第 27 章：心肌细胞中的蛋白质质量控制（Protein Quality Control in Cardiomyocytes）

27.1 引言（Introduction）

蛋白质质量控制（PQC）是一种基础细胞过程，其功能是辅助蛋白质（再）折叠、保护新生或未折叠的多肽不发生聚集，并选择性降解终末错误折叠的多肽。靶向于膜和分泌途径的蛋白质在内质网（ER）中折叠，这些蛋白质的质量控制主要由 ER 相关 PQC 完成。已逃离 ER 或在后 ER 区室中产生的非原生膜蛋白，则优先通过外周 PQC 过程被清除，该过程涉及内吞和溶酶体降解（2）。在心肌细胞中，由于肌原纤维蛋白占据细胞体积的 80% 以上，绝大多数细胞蛋白（尤其是非 ER 蛋白）的质量控制由 ER 非依赖性 PQC 完成。无论发生于哪个亚细胞区室，PQC 都是由分子伴侣与靶向蛋白质降解系统协同执行的。后者主要由泛素-蛋白酶体系统（UPS）完成，有时也由溶酶体完成（3）。由于暴露的疏水面，未折叠或错误折叠的蛋白在分子伴侣和/或 UPS 蛋白水解功能变得不充分时，倾向于通过疏水相互作用彼此聚集，并与其他易损蛋白发生聚集。异常蛋白聚集不仅可对细胞造成物理性破坏，还可产生其他不良影响，包括损害 UPS 蛋白水解功能——而 UPS 功能受损反过来又进一步降低细胞清除异常蛋白的能力，由此导致更多蛋白聚集。UPS 功能不足会引发选择性大自噬——这是一种细胞用来帮助清除异常蛋白聚集的过程（4）——从而在 PQC 中起到补充作用。自噬及其在 PQC 中的作用将在另一章中讨论（见第 30 章），本章将不再进一步讨论。心肌细胞中的 PQC 在许多病理条件下常变得不充分，而心脏 PQC 的不充分可能在这些疾病向充血性心力衰竭（CHF）进展的过程中扮演重要角色。本章聚焦于讨论心脏 PQC 研究的最新进展，重点强调新兴证据所支持的 PQC 不充分在心脏中的致病作用。

27.2 PQC 中的伴侣蛋白（Chaperones in PQC）

伴侣蛋白是一个庞大的蛋白家族，能够感知未折叠或错误折叠多肽的出现，因此充当 PQC 的首道防线。伴侣蛋白与未折叠或错误折叠多肽结合，防止它们形成聚集，从而使新生多肽得以正确折叠、错误折叠多肽得以重折叠。若错误折叠蛋白无法被修复，细胞会将其视为终末错误折叠蛋白，由伴侣蛋白护送至蛋白水解系统（UPS 或溶酶体）进行降解。在应激条件下，心肌细胞中伴侣蛋白的表达会上调，以应对应激源诱导的蛋白错误折叠。热休克反应是其中研究最深入的范例：一族被称为热休克蛋白（HSP）的蛋白家族在热休克反应中被诱导表达。HSP 通常具有类伴侣蛋白功能，其中一些可帮助修复应激损伤的蛋白，而许多 HSP 也将终末错误折叠蛋白引导至降解途径。HSP90、HSP70、HSP70 相互作用蛋白的羧基端（CHIP）、HSP40、HSP20 和 αB-晶状体蛋白（CryAB）是研究最深入、在心脏 PQC 中发挥重要作用的部分伴侣蛋白。多种伴侣蛋白在心肌缺血/再灌注（I/R）损伤中的保护作用已被功能缺失和/或功能获得研究广泛证明（3,5）。CHIP 除作为（共同）伴侣蛋白（6,7）外，还作为泛素连接酶（见下文）发挥作用，并在 PQC 相关的泛素化过程中居于核心位置（8–10）。αB-晶状体蛋白（CryAB，也称 HSPB5）是心肌细胞中最丰富的小 HSP。CryAB 可与中间丝和肌原纤维蛋白结合，推测起到保护作用。心脏中 CryAB 表达上调已在心脏肥大中被报道，而在终末期衰竭的人类心脏中检测到 CryAB 显著下调（5）。第一个与人类肌肉疾病（即结蛋白相关肌病）相联系的伴侣蛋白基因突变，是 CryAB 基因的错义突变（Arg120Gly）（CryABR120G）（11）。该突变损害 CryAB 的体外伴侣功能（12）。人类病理学和小鼠转基因研究均已显示，CryABR120G 的表达引起异常蛋白聚集、心肌病和 CHF（13,14）。受损的 PQC 已被提出来作为 CryABR120G 在心脏中的重要致病机制（14,15）。CryAB/HSPB2 双敲除小鼠会发展出限制型心肌病，并在基线条件下寿命缩短。CryAB 和 HSPB2 两个基因的同时缺失会加剧压力超负荷诱导的病理性心脏重塑；与此相对，心脏过表达野生型 CryAB 的小鼠在急性压力超负荷下表现出受抑的心脏肥大反应（16）。这些实验结果表明，伴侣蛋白介导的 PQC 是心脏在机械超负荷时必不可少的保护机制，同时也提示伴侣蛋白介导的 PQC 在急性压力超负荷时很可能并不充分。启动分子伴侣表达的措施仍待探索，作为治疗人类心脏病的一种策略（17）。

27.3 泛素-蛋白酶体系统（The Ubiquitin-Proteasome System）

大多数细胞蛋白（包括肌节蛋白）（18）的降解由 UPS 执行。如图 27.2 所示，UPS 介导的蛋白降解通常包括两个步骤：（1）通过称为泛素化的过程将一串泛素分子连接到靶蛋白上；（2）被泛素化的蛋白由 26S 蛋白酶体降解。所有异常蛋白（至少在其可溶形式）以及绝大多数不再需要的正常蛋白——如代谢酶和已不再需要的信号蛋白——都由 UPS 降解。因此，UPS 在 PQC 中发挥关键作用，并参与几乎所有细胞过程的调控（19）。毫不意外，UPS 功能改变已在多种类型的心脏疾病中被观察到，并被认为参与了 CHF 的发生（20,21）。据此，UPS 可被视为各种心脏疾病的有力治疗靶点。

27.3.1 泛素化与去泛素化

通过由泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）依次催化的级联化学反应，泛素化将一个泛素分子的羧基末端通过异肽键连接到靶蛋白或另一个泛素分子中赖氨酸残基的 ε-NH2 侧链上。通常需要由四个或以上泛素分子形成的泛素链才能将底物蛋白靶向蛋白酶体降解。泛素的七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63）都可用于形成多泛素链；但最常用的形式是 K48 和 K63。通常 K48 连接的多泛素化将修饰蛋白靶向蛋白酶体降解，而 K63 连接的多泛素化常调控蛋白的定位、对伴侣蛋白的亲和力和/或活性。例如，TRAF6 介导的 AKT（蛋白激酶 B）的 K63 连接多泛素化促进 AKT 的膜转位和激活（22）。与多泛素化不同，单泛素化通常不触发降解，而是在非蛋白水解过程中（如基因表达调控）起信号作用。底物特异性和泛素化的限速步骤由直接结合特定靶蛋白的泛素（E3）连接酶赋予。泛素连接酶有时可以是单一蛋白，但更常以蛋白复合物的形式存在。一个泛素连接酶含有以下三个结构域之一：HECT（与 E6-AP 羧基端同源）结构域、RING（真正有趣的新基因）结构域，或与 RING 结构域密切相关的 U-box 结构域。最大的泛素连接酶家族是 cullin-RING 泛素连接酶（CRLs）。在 CRLs 激活过程中，F-box 蛋白与底物结合会触发支架蛋白 cullin 的 neddylation，将底物拉近 E2 酶（23,24）。因此 cullin neddylation 是 CRLs 激活的关键步骤。由于许多细胞周期调节因子的降解由 CRLs 介导，抑制 neddylation 的药物（如 MLN4924）已被开发并进入治疗癌症的临床试验（25）。肌肉特异性 RING 指蛋白（MuRFs）和肌肉萎缩 F-box（MAFbx）/atrogin-1 是肌肉蛋白降解中研究最深入的泛素连接酶。MuRF 家族和 atrogin-1 都参与心脏中肌节和非肌节调节蛋白的降解。MuRF1 表达上调已在肥大和衰竭心脏中被报道。这种上调可能参与病理性重塑，因为高水平 MuRF1 转基因过表达的小鼠心脏在压力超负荷下心衰易感性增加（26）。另一方面，MuRF1 是肥大心脏逆重塑所必需的。在接受左心室辅助装置（LVAD）的患者中，卸载的左心室中 MuRF1 蛋白水平显著升高。在解除压力超负荷后，心脏肥大（即心脏萎缩）的消退在 MuRF1 缺陷小鼠中比野生型对照显著延迟（27）。MuRF1 可与肌酸激酶（CK）（28）相互作用并使其泛素化，特别是被氧化的 CK 形式（29）。MuRF1 敲除小鼠中肌 CK 蛋白水平升高，而 MuRF1 过表达小鼠心脏中 CK 活性下降（26,28）。这些数据提示 MuRF1 可能同时调节 CK 的蛋白质量和活性，从而影响心肌细胞的能量代谢。作为肌肉细胞中的 F-Box 蛋白，atrogin-1 与 skp1 和 cullin1 相互作用形成 SCF（Skp1-Cullin1-F-box）型泛素连接酶，其中 F-box 蛋白为泛素化招募特异性底物蛋白（30）。atrogin-1 可将 calcineurin 靶向降解（31）。在压力超负荷诱导的肥大和缺氧心脏中 atrogin-1 上调（32）。在 MI 诱导的大鼠 CHF 中也观察到类似上调，并与 TNFα 的产生相关，可能负责肌钙蛋白 I 的降解（33）。已知 FOXO 转录因子家族在肌肉萎缩过程中 PI3K/AKT 失活后介导 atrogin-1 的转录（34,35）。非常有趣的是，最近发现 atrogin-1 通过以多泛素化依赖性方式共同激活 FOXO 转录因子，抑制小鼠中 AKT 依赖的心脏肥大（36），提示 atrogin-1 对包括其自身在内的萎缩基因激活施加前馈调节，并且刺激 atrogin-1 可能是抑制心脏肥大的有力方法（37）。CHIP 是含 U-box 的泛素连接酶。CHIP 泛素化一系列由伴侣蛋白识别的异常蛋白并将它们导向降解（38–40）。在 ER 相关 PQC 和胞质 PQC 中，CHIP 介导的多泛素化将错误折叠蛋白靶向蛋白酶体降解。在外周 PQC 中，CHIP 将质膜上的非原生蛋白泛素化并将其靶向溶酶体降解（2）。有趣的是，CHIP 近期被揭示直接与野生型 p53 相互作用并保护其反式激活活性（7）；然而它将突变型 p53 泛素化以使其降解（41）。因此，CHIP 是哺乳动物细胞中 PQC 的重要泛素连接酶。泛素化的反向过程是去泛素化，由去泛素化酶（DUBs）催化，代表了对 UPS 介导蛋白降解的另一层调控。很少有研究检查过心脏中 DUBs 的表达和功能意义。在以扩张型心肌病为表现的衰竭人类心脏移植样本中，泛素羧基末端水解酶（UCH）被发现显著上调（42）。更近期，BRISC（BRCC36 含有异肽酶复合物）DUB 酶的一个亚基 Abro1（也称 KIAA0157）被发现主要在心脏中表达，且其表达在心肌 I/R 小鼠心脏中显著上调。与健康供体心脏组织样本相比，Abro1 蛋白表达在缺血性心脏病（IHD）患者心脏移植的梗死区显著升高，但在远端区不升高。该研究进一步证明 Abro1 上调导致对特定蛋白靶标的 K63 特异性去泛素化（43），与已知的 BRISC DUB 特性一致（44）。DUBs 在心脏中表达改变的病理生理学意义仍有待研究。在几乎所有类型心血管疾病引起的终末期心衰人类心脏中，泛素化蛋白均显著增加，但其潜在原因仍不清楚（45）。泛素化和/或去泛素化的调控失常以及蛋白酶体功能不足都是可能的原因。判断泛素化和去泛素化是否功能失调以及这种失调是否在 CHF 中起作用将是重要的。

27.3.2 蛋白酶体介导的蛋白降解

多泛素化蛋白的降解通常由 26S 蛋白酶体执行。26S 蛋白酶体是一个蛋白酶复合物，由桶状核心颗粒（20S 蛋白酶体）和位于 20S 一端或两端的调节颗粒或激活复合物（通常为 19S 蛋白酶体）组成。20S 蛋白酶体的桶状结构由四层七聚体环的轴向堆叠形成：两个相同的 β 环被夹在两个相同的外层 α 环之间。每个 α 或 β 环包含七个独特亚基（α1–α7，β1–β7）。19S 蛋白酶体的组成尚未完全阐明，它识别并去除靶蛋白分子上的泛素链，将其展开，并将展开的多肽导入 20S 蛋白酶体的蛋白水解腔。蛋白酶体的蛋白水解活性位于 20S β 环的内表面。三种主要肽酶活性（chymotrypsin-like、trypsin-like 和 caspase-like（也称肽酰谷氨酰肽水解酶））分别位于 β5、β2 和 β1 亚基中。α 环守护多肽进入蛋白水解腔的入口并调节蛋白水解产物的出口。目前评估细胞中蛋白酶体蛋白水解功能涉及两类底物的使用：合成小分子荧光底物和全长蛋白底物。当前使用的小分子荧光底物又可分为两种：第一种最为常用，当被蛋白酶体肽酶选择性切割时发出可定量的荧光信号（46），另一种则在不可逆地结合蛋白酶体的活性肽酶亚基时发出荧光（47）。使用这些合成荧光底物的测定只能在体外、外源或体内环境下测量蛋白酶体肽酶活性。它们无法评估细胞中蛋白酶体蛋白水解功能在满足特定病理条件下维持蛋白稳态和 PQC 的细胞需求方面是否充分。增加的蛋白酶体肽酶活性很可能是对 UPS 蛋白水解功能不足的继发反应。为解决这一关键问题，对已知蛋白酶体底物蛋白水平的监测被用作评估蛋白酶体功能改变的参数。内源性和转基因蛋白均以这种方式被使用。内源蛋白酶体底物（如 β-catenin 和 IκB）的蛋白水平升高通常被用作蛋白酶体功能受损的指标。然而，该方法至少有两个主要局限：（i）内源蛋白的合成受到高度调控，可能受所研究条件的影响，使数据解释困难；（ii）蛋白酶体功能增加未必能在细胞中增加正常蛋白的降解，因为泛素化通常是限速步骤，这使该方法在检测蛋白酶体功能过盛时不可靠。为规避这些局限，修饰的绿色荧光蛋白（GFP）已被开发作为 UPS 的替代底物。其中一种替代底物是通过在氨基端融合突变（G76V）泛素到 GFP（称为 UbG76V-GFP）而构建；另一种是通过在羧基端融合 degron CL1 到 GFP（称为 GFPu 或 GFPdgn）而构建。由于 degron CL1 含一段表面暴露的疏水氨基酸残基（48），即错误折叠的标志性构象，GFPdgn 被视为错误折叠蛋白的替代物（45）。当适度表达时，这些报告 GFP 在生物学上是惰性的，细胞可良好耐受，且易于检测。它们由组成型启动子控制，与内源蛋白相比，其合成受细胞（病理）生理学的影响小得多。GFPdgn 或 UbG76V-GFP 的组成型、泛表达转基因小鼠模型已被构建（49,50）并被验证为蛋白酶体功能的反向报告物。GFPdgn 小鼠已被广泛使用，显著促进了对 UPS 功能障碍参与心脏发病机制的实验研究（15,50–53）。

27.3.3 UPS 蛋白水解功能的调控

对细胞不再需要的原生（正确折叠）蛋白的 UPS 介导降解，其降解信号的成熟通常控制泛素化的时序，因此正常蛋白降解的限速步骤通常在泛素化步骤。然而，异常蛋白降解的限速步骤很可能位于蛋白酶体，特别是进入 20S 蛋白酶体这一环节（15,52）。因此，理解给定蛋白泛素化的调控将有助于寻找干预该蛋白稳定性的措施，而对蛋白酶体调控的研究将促进开发增强异常蛋白清除的方法。特定蛋白底物的泛素化受底物上泛素化信号的成熟、其特异性泛素连接酶的可用性和活性以及底物与泛素连接酶之间的物理相互作用所控制（30）。底物蛋白分子上的翻译后修饰可调控其泛素化，可能通过改变底物构象以允许或阻止泛素连接酶的结合。例如，酪蛋白激酶 Iα 和 GSK-3 对 β-catenin 的氨基末端丝氨酸/苏氨酸磷酸化触发其泛素化和降解；而 c-Jun 中 PPXY 基序内酪氨酸的磷酸化则阻止泛素连接酶结合并抑制其泛素化（54,55）。泛素连接酶的表达在合成和降解两个阶段均受到调控。Atrogin-1 和 MuRF-1 在骨骼肌萎缩过程中主要负责肌肉蛋白的降解，它们的表达由 FOXO 转录因子刺激（34）。IGF-1/PI3K/AKT 通路可通过抑制 FOXO 转录因子阻止 atrogin-1 和 MuRF-1 的表达（35）。在心肌细胞中，激活 atrogin-1 转录并延缓或阻止心脏肥大的 FOXO3a 在多种生理和病理的心肌细胞生长刺激下被下调（56,57）。泛素连接酶可被自身或被其他泛素连接酶泛素化，导致其被蛋白酶体降解。泛素连接酶复合物的组装与解聚动力学被调控以控制其自毁（3）。作为最常被修饰的酶，泛素连接酶的活性也可通过翻译后修饰调控，如磷酸化、neddylation 和泛素化（58）。对于 CRLs（如 SCF 家族），底物识别亚基与底物的结合会增加 cullin 的 neddylation 和泛素连接酶的激活（30）。泛素化也可由泛素化酶的细胞定位调控。泛素化酶的定位可由其与辅助蛋白的结合控制。Smad 7 是一种辅助蛋白，将泛素连接酶招募到 TGF-β 受体，刺激蛋白降解（58）。关于错误折叠蛋白泛素化调控的认识还很少。然而，一般认为疏水残基斑块的暴露是错误折叠多肽的泛素化信号。因此，对错误折叠蛋白而言，泛素化信号始终存在，其泛素化在概念上由其泛素连接酶的可用性和可及性调控。正如前文所讨论的，伴侣蛋白被认为在这一过程中起关键作用。

27.3.4 蛋白酶体的调控

由于泛素化是 UPS 级联中被广泛认可的调控点，过去曾假设蛋白酶体像一个自动的"研磨机"，在不同组织和各种生理条件下其结构和活性几乎没有变化。然而这一假设最近被证明是错误的（59,60）。功能蛋白组学研究揭示了小鼠不同器官间蛋白酶体组成的差异和活性上的显著变化（61–63）。蛋白酶体活性似乎被细胞良好地调整以协调其能量代谢，并适应各种细胞对内外应激反应的需求。泛素化和蛋白酶体介导的靶蛋白降解都是 ATP 依赖性的。依细胞类型不同，细胞内 ATP 的生理水平处于低毫摩尔范围（64）。有趣的是，体外蛋白酶体肽酶活性测定的最佳 ATP 浓度在 50 μM 到 100 μM 之间，低于细胞内生理 ATP 水平一个数量级（65）。在培养细胞中药理性降低 ATP 产生会对内源底物和 GFPu 的 UPS 介导降解产生双向效应：在 ATP 中度下降时蛋白酶体降解显著初始增加，随后在 ATP 耗竭时蛋白酶体降解下降（66）。这些数据提示在正常基线条件下，细胞内 ATP 的生理水平可能作为一种调控因子，使蛋白酶体活性维持在相对较低水平，从而允许蛋白酶体活性在急性应激期间 ATP 中度下降时迅速升高（66）。这一观察与如下事实一致：在压力超负荷诱导的心脏肥大和心肌梗死（MI）早期，心肌蛋白酶体肽酶活性通常增加（67）。这一新提出的 ATP 介导的调控在完整动物中的验证仍有待进行，但可能在细胞在暂时性和急性应激下的 PQC 以及更长持续应激的初期起到重要作用。在后者情况下，这允许在更可持续的代偿机制（如增加蛋白酶体合成）生效之前，错误折叠蛋白的蛋白酶体介导降解迅速增加。蛋白组学研究已揭示心脏蛋白酶体多个亚基中的多种翻译后修饰（61–63,68）。负责这些修饰的分子事件以及调控这些修饰的信号通路，以及修饰的生理学意义，都已开始被理解。蛋白磷酸酶 2A（PP2A）和蛋白激酶 A（PKA）可与完整的小鼠心脏 20S 蛋白酶体共纯化（68）。在某些条件下，PP2A 和 PKA 可修饰 20S 的多个亚基（如 α1 和 β2），因为抑制 PP2A 或添加 PKA 明显改变蛋白酶体的磷酸化谱。似乎高磷酸化的 20S 蛋白酶体比较低磷酸化的更活跃（63,68）。在非心肌细胞系统中，PKA 通过诱导 19S 亚基 Rpt6 的 Ser120 磷酸化激活蛋白酶体（69）。将该 Ser120 突变为 Ala 会阻断蛋白酶体功能。PKA 的刺激效应和 Rpt6 的磷酸化可被 PP1γ 逆转（69）。近期报道 PKA 激活增强犬的心肌 26S 蛋白酶体组装和活性，且 PKA 在心脏中通过缺血预处理（IPC）介导蛋白酶体组装和活性的增强（70）。PKA 激活降低可能是 β-肾上腺素刺激诱导的心脏肥大中 20S 蛋白酶体 caspase-like 和 trypsin-like 肽酶活性下降的原因（71）。蛋白激酶 N（PKN），一种应激激活的蛋白激酶，也增加心脏蛋白酶体 chymotrypsin-like 活性，这种增加可能有助于其对心肌 I/R 损伤的保护（72）。PKN 对蛋白酶体作用的机制仍有待研究。蛋白酶体功能也由与 19S 蛋白酶体相关的 DUBs 调控。在蛋白酶体介导的多泛素化蛋白降解过程中，泛素链的去除由 19S 蛋白酶体的化学计量 DUB 亚基 RPN11 执行。RPN11 在泛素链的根部切割，回收泛素，释放底物，并促进底物转位进入 20S 蛋白酶体。另外两个 DUBs——UCH37 和 USP14——可逆地与哺乳动物 19S 蛋白酶体相关。与 RPN11 不同，USP14 和 UCH37 从远离底物的链顶端拆解泛素链，因此缩短链而非将整条链整体移除。最近，一种 USP14 去泛素化的小分子抑制剂被发现，并被证明可增强所测试的蛋白酶体底物（包括一些与神经退行性疾病相关的蛋白）的蛋白酶体介导降解（73）。这是一项令人兴奋的突破，因为它代表了第一个小分子蛋白酶体激活剂的发明，尽管蛋白酶体抑制剂早已存在并已用于临床上治疗某些形式的癌症（74）。测试 USP14 抑制能否在体内增强蛋白酶体功能以及能否用于治疗蛋白酶体功能不足的人类疾病将是令人感兴趣和重要的。与许多其他类型细胞一样，心肌细胞中的 20S 蛋白酶体也与 11S 蛋白酶体相关。11S 蛋白酶体也称为蛋白酶体激活剂 28（PA28）或 REG（75,76）。11S 蛋白酶体可由 PA28α 和 PA28β（α3β4 或 α4β3）异聚形成，或由七个 PA28γ 分子同聚形成（75）。除了在两端由 19S 或 11S 加帽外，20S 蛋白酶体可同时在一端结合 19S、另一端结合 11S，形成混合蛋白酶体。11S 与 20S 蛋白酶体的结合曾被认为对抗原加工很重要（77），但近期研究揭示 PA28γ 介导若干内源调节蛋白通过 20S 蛋白酶体的 ATP 和泛素非依赖性降解（78–80）。在糖尿病大鼠中已有报道心肌 PA28α 和 PA28β 蛋白表达增加（81）。在培养的心肌细胞和非心肌细胞中，过表达 PA28α 稳定 PA28β 并由此上调 11S 蛋白酶体。重要的是，替代错误折叠蛋白（GFPu）而非内源或过表达的正常 UPS 底物的蛋白酶体介导降解，被 PA28α 过表达显著增强。此外，PA28α 过表达显著减弱培养心肌细胞中过氧化氢处理引起的蛋白羰基增加和细胞死亡（82）。这些令人兴奋的发现表明通过 PA28α 过表达上调 11S 蛋白酶体可增强错误折叠/损伤蛋白的蛋白酶体介导降解，促进 PQC，从而保护细胞对抗氧化应激。重要的是，这些体外发现已在完整小鼠中得到确认（Wang，未发表数据）。除翻译后修饰外，哺乳动物蛋白酶体的一些亚基还存在不同的同种型（61）。不同同种型的蛋白酶体组装也可能在心脏蛋白酶体活性调控中提供一层调控（62）。20S 蛋白酶体的三个肽酶亚基（β1、β2 和 β5）各有一个诱导型同种型（分别为 β1i、β2i 和 β5i）。诱导型同种型可被病毒感染或干扰素处理刺激。含诱导型亚基的蛋白酶体被称为免疫蛋白酶体。免疫蛋白酶体具有更高的肽酶活性，在病毒感染期间增强抗原加工。值得注意的是，干扰素也增加细胞的氧化应激，从而增加多泛素化蛋白的产生，并在免疫蛋白酶体受损时导致蛋白聚集（83）。免疫蛋白酶体增强的蛋白水解活性有助于清除损伤蛋白并保护对抗氧化应激（83–85）。免疫蛋白酶体以及 PA28α、PA28β 和 20S 蛋白酶体的合成可被氧化应激诱导（85）。这些结果提示免疫蛋白酶体在应激条件下 PQC 中具有一个此前未被认识的作用。在培养细胞中已观察到蛋白酶体亚基合成总体增加作为对蛋白酶体抑制或功能不足的继发反应，并在心脏中也得到证实（15,86）。

27.4 ER 相关 PQC 与心脏功能障碍（ER-Associated PQC and Cardiac Dysfunction）

蛋白质被输送到膜和分泌途径的折叠和关键修饰在内质网中进行。通过内质网的多肽的（再）折叠由 ER 伴侣蛋白辅助并监控。被 ER 伴侣蛋白感知到的终末错误折叠多肽被反向转运到 ER 膜的细胞质侧，在那里立即通过称为 ER 相关降解（ERAD）的机制降解（1）。在 ERAD 期间，被反向转运的未折叠多肽被 ER 膜相关泛素连接酶多泛素化，随后被 26S 蛋白酶体降解（1）。ER 中错误折叠/未折叠蛋白的超负荷（称为 ER 应激）激活一种称为未折叠蛋白反应（UPR）的防御机制。UPR 抑制一般蛋白的合成以防止未折叠蛋白的进一步积累，诱导 ER 伴侣蛋白的转录和合成以增强折叠能力，并增加 ERAD 组分的表达以增强 ERAD 能力。自噬也可被 ER 应激激活（87）。作为短期反应，UPR 是一种重建 ER 蛋白稳态并帮助细胞存活的 PQC 机制。然而在持续 ER 应激期间 UPR 的结果是程序性细胞死亡，这可能是为了确保生物体在以清除 ER 应激损伤细胞为代价的存活（88）。无论 UPR 的结果如何，对 ER 应激的初始信号事件涉及 UPR 的所有三条臂，它们分别由三个 ER 跨膜蛋白感知：肌醇需要酶-1（IRE1）、蛋白激酶 R 样 ER 激酶（PERK）和活化转录因子 6（ATF6）（1）。IRE1 是一种激酶/核酸内切酶（RNase），其激活引发 X-盒结合蛋白 1（XBP-1）mRNA 的非传统剪接。剪接后的 Xbp-1 编码一种转录因子，激活一系列基因，包括 ER 伴侣蛋白，其产物负责 ER 蛋白折叠和 ER 相关 PQC。IRE1 也可选择性降解编码分泌蛋白的现有转录本，以减轻 ER 负荷（3）。PERK 的激活通过磷酸化真核翻译起始因子 2α（eIF2α）减少一般蛋白合成，从而改善 ER 蛋白超负荷。在 ER 应激期间，ATF6 从 ER 转位至高尔基体，其细胞质结构域（ATF6f）被释放并允许进入细胞核激活 UPR 靶基因表达（3）。看起来 UPR 信号传导的所有三条分支协同对抗 ER 应激并重建 ER 稳态，从而保护细胞。然而，同样的 UPR 在 ER 应激持续时矛盾地激活细胞死亡通路。UPR 信号的这种悖论长期以来一直是一个未解之谜。然而结果发现 UPR 的三条信号臂在持续 ER 应激期间于不同阶段终止（89）。IRE1 介导信号激活的反应即使在应激持续时也相当迅速地衰减；ATF6 臂的终止稍落后于 IRE1；而 PERK 信号在整个 UPR 的保护和细胞死亡阶段保持激活（89）。强制延迟关闭 IRE1 臂显著减弱长期 ER 应激诱导的细胞死亡（89）。因此，长期 ER 应激期间的细胞死亡是由于 UPR 中 IRE1 信号活性的终止（89）。长期 ER 应激已被证明是压力超负荷心脏肥大向心衰进展过程中心肌细胞凋亡的一个贡献因素（90）。心肌细胞限制性 ATF6 过表达诱导的 ER 应激相关基因在离体小鼠心脏制备中对 I/R 损伤具有保护作用（91），表明 ER 相关 PQC 的需求因心肌 I/R 显著增加（92）。

27.5 心脏重塑与衰竭中的 PQC 不充分（PQC Inadequacy in Cardiac Remodeling and Failure）

已有多条证据支持一个统一的假说：心肌细胞中的 PQC 在多种形式的心脏病中是不充分的，并且这种 PQC 不充分促成了一大类心脏病向 CHF 的进展（19）。根据主要病因，PQC 不充分可由心肌细胞中错误折叠蛋白的产生增加和/或细胞处理异常蛋白的能力不足引起。PQC 不充分的结果是错误折叠蛋白在心肌细胞中积累并形成异常聚集，而异常蛋白聚集反过来又使分子伴侣负担过重并损害 UPS，从而进一步加重 PQC 不足，形成一个恶性循环。UPS 功能受损在概念上将损害正常蛋白（包括结构、代谢和其他调节蛋白）的更替，导致心肌细胞功能障碍。异常蛋白聚集不仅隔离错误折叠蛋白（在某种程度上是保护性的），还将重要的正常蛋白吸引到聚集中（93）。后一种效应可能会破坏其他关键的细胞过程。作为代偿机制，选择性自噬被激活以协助清除蛋白聚集和受损细胞器，但代偿能力有限。PQC 不足恶化的最终后果是心肌细胞死亡和心衰（图 27.3）。

27.5.1 患病心脏中异常蛋白的产生常增加

各种原因引起的 CHF 通常以心脏肥大为先导并伴随。心脏肥大是不良预后的独立风险因素，需要单个心肌细胞内蛋白合成增加。因此，共翻译异常蛋白的产生在心脏肥大中不可避免地增加。据估计，约 30% 的新生多肽从未成为成熟蛋白，它们被 UPS 共翻译降解（94）。与这一假说一致，UPR 在小鼠压力超负荷心脏肥大以及血管紧张素 II 处理的心肌细胞中被激活。当用血管紧张素 II 1 型受体拮抗剂减弱心肌肥大时，UPR 的激活也减弱（90）。在 IHD 中，心肌缺血和 I/R 损伤期间的氧化应激增加很可能破坏新生多肽的折叠和组装并损伤更多成熟蛋白，导致异常蛋白的产生增加。众所周知，氧化蛋白在缺血和 I/R 心脏中显著增加。缺氧和整体 I/R 激活心肌细胞中的 UPR（91,95），而持续 ER 应激最近被证明抑制 UPS 蛋白水解功能（96）。心肌病的很大一部分由肌节或相关蛋白的基因突变引起，而它们在心脏中通常是非常丰富的蛋白（5）。表达突变蛋白（特别是引起错误折叠的突变）将不可避免地增加 PQC 的负担。此外，患病心脏中增加的机械应激很可能损伤更多成熟蛋白。因此，所有上述分析和越来越多的证据支持患病心脏中心肌细胞的 PQC 负担显著增加。

27.5.2 心力衰竭中蛋白酶体清除异常蛋白似乎不足

清除异常蛋白是 PQC 的主要职责，主要依赖伴侣蛋白和 UPS 之间的协作。如前所述，尽管伴侣蛋白常被上调，但在多种形式的心脏病中它们在心脏中似乎并不充分，这本身就会阻碍错误折叠蛋白的修复和/或清除。除病毒性心肌炎和蒽环类药物诱导的心肌病（97,98）外，使用动物模型的大多数研究提示心脏蛋白酶体功能在心脏病向 CHF 进展的很大一部分过程中受损/不足。心肌 I/R 损伤是 IHD——CHF 的主要原因——中的一个主要病理过程。正如最近的大多数报告所示，I/R 的动物模型显示心脏蛋白酶体功能受损（72,99–102）。缺血预处理（IPC）是保护心脏免受后续更严重缺血的最有效手段之一。IPC 保留 26S 蛋白酶体的缺血后功能，而蛋白酶体抑制消除 IPC 的保护作用（102）。IPC 增强 PKCδ（一种已知在再灌注期间有害的激酶）的蛋白酶体介导降解（100）。心肌 I/R 引起活性氧（ROS）水平显著增加。许多研究显示 ROS 抑制蛋白酶体功能（101）。在氧化应激下，ROS 不仅可直接修饰蛋白酶体亚基从而损害蛋白酶体活性，而且被氧化的蛋白及其代谢中间体也可直接抑制蛋白酶体功能（103）。20S 和 19S 蛋白酶体的亚基均易受氧化损伤（104–106）。如结蛋白相关心肌病（DRC）所示，心脏蛋白质病变是一类由蛋白毒性应激或心肌细胞中错误折叠蛋白的过度产生引起的心脏疾病。通过 GFPdgn 小鼠的杂交，在两个 DRC 转基因小鼠模型中已揭示出严重的蛋白酶体功能不足（15,52）。这种不足主要位于将泛素化蛋白递送进入 20S 蛋白酶体的步骤，而异常蛋白聚集是造成这一不足的原因（107,108）。异常蛋白聚集也在压力超负荷小鼠心脏中被观察到并被认为是自噬激活的触发因素（109）。在涉及该实验方法的大多数研究中，压力超负荷心脏中心肌泛素化蛋白的显著增加被一贯报道，即使报告对蛋白酶体肽酶活性变化方向以及全身性蛋白酶体抑制对压力超负荷心脏肥大反应和功能的影响存在争议（110,111）。异常蛋白聚集和泛素化蛋白增加的存在都与蛋白酶体功能不足一致，尽管压力超负荷心脏中蛋白酶体功能是否充足尚未被直接评估。心衰在老年人中普遍存在。由于磨损，老化组织产生并积累相对更多的氧化蛋白，且蛋白酶体活性下降已在包括心肌在内的各种老化组织中被观察到（112）。更重要的是，蛋白酶体功能不足涉及一大类衰竭心脏。免疫组织病理学揭示扩张型心肌病引起的终末期 CHF 人类心脏中泛素共轭物显著增加（113）。Western 印迹分析也显示扩张型或缺血性心肌病心脏中泛素化蛋白水平显著增加（42,114）。在以肥厚型或扩张型心肌病为表现的衰竭人类心脏中蛋白酶体肽酶活性下降最近被报道（114）。此外，形成前淀粉样寡聚体形式的异常蛋白聚集在衰竭人类心脏的心肌细胞中常被观察到（115）。观察到的前淀粉样寡聚体的含义有两个方面：首先它们是 PQC 不充分的标志，其次它们可进一步损害蛋白酶体功能。综合来看，多条证据均表明蛋白酶体对异常蛋白的清除不足与 CHF 的发生相关。

27.5.3 PQC 不充分在 CHF 中发挥致病作用

支持 PQC 不充分在 CHF 中起主要致病作用的证据正在迅速增加。由伴侣蛋白缺陷、泛素化缺陷或蛋白酶体损伤引起的 PQC 不充分，足以使心脏发生衰竭。大量证据显示伴侣蛋白不充分促成常见形式的心脏病向 CHF 的进展。证明蛋白酶体功能不足在心脏病中具有关键致病作用的证据正在浮现。PQC 不充分使心脏衰竭的机制也已经开始被阐明。PQC 不充分损害心脏的能力首先由伴侣蛋白基因功能丧失突变的研究所证明。敲除一个关键的线粒体 HSP40 在小鼠中引起扩张型心肌病（116）。CryAB/HSPB2 双基因敲除引起限制型心肌病并加剧小鼠压力超负荷诱导的心衰（16）。CryABR120G 在人类和小鼠中引起 DRC 和心脏衰竭（11）。许多研究显示泛在敲除特定泛素连接酶的小鼠出现严重心脏异常。例如 MuRF1 缺陷小鼠对压力超负荷诱导的心脏肥大反应加剧（117）。MuRF3 敲除小鼠在 MI 后易发心脏破裂（118）。CHIP 缺陷损害应对 MI 的能力并缩短小鼠寿命（119,120）。如前所述，cullin neddylation 是 CRLs 激活的关键步骤。cullin deneddylation 同样重要，调控 CRLs 的催化动力学和稳定性（121）。Cullin deneddylation 由 COP9 信号小体（CSN）执行，CSN 是一个进化上保守的蛋白复合物，由八个独特蛋白亚基（CSN1 至 CSN8）组成。CSN 介导的 deneddylation 需要所有八个亚基。最近，通过条件性靶向 csn8 基因，构建了第一个心肌细胞限制性扰动 UPS 介导蛋白水解的小鼠模型（122）。CSN8 心脏缺陷的小鼠表现出错误折叠蛋白清除受损、显著的心肌细胞坏死、扩张型心肌病，以及由 CHF 引起的过早死亡。这些遗传学研究已清楚地证明慢性 UPS 功能障碍足以引起心脏衰竭，这也得到了关于接受蛋白酶体抑制剂 bortezomib 的癌症患者心脏毒性的新临床报告的支持（123–125）。CryAB 过表达在压力超负荷早期抑制心脏肥大反应并减弱心肌 I/R 损伤（16,126）。HSP70 过表达也被证明保护心脏对抗 I/R 损伤（127,128）。这些动物研究提示，尽管伴侣蛋白表达在应激心脏中常被上调，但这种上调常不充分，且伴侣蛋白不充分很可能促成 IHD 和肥厚型心肌病中的病理性心脏重塑及其向 CHF 的进展。尚无报告显示泛素化不充分是患病心脏中 PQC 不充分的原因，但如前所述，蛋白酶体功能不足被广泛认为是大量心脏病发展过程中 PQC 不充分的原因。由于良性增强细胞内蛋白酶体功能的方法直到最近才被首次报道（82），支持蛋白酶体功能不足在心脏发病中具有必不可少作用的证据才刚刚开始出现。在培养的心肌细胞中通过过表达 PA28α 增强蛋白酶体功能减少氧化蛋白丰度和氧化应激触发的凋亡率（82），提示蛋白酶体功能不足在心肌 I/R 中氧化应激损伤这一主要原因中起重要作用。事实上，心肌细胞限制性转基因过表达 PA28α 增强蛋白酶体功能可在完整小鼠中保护对抗心肌 I/R 损伤。此外，过表达 PA28α 显著减弱异常蛋白聚集和心脏肥大，并延缓心脏蛋白质病变小鼠模型的过早死亡（Wang，未发表数据）。这些数据首次在细胞培养和完整动物中证明蛋白酶体功能不足在心肌 I/R 损伤和心脏蛋白质病变中的重要致病作用。这些令人兴奋的发现，包括开发在心脏中实现良性增强蛋白酶体功能的方法，预计将作为开发治疗一大类心脏病的新治疗策略的推动力。看起来 PQC 不充分可通过多种机制损害心脏。肌节是横纹肌（包括心肌）机械功能的基本单位。不同肌节蛋白之间高度严格的化学计量学对于维持肌节的收缩功能至关重要。用新蛋白替换肌节中受损蛋白必须与受损蛋白的去除精确耦合。几乎所有肌原纤维蛋白的降解由 UPS 执行。因此，心脏蛋白酶体功能不足在概念上会使肌节中一些缺陷蛋白不能被及时替换，这无疑会降低肌节的收缩力并最终降低心脏的机械性能。在这方面，PQC 不充分可能与已知的引起遗传性心肌病的肌节蛋白基因突变具有相似效果（129），后者是 CHF 的主要病因。PQC 不充分不可避免地积累错误折叠蛋白并导致异常蛋白聚集。错误折叠蛋白的表达和随之产生的异常蛋白聚集已被证明足以在人类和小鼠中引起心肌病和 CHF（130–132）。除对细胞的物理破坏外，异常蛋白聚集对多个细胞过程相当有害。易聚集蛋白可直接相互作用并抑制蛋白酶体蛋白水解亚基（133,134）。在培养的心肌细胞和完整小鼠心脏中，异常蛋白聚集已被证明损害蛋白酶体蛋白水解功能（15,52,107,135–137）。线粒体功能障碍和程序性细胞死亡常与 CHF 相关。在表现出严重蛋白酶体功能不足的心脏蛋白质病变转基因小鼠模型心脏中，在其他心脏病理变得明显之前就观察到线粒体功能障碍和凋亡增加（15,138）。药理性蛋白酶体抑制已被证明可在培养的心肌细胞中诱导细胞死亡（53,139）。Calcineurin-NFAT（活化 T 细胞核因子）通路是介导心脏病理性重塑的成熟信号通路（140）。有趣的是，蛋白酶体功能不足和重要伴侣蛋白的缺失（如 HSPB2/HSPB5 双敲除）都可激活心脏中的 calcineurin-NFAT 通路（16,111），提示 PQC 不充分可能在病理性心脏重塑过程中该通路的激活中起作用。综合来看，尽管我们对 PQC 不充分及其在心脏中介导致病作用的分子机制的理解仍处于早期阶段，但越来越清楚的是，PQC 不充分在多种心脏病向 CHF 的进展过程中扮演重要角色。随着最近一种小分子蛋白酶体激活剂的发现（73），预计这一领域的研究将在不久的将来呈指数增长，并将探索针对 PQC 不充分的新治疗策略。

本章个人批注

这一章把"蛋白质质量控制"作为心脏疾病的一个核心生物学主题展开，重点不在某个单一分子，而在"伴侣蛋白 + UPS + ER 相关 PQC"三层之间的协作与失灵。读完最深的印象是 PQC 是一个高度动态的系统：当错误折叠蛋白的产生速率上升（如压力超负荷、I/R、突变蛋白）时，UPS 的递送环节（特别是 20S 入口）以及泛素连接酶的可及性会首先成为瓶颈；接着异常蛋白聚集通过疏水相互作用反过来抑制 UPS，形成文中反复出现的"恶性循环"概念。这个概念框架比单分子机制更值得记住——它解释了为什么单纯过表达某一单个伴侣蛋白（CryAB）或蛋白酶体亚基（PA28α）都能在多个模型中带来保护。

另一个值得关注的细节是 PQC 与心脏肥大信号的耦合：atrogin-1 通过 FOXO 共同激活抑制 AKT 依赖的肥大（36,37），而 PQC 不足本身可激活 calcineurin-NFAT 通路（111,140）。这暗示 PQC 不仅是"清洁工"，而是直接参与信号通路调控。把 PQC 干预当作抗肥大治疗策略的思路，在 2012 年这本书的时点还主要是动物模型数据，但路径是清晰的。

PA28α 过表达作为首次报道的"良性蛋白酶体功能增强"方法（82）是本章一个微妙的亮点——之前长期只有蛋白酶体抑制剂（bortezomib 类）可用，这为后来 USP14 抑制剂（73）的发现和应用奠定了方向。

与上下章的衔接（一段话）

第 26 章讨论的是心脏 microRNA，主要处理转录后水平的基因表达调控；本章则下移到转录后、翻译后层面的"蛋白质稳态"——讨论的是蛋白一旦合成之后如何被监控、修复和降解。两章共同覆盖了"RNA 层面的调控"和"蛋白质层面的调控"，构成一组互补的"基因表达下游"机制。第 28 章（心肌保护）将进一步从治疗学角度出发，把这些基础机制与药理性干预联系起来，可以预期 PQC 增强策略将在那里再次被提及。