细胞的更新（54）。另一个局限是研究测量了 DNA 合成的时序，可能因 DNA 修复、多核化和多倍体化而与心肌细胞出生脱节。作者考虑了这些因素并辩称它们不太可能显著影响其发现（53）。该研究也未调查心肌损伤的影响（心肌损伤在小鼠中实质性刺激心肌再生 52），且未提供新心肌细胞来源的洞见。总之，该重要研究表明正常人心脏稳态中存在低但显著的心肌细胞更新贡献。其他课题组，尤其是 Pierro Anversa 领导的课题组，辩称心肌细胞更新要广泛得多（48,55）。这些研究者对人心脏切片进行心肌细胞标志物（sarcomeric actin）和增殖细胞标志物染色。他们的定量分析在正常心脏中鉴定出 14 个具有有丝分裂像的肌细胞/百万肌细胞，在缺血性心肌病中升至 152 个有丝分裂肌细胞/百万肌细胞（56）（Figure 39.3a-e）。同样，Ki-67 染色（活跃循环细胞标志物）鉴定出正常心脏中 500 个循环肌细胞/百万肌细胞，心肌梗死边缘区为 42,000 个循环肌细胞/百万肌细胞（57）。基于这些数据并对有丝分裂持续时间作假设，Anversa 课题组计算正常成年心脏（含有约 5×10⁹ 个肌细胞）每天有 3×10⁶ 个新肌细胞出生。按此速率，整个肌细胞群体每 4.5 年更新一次，心肌梗死中丢失的肌细胞可在 18 天内被替换（48,55）。按此估算心脏具有丰富的再生能力，心肌损伤后恢复的限制不在于再生本身而在于炎症、缺血和瘢痕形成施加于再生的竞争性障碍（48,55）。虽然极具挑衅性，这些结果难以被复现。Field 等人使用表达核定位 lacZ 的转基因小鼠实现心肌细胞核的无歧义鉴定（15）。在未损伤心脏中，暴露 ³H-胸苷 60 小时后仅 1/180,000 肌细胞核被鉴定为经历 DNA 合成并摄取标记。按此测量，每百万肌细胞在 60 小时期间至多 5 个肌细胞主动合成 DNA（15）。使用免疫染色和 FACS 分选肌钙蛋白 T⁺ 心肌细胞核的 DNA 含量分析的一项近期研究独立证实出生后第 21 天细胞周期退出（13）。从 ³H-胸苷摄取估算的细胞周期活动至少比 Anversa 课题组估计的每百万 14 个有丝分裂肌细胞低 350 倍（56），这是因为标记期的相对差异（60 小时对比估计的有丝分裂 30 分钟）。损伤后，³H 胸苷摄取分析也证实心肌细胞细胞周期活动增加，尽管活动水平仍低：每百万中 14 个肌细胞在 60 小时期间主动合成 DNA（15），比 Anversa 课题组估计的有丝分裂活动低 1300 倍（56）。结果差异可能源于测量肌细胞增殖活性的技术困难——如建立阈值以将信号分类为阳性或阴性、在切片中区分心肌细胞和非心肌细胞核（49）、以及区分核内复制形式与心肌细胞增殖（20）（Figure 39.2）。人心肌（已报告心肌细胞重新进入细胞周期的最高值）可能由于单核心肌细胞比例更高和寿命远长于啮齿类，因此内在再生能力更高。然而人心肌细胞 ¹⁴C 出生日期提示这种可能性不太可能（53）。总之多种方法一致认为出生后存在可检测的新心肌细胞出生，心肌损伤强烈刺激心肌细胞细胞周期活动。然而对新生心肌细胞产生程度并无共识，估计范围从不足支持心肌再生的微不足道水平到足以再生损伤心肌的强健水平。压倒性证据支持前者，但每种方法都有可能导致心肌细胞更新绝对定量错误的局限。

39.5 心脏祖细胞（Cardiac Progenitor Cells）

再生心肌有两种基本机制。第一，成年动物可能含有能够自我更新和分化为心肌细胞的心脏祖细胞（CPC），这些祖细胞可能位于心脏本身（常驻 CPC）或位于远处位点（如骨髓）并经血流散布到心脏。第二，一部分已分化心肌细胞可能不是终末分化的，可能能够重新进入细胞周期以产生新心肌细胞。这两种机制并不互斥，在同一过程中两者都可能有助于心肌再生。例如心脏祖细胞被提议为缓慢循环的多能干细胞，产生短暂扩增的未成熟心肌细胞（55）；这些未成熟肌细胞被提议为小、增殖、单核、表达某些心肌细胞标志物的细胞。本节综述已报道的心脏祖细胞群体，可分为常驻和非常驻祖细胞。

39.6 常驻心脏祖细胞（Resident Cardiac Progenitor Cells, Table 39.2）

成年心脏中已报道数个常驻 CPC（综述见 58）。总体而言这些干细胞群体通过发育心脏中心发生的关键调节因子的表达或通过用于鉴定其他组织中干细胞群体的标志物被发现。发育标志物的使用使心脏发育的认识能够应用于成年 CPC 生物学，而对于不基于正常心脏发育的标志物而言这更具挑战性。此外，遗传命运图谱已成为确认候选祖细胞群体体内心脏生成活性的最佳可用方法；该方法对于由心脏内外异质群体表达的标志物定义的祖细胞而言存在问题。最深入鉴定的 CPC 也许是由转录因子 Isl1 表达定义的。在发育中小鼠胚胎，E7.5 时一弯月状细胞表达已分化心肌标志物如肌钙蛋白 T（见第 3、4 章关于正常心脏发育中心发生的综述）；E8.0 时这些细胞在腹侧中线融合形成含有已分化心肌细胞的管状结构，包围第二个内皮管道即心内膜。这一初始心管及其前体细胞被描述为"第一心区"（59）。过去十年的工作表明该初始心管主要通过位于心管两极的祖细胞分化为心肌细胞的持续添加而延长（59-63）。这些"第二心区"祖细胞以 Isl1 表达为标志，贡献流出道、右心房、心房一部分和左心室的一部分（62）。这些祖细胞分化时 Isl1 下调，在已分化心肌细胞中不再表达。克隆分析表明这些 Isl1⁺ 细胞是多能的——一个 Isl1⁺ 祖细胞可分化为心肌细胞、平滑肌和内皮细胞系（64）。Isl1⁺ 细胞在产后心脏中持续存在，保留自我更新能力并获得心肌细胞命运（65）。然而 Isl1⁺ 细胞在产后心脏生长和损伤反应中的作用仍不清楚，特别是这些祖细胞似乎与心房、右心室和流出道的生物学更相关而非左心室（主要泵血腔室）。另一个重要祖细胞群体以心脏转录因子 Nkx2-5 表达为标志。Nkx2-5⁺ 祖细胞对第一和第二心区都有贡献（66,67）。虽然 Nkx2-5 在心脏祖细胞和已分化心肌细胞中都表达，Nkx2-5 的一个增强子在祖细胞中优先活跃。Wu 等人在 Nkx2-5 增强子驱动 GFP 表达的转基因小鼠和 ES 细胞中分离祖细胞，克隆分析显示这些细胞分化为心肌细胞和平滑肌系（68）。除心肌细胞和平滑肌系外，发育胚胎中的 Cre-loxP 命运图谱方法显示 Nkx2-5 系细胞对心内膜的贡献（67,69）。有趣的是，新生和成年心脏中罕见细胞持续显示 Nkx2-5 祖细胞增强子活性，它们在正常和损伤产后心脏中的作用正在积极研究中（S.M. Wu，未发表）。上皮祖细胞对发育心脏至关重要，可在成年心脏中找到。上皮祖细胞起源于心上皮原基（proepicardium），即位于房室沟下方的隔横突外突（70）。心上皮原基细胞迁移到心脏表面形成上皮（epicardium），即覆盖心肌的间皮层。上皮中的祖细胞经历上皮-间质转化（EMT）形成间充质细胞，迁移入心肌并分化为平滑肌、内皮、间质和心肌细胞（71,72）。与其心肌生成潜力一致，上皮祖细胞来自表达 Nkx2-5 和 Isl1 的前体（71）。此外上皮细胞与下方心肌进行广泛的双向信号传导，促进心肌生长和冠脉血管发育（综述见 73）。因此上皮可能通过生成关键已分化心脏系以及通过对心肌修复有利的微环境两种方式参与再生反应。上皮祖细胞以转录因子 WT1 和 TBX18 的表达为标志（71,72）。在成年心脏中，上皮静止且下调 WT1、TBX18 以及其他在胎儿上皮中活跃表达的基因。然而心肌梗死刺激胎儿上皮基因的重新激活，包括 WT1，并通过 EMT 样过程刺激上皮层的增殖和扩张（74）。与胎儿心脏不同，成年上皮来源细胞仍停留在心脏表面，未观察到分化为心肌细胞；这些细胞主要分化为成纤维细胞、肌成纤维细胞和平滑肌细胞。它们积极产生分泌因子促进血管生成并在心肌梗死中具有保护作用（74）。与小鼠中 MI 激活上皮类似，斑马鱼中心尖截除刺激胎儿基因表达程序的重新激活（39）。值得注意的是心尖截除激活了位于上皮正下方心肌细胞亚群中的 gata4 转录增强子，重新填充截除心尖的心肌细胞来源于该选择的亚上皮心肌细胞亚群。这些数据提示上皮信号在再生过程中的关键作用（40）。上皮信号的性质和哺乳动物上皮在为再生创造有利的亚上皮微环境中的作用是令人强烈关注的领域。一个领先的候选信号是胸腺素 β4（TB4），一种促进心肌细胞存活和实验性梗死后心肌修复的小 G-肌动蛋白单体结合蛋白（75）。虽然 TB4 作用的机制仍不清楚，但至少部分通过刺激成年上皮祖细胞的扩张、动员和分化实现（76）。Riley 及其同事发现 MI 之前给予 TB4 使成年心脏中一小部分上皮细胞能分化为心肌细胞（77），提示 TB4 也可能影响心脏祖细胞的塑性。CPC 也已通过其他系统中鉴定的干细胞标志物鉴定。最显著的祖细胞群体是 c-Kit⁺ 造血谱系阴性（Lin⁻）心脏祖细胞，存在于成年小鼠心脏中以簇状形式存在提示干细胞巢。这些 c-Kit⁺ 细胞被报告具有自我更新、克隆性和多能性等干细胞特性，并在体外分化为心肌细胞、平滑肌和内皮细胞系（78,79）。此外注射入损伤心脏时，这些细胞在再生心肌中形成功能性血管和心肌细胞（78,79）。一个独立课题组使用带转基因心肌细胞标志物的小鼠系证实新生 c-kit⁺ 细胞的亚群具有心肌生成潜力（80）。然而他们的数据表明成年心脏 c-Kit⁺ 细胞具有很少或没有心肌生成潜力（56,000 个细胞检测中 1 个事件）（80）。导致结果差异的因素尚不确定，但可能与 c-Kit⁺ 细胞在培养中长期扩增后细胞性质的改变有关。需要进一步研究以理解成年 c-Kit⁺ 细胞的心肌生成活性以及调节其扩张和系承诺的信号。干细胞抗原 Sca1 也已用于鉴定来自成年心脏的心脏祖细胞群体。Sca1⁺ CPC 表达心脏转录因子 GATA4、MEF2c 和 SRF，但不表达已分化心肌细胞标志物。在细胞培养的分化条件下，心脏 Sca1⁺ 细胞上调已分化心肌细胞标志物，并在静脉注射心脏损伤后被募集到损伤位点分化为心肌细胞（51）。心脏 Sca1 群体与心脏"侧群"（side population, SP）细胞相关（81,82）——后者通过 ABC 转运体增强 Hoechst 33342 荧光 DNA 结合染料外排来定义，因为 93% 的心脏 SP 细胞表达 Sca1（51）。心脏 SP 细胞在甲基纤维素上或与心肌细胞共培养时也经历心脏分化，其中心肌生成潜力限于表达 Sca1 但不表达 CD31 的 SP 亚群（83）。与成年大鼠心室肌细胞共培养时，这些 SP 细胞获得成熟心脏表型并在刺激下表现出收缩和钙瞬变（83）。在未损伤心脏中全身注射的心脏 SP 细胞不能有效募集到心肌，且不分化为心脏系。然而募集被心脏冷损伤显著增强，损伤边缘区中 4% 的募集细胞表达心肌细胞标志物 TNNT2，其余表达内皮和平滑肌标志物（84）。另一个相关 CPC 群体以 c-Kit 和 Sca1 表达为特征，已从人心脏活检的原代培养中分离出来作为称为心肌球（cardiospheres）的自发细胞聚集体。心肌球细胞自我更新，并在与新生大鼠心肌细胞共培养时分化为心肌细胞（85,86）。人心肌球细胞注射到小鼠心肌梗死边缘区后成功移植、减少梗死面积并改善左心室功能（86）。总之已定义的一些心脏祖细胞群体在体外和体内分化并表达心肌细胞标志物。这些祖细胞群体分化为功能性、机械和电整合心肌的能力需要使用明确的体内命运图谱技术在独立实验室中验证。这些群体代表共同祖细胞不同子集的程度有待确定。

39.7 非常驻心脏祖细胞（Non-resident Cardiac Progenitor Cells）

具有心脏生成潜力的细胞不一定必须起源于心脏，事实上心脏外祖细胞可能由于可达性更优而具有更大的转化价值。也许支持非心脏祖细胞的最强证据来自人心脏嵌合研究。在接受女性心脏移植的男性受者中，含有 Y 染色体的相当数量心肌细胞在女性供体心脏中被报告（87）（Figure 39.3f-g），强烈提示原始细胞从受者迁移到移植心脏。性错配骨髓移植受者研究一致建立人骨髓作为心脏外祖细胞来源，能够新生心肌细胞形成（88）。虽然几个实验室的工作支持性错配移植中心肌细胞嵌合现象，但该发现频率存在争议——一些研究者在控制融合、自体荧光和胞质内循环细胞后很少能鉴定出来（2,50,88-90）。骨髓作为心脏祖细胞来源的潜在用途在 Anversa 课题组的一项里程碑式研究中得以建立（91）。他们报告注射的骨髓细胞被募集到梗死心肌并强健地转分化为心肌细胞。与此结果一致，在移植 GFP 标记骨髓的小鼠中，骨髓来源细胞被募集到梗死心肌，在那里分化为心肌细胞和内皮细胞（92）。然而其他两个课题组使用遗传标志物谱系追踪注射细胞并鉴定心肌细胞，无法复现骨髓细胞分化为心肌细胞的能力（93,94）。移植细胞与宿主心肌细胞的融合和显微镜伪迹可能潜在解释 Anversa 研究中观察到的转分化（2,95,96）。然而 Anversa 课题组的随访研究继续表明移植骨髓细胞在梗死区内分化为心肌细胞，独立于细胞融合（97）。在骨髓注射在小鼠心肌梗死模型中获益的报告和性错配移植患者中心肌细胞嵌合显著报告的鼓舞下，开展了一系列人体临床试验以检验骨髓干细胞改善心肌梗死后预后的假设（6）。这些研究结果的详细综述不在本章范围之内，简而言之结果混杂，看到获益时也未持续。注射细胞不能有效移植，导致结论是"看到的获益可能源于未定义的旁分泌机制"（98,99）。总之骨髓祖细胞是否被募集到心脏并转分化为心肌细胞仍有争议。虽然人心脏中嵌合现象的证据肯定具有提示性，但小鼠模型中难以复现骨髓细胞的归巢、移植和分化为心肌细胞，导致对骨髓祖细胞治疗心肌损伤的概念基础产生怀疑。最初治疗试验中令人失望的移植效率和最少的持续临床终点影响进一步强化了这种怀疑。显然需要对潜在生物学有更多基础理解。

39.8 已分化心肌细胞的增殖（Proliferation of Differentiated Cardiomyocytes）

除心脏祖细胞的扩增和分化外，内源性和治疗性心肌再生可通过已分化心肌细胞的增殖发生。该模型被推到了前沿——最近证明斑马鱼再生心肌来源于已分化心肌细胞（40,41）。在哺乳动物中，成年心肌细胞似乎也可通过操控适当信号通路被诱导重新进入细胞周期（Figure 39.1）。胰岛素样生长因子 1（Igf1）是生理性心脏生长的主要驱动者，Igf1 刺激被报告增加心肌细胞数目和细胞周期重新进入（100）。p38 丝裂原活化蛋白（MAP）激酶促进细胞周期退出、心肌细胞分化和肥大；相反破坏 p38 MAPK 活性允许成纤维细胞生长因子 1（Fgf1）刺激成年心肌细胞在体外和体内重新进入细胞周期，部分通过上调 Cyclin A2 和 D2（12,101）。Periostin 是 αVβ3 和 αVβ5 整合素的配体，是心肌损伤后上调最显著的基因之一。Periostin 通过整合素信号通路诱导成年心肌细胞细胞周期重新进入，重组 periostin 治疗改善了心肌梗死后心功能（102）。然而该结果有争议，因为在小鼠中 periostin 功能获得或丧失的遗传实验未支持（103）。神经调节蛋白 1（Nrg1）也被报告通过 ErbB4 受体酪氨酸激酶信号传导刺激心肌细胞重新进入细胞周期（104）。有趣的是 Nrg1 似乎优先刺激单核心肌细胞的细胞周期活动，其中一些似乎至少经过细胞周期两次。较小单核心肌细胞更大的增殖潜力已被其他课题组注意到（105），引起来自表达心肌细胞标志物的心脏祖细胞的短暂扩增群体概念（55）。四种已知的细胞外信号（Igf1、Fgf1、periostin 和 Nrg1）都作用于磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）通路的下游，PI3K 通路可能是该过程的核心。综合而言这些数据表明成年心肌细胞可通过操控细胞内信号通路被刺激重新进入细胞周期，提示作为治疗性心肌再生有前景的途径。

39.9 结论（Conclusions）

虽然相当多的证据推翻了"心脏缺乏再生能力"这一存在数十年的教条，但内源性心肌细胞更新的程度仍不确定。诱人研究表明哺乳动物心肌有限的再生能力可被治疗性增强以达到临床显著的心脏修复——心血管医学的"圣杯"。然而达到该目标需要克服相当大的障碍。未来工作需要在实验室之间实现可复现性并发展对心脏祖细胞群体的一致定义。需要理解心脏祖细胞的系选择和调节它们的信号。必须对促进心肌再生的心肌巢有更深入的认识。需要学习由祖细胞生成的新心肌如何与现有心肌机械和电整合。掌握这些知识后我们将能够把对心肌再生机制不断扩展的认识转化为临床应用。

本章个人批注

Zhou/Lin/Pu 这章是 Hill/2012 卷 II 中少有的"端粒-干性"主题章——在 ch33 讲先天性心肌病、ch35 讲心肌肥厚、ch36-38 讲缺血/HF/右心室之后，本章把视角从"成年心肌细胞终末分化"切换到"成年心肌细胞有限但真实存在的再生能力 + 多种内源/外源祖细胞"。这一章的核心张力是方法学-争议-可信度三位一体：作者一开篇就点明该领域充满争议，几乎每一段都嵌入"lineage tracing 显示"、"pulse-chase 提示"、"但不能排除融合/自体荧光/胞质内白细胞"的方法学保留。Hhs-cKO 雌性杂合子 50% 心肌细胞补偿 90:10 的实验（46）是全章最巧妙的小鼠模型——它利用 X 染色体随机失活的嵌合体特性，把"再生"定义为"健康细胞选择性扩张"，避开了常规损伤模型的复杂变量；但作者也明确指出该模型不排除 CPC 增强分化。Sadek 1 日龄 vs 7 日龄小鼠心尖切除的"时间窗"实验（47）则为新生期短暂再生能力提供了优雅证据。Anversa vs Bergmann/Field/Lee 的人心肌细胞更新率（每年 0.2-2% vs 每百万 14 个有丝分裂 vs 每百万 1/180,000 ³H-胸苷摄取）跨度近千倍——这一数字鸿沟本质上源于"如何把 DNA 合成 = 新生细胞"这一等式修正掉"。我个人的解读是 Bergmann 的 ¹⁴C 出生日期方法是当前最可信的人体证据（避开计数有丝分裂像的伪迹、利用全球碳-14 时序作为天然脉冲），0.2-2%/年的更新率更接近"老年心脏每年替换约 1% 心肌细胞"这一慢周转概念；Anversa 4.5 年完全周转的"丰富再生"估算尽管极具诱惑力但未被多个独立实验室复现。在祖细胞部分，c-Kit 阳性群体的"rife Cardiomyogenic" 报告（Beltrami 2003 Cell 78,79）vs "1 event in 56,000 cells"（Zaruba 2010 Circulation 80）的悬殊差异是全章最重要的"实验室间不可复现"案例，作者对此坦率承认但未给出确定归因——这与近期（2020s）的 c-Kit 心肌细胞命运图谱最终定论形成有趣对比：Molkentin 与其他实验室在 2010s 用更严格的 MerCreMer/c-Kit-CreER 工具小鼠一致得出"成年 c-Kit⁺ 细胞对心肌再生贡献极小"的结论。Isl1 与 Nkx2-5 增强子作为"祖细胞身份标志"的方法学部分强调了心脏发育生物学（ch3-4）到再生生物学的延伸——这一概念性桥梁在 ch32（Wnt/Notch 心脏祖细胞）中已经铺垫，本章则把它从发育期扩展到成年期。Sca1、c-Kit、心肌球、SP 细胞四个体外群体的"可塑性"报告几乎都存在"体外可分化为心肌细胞样细胞 vs 体内功能性整合的因果链"缺环——这也是为何本章明确表示"需要明确的体内命运图谱技术验证"作为后续工作的核心方向。Nrg1 单核心肌细胞优先增殖（104）与 Rota 2007（105）的"年轻小鼠心脏由年龄和功能异质的心肌细胞组成"相互呼应，为"小单核心肌细胞 = 短暂扩增群体"的概念提供了机制——这与 Anversa 提出的"未成熟小单核心肌细胞"猜想相吻合。PI3K 通路作为 Igf1/Fgf1/periostin/Nrg1 四条细胞外信号的共同下游节点被作者突出——这一观察为"鸡尾酒受体下游"治疗策略提供理论基础。最终章作者在"结论"中给出的五大障碍（实验室可复现性、祖细胞定义、系选择信号、心肌巢、整合）几乎是 2012 年后十年再生心脏病学研究的路线图。本章与 ch38（RV）的衔接特别值得注意：Archer/Ryan 等人强调 RVH 中失适应性的"恶性循环"——缺血-代谢-纤维化；Zhou/Lin/Pu 则强调"内源性再生"作为补充策略——如果代谢/抗缺血治疗失败，再生疗法可能成为 RVF 治疗的下一道防线。这种"代谢调节 vs 细胞补充"的双轨叙事也呼应了 ch37 Muslin 的 HF 总论框架。

与上下章的衔接（一段话）

Ch38（Archer/Ryan 等人）刚刚系统综述了右心室的发育、解剖、功能、适应性与失适应性 RVH、PH 中 RVF 的代谢/缺血/纤维化机制以及 ARVC/ATTR/RV 梗死三类 RV 特异疾病，ch39 紧接其后把视角从"成熟心脏的退行性病变"切换到"成熟心脏的有限但真实存在的再生能力 + 多系祖细胞群体"。这一安排在 Hill/2012 卷 II 心脏肌肉部分中起到"治疗策略转折"作用：ch33-35 讲疾病（先天性心肌病/CHD/肥厚）、ch36-38 讲后天病理（缺血/HF/RV），ch39 转向"修复"——尽管这种修复在哺乳动物中是有限且高度争议的。从 ch39 到 ch42，章节从"心肌再生"过渡到"心律失常"——ch40 讲心律失常的结构基础、ch41 讲细胞分子机制、ch42 讲遗传机制。本章为后续章节提供四方面衔接：(1) "心肌细胞终末分化 vs 重新进入细胞周期"的张力是 ch40 讲结构重塑和 ch41 讲电重塑时的背景——纤维化瘢痕和存活心肌的电耦合问题是再生疗法需要解决的下游问题；(2) "内源祖细胞（CPC）+ 外源祖细胞（骨髓）"的双轨概念为 ch48 "Cell Therapy for Cardiac Disease"埋下伏笔——本章明确把外源细胞移植文献剥离出范围，ch48 将系统综述；(3) "新生期短暂再生窗口"（47）与 ch32 讲的 Wnt/Notch 心脏祖细胞分化调控、ch34 讲 T-box/Nkx2-5 等发育转录因子在产后残余活性相互呼应，把发育生物学与再生生物学连接起来；(4) "心肌再生"作为 RVF（ch38）治疗策略的下一道防线，提示"代谢调节失败 → 细胞补充"的层级治疗思路。整体看 ch39 是从"病理学综述"到"治疗学探索"的转折点——没有它，Hill/2012 几乎成了"心脏病理专著"，而 ch39 把"再生医学的可能性"作为开放问题留给读者。