第 25 章：心血管生物学中的表观遗传学（Epigenetics in Cardiovascular Biology）

25.1 表观遗传学导论：四种主要机制

过去二十年的一个令人兴奋的发现是：真核细胞的转录调控不仅依赖于 DNA 中控制基因表达的元件（如启动子和增强子序列），还依赖于基因所在染色质的状态。在这个场景中，主要的"角色"是表观遗传学——一个复杂的机制网络，以潜在可遗传的方式调控基因表达，但并不改变 DNA 的一级核苷酸序列。这些机制通过调控染色质结构和基于 DNA 的生物学过程（如转录因子与启动子的结合以及转录延伸）来调控基因表达。表观遗传机制可分为四大主要类别：DNA 甲基化、组蛋白修饰、核小体定位和小 RNA。本章将聚焦于心血管生物学中的 DNA 甲基化、组蛋白修饰和核小体定位。

25.2 DNA 甲基化与基因沉默

DNA 甲基化是最早被发现的表观遗传机制，它始终与基因沉默相关联。DNA 甲基化优先发生在 CpG 二核苷酸的胞嘧啶上，这些 CpG 倾向于聚集在被称为 CpG 岛的区域内。在哺乳动物中，50%–70% 的 CpG 位点被甲基化。5-甲基胞嘧啶（5meC）残基的形成通过两种途径导致基因沉默：或直接阻断转录因子与 DNA 的结合，或通过招募甲基结合蛋白（MBPs，如 MBD1、MECP2、MBD3 和 MBD4），进而招募染色质重塑共抑制复合物。DNA 甲基化的程度由两个事件的速率决定：DNA 甲基化（由 DNA 甲基转移酶催化，如 Dnmt1、Dnmt3a 和 Dnmt3b）与 DNA 去甲基化。后者可以是被动发生（通过阻断新合成 DNA 在复制过程中的甲基化），也可以是主动发生（通过 DNA 修复后胞嘧啶的脱氨作用）。

25.3 组蛋白修饰：乙酰化与甲基化的双向调控

大多数真核细胞包含五种主要的组蛋白：组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4（即核心组蛋白），以及 H1（即接头组蛋白）。组蛋白是小分子碱性蛋白（分子量 11–20 kDa），由一个球状结构域和富含赖氨酸与精氨酸残基的带电尾部组成，这些尾部可发生多种翻译后修饰，包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、SUMO 化以及 ADP-核糖基化。其中乙酰化和甲基化是研究最深入的两种修饰。

组蛋白 H2B、H3 和 H4 尾部赖氨酸残基的乙酰化是转录激活的信号，而低乙酰化的组蛋白则出现在转录失活的基因组区域。具体而言，乙酰化中和了赖氨酸残基的正电荷，导致染色质开放，从而变得可被转录因子接近。乙酰化的组蛋白也促进转录，有利于含溴结构域的转录因子的对接。相反，去乙酰化增加了组蛋白尾部的正电荷，从而加强了组蛋白与 DNA 的结合，导致结构更为紧密、对转录因子可及性更低。与乙酰化不同，组蛋白甲基化既可与转录激活相关，也可与转录抑制相关，取决于被甲基化的特定残基（赖氨酸或精氨酸）以及甲基化程度（单甲基化、二甲基化和三甲基化）。过去几年中，几项结合染色质免疫沉淀（ChIP）与 DNA 微阵列分析（ChIP-on-chip）或大规模 DNA 测序（ChIP-Seq）的研究已经阐明了基因组内发生的组蛋白修饰。这些研究展现的总图景是：组蛋白修饰的组合形成了一种影响基因转录状态的"组蛋白密码"。通常，高水平的赖氨酸 9 和 14 乙酰化以及组蛋白 H3 赖氨酸 4 和 36 的三甲基化出现在转录活跃的基因中；而高水平的去乙酰化组蛋白、组蛋白 H3 赖氨酸 9 和 27 的三甲基化以及组蛋白 H4 赖氨酸 20 的三甲基化则与转录失活的区域相关。

组蛋白密码的一个重要特征是其动态性，这源于组蛋白修饰的可逆性。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶（HATs，如 E1A 相关蛋白 p300、CREB 结合蛋白 CBP 以及 p300/CBP 相关因子 P/CAF）催化。另一方面，组蛋白的去乙酰化则由组蛋白去乙酰化酶（HDACs）控制——这是一个由 18 个成员组成的大家族，分为三个不同的结构类别。类似地，组蛋白的甲基化由组蛋白甲基转移酶（HMTs，如 G9a 和 SUV39h1-2）和组蛋白去甲基化酶（HDMs，如 LSD1、JmjC 和 JARID）调控。

25.4 核小体定位与染色质重塑

染色质的基本单位被称为核小体。它由 145–147 个碱基对的 DNA 片段缠绕在一个由每种核心组蛋白各两个分子组成的组蛋白八聚体周围而形成。组蛋白八聚体在 DNA 上的位置不是随机的，而是受 DNA 序列的刚性和曲率的影响。这种被称为核小体定位的现象在包括基因转录在内的多种生物学过程的调控中具有重要作用。核小体的形成阻碍了蛋白质（如转录因子）与 DNA 的结合，从而充当转录抑制因子。最近在酵母上的研究表明，转录活跃的基因具有一个"开放"的启动子，其特征是转录起始位点（TSS）正上游存在一个核小体缺失区（NDR），有利于转录因子的结合。而在转录失活的基因中，核小体常常覆盖转录起始位点，阻止转录激活因子的结合。核小体的位置由 ATP 依赖的染色质重塑（RCS）酶（如 SWI/SNF、ISWI、CHD 和 INO80）调控，这些是多蛋白复合体，能利用 ATP 水解释放的能量来移动或改变核小体结构，从而影响基因转录调控。

25.5 表观遗传学与心脏发育：DNA 甲基化的现状

心脏是一个复杂器官，其发育需要多种细胞类型（如心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞）的特化与分化。基因转录调控在协调这些过程中起着关键作用。表观遗传学、染色质修饰和重塑是发育过程中基因表达和转录的已知关键调控元件。事实上，DNA 调控元件对转录因子的可及性是由染色质重塑复合体控制的，它们改变染色质结构以激活心脏特异基因的转录并抑制非心脏基因的转录。然而到目前为止，关于 DNA 甲基化在心脏发育中的具体作用目前仍然未知。

25.6 组蛋白修饰在心脏发育中的作用：HDAC 与 HAT 的双重角色

关于组蛋白乙酰化在心脏发育中的功能，主要通过编码 HDAC 和 HAT 基因的敲除小鼠模型进行了研究：这些模型研究表明，I 类和 II 类 HDAC 以及 p300 HAT 在心脏发育中均具有关键作用。HDAC2（I 类 HDAC）的功能缺失导致心肌表型改变和心肌细胞过度增殖。HDAC1（另一个 I 类 HDAC）的敲除虽然不产生特异表型，但导致严重的增殖缺陷和整体生长迟缓。然而，HDAC1 和 HDAC2 的条件性双敲除导致新生期死亡，并伴有心律失常、扩张型心肌病以及心脏中骨骼肌特异性收缩蛋白和钙通道编码基因的上调，这表明 HDAC1 和 HDAC2 在心脏生长和发育中具有冗余功能。缺乏 HDAC5 和 HDAC9 的小鼠也表现出心脏形态发生缺陷，包括致命的室间隔缺损和薄壁心肌——这通常源于心肌细胞生长和成熟过程的异常。此外，HDAC7 的靶向缺失由于血管扩张和破裂而导致胚胎致死。通过抑制心肌转录因子——如肌细胞增强因子 2（MEF2）、血清反应因子（SRF）、活化 T 细胞核因子（NFAT）和锌指蛋白 GATA——HDAC 参与协调心肌细胞分化、增殖和形态发生机制所需基因表达程序的调控，这些机制构成了心脏形成的基础。具体而言，一系列研究表明 MEF2 是 II 类 HDAC 的关键靶点：这些酶在基因调控元件上与 MEF2 形成复合物，从而抑制含有 MEF2 结合位点的基因。事实上，HDAC 敲除小鼠中异常的心脏生长与 MEF2 介导转录的超激活相关。

除了 HDAC，p300 HAT 对心脏发育的重要性也已被证实：p300 敲除小鼠表现出心脏缺陷（肌结构蛋白如 β-肌球蛋白重链 MHC 和 α-actinin 的表达受损，以及心室小梁化减少），并在妊娠 9 至 11.5 天之间死亡。与 I 类和 II 类 HDAC 类似，p300 HAT 也通过与心脏发育相关转录因子的组合性相互作用来控制胚胎心脏的基因表达。具体而言，p300 HAT 与 MEF2D 的相互作用促进了心脏发育所需心脏基因（如心脏 α-肌动蛋白）的转录。GATA4 的乙酰化也涉及胚胎干细胞向心肌细胞的分化，而对早期心脏形态发生至关重要的 Tbx5 介导了 Nppa 启动子的组蛋白乙酰化和反式激活。因此，解释 HDAC 和 p300 HAT 在心脏发育中功能的一种机制涉及 HDAC 和 HAT 与 MEF2 转录因子的互斥结合，从而 MEF2 既可作为转录抑制因子也可作为转录激活因子。如此，p300 HAT 可以在心脏发育早期结合 MEF2 以激活此期间对心脏形态发生至关重要的因子转录；随后，MEF2 与 HDAC 的相互作用将抑制这些基因。

与组蛋白乙酰化相比，组蛋白甲基化在心脏发育中的作用尚不清楚。两个酶类参与此过程：HDMs 和 HMTs。属于 jumonji（Jmj）家族的 HDMs 主要作为转录抑制因子，并对正常的心脏发育和功能至关重要。事实上，Jmj 在正常发育心脏的各个阶段均有表达，从预心肌中胚层到成年小鼠心脏。Jmj 敲除小鼠的表型以关键先天性心脏畸形（室间隔缺损、心室壁未致密化、右室双出口和心房扩张）和心脏标志物（α-MHC、β-MHC、ANF、MLC2V、MLC2A）以及心肌收缩蛋白的失调为特征。因此，Jmj 可能通过与转录因子相互作用来调节靶基因表达。另一方面，HMTs 在胚胎心脏中的功能目前完全未知。

25.7 染色质重塑在心脏发育中的作用：BAF 复合体的双向调控

染色质重塑复合体是心脏发育中基因转录调控的重要参与者。特别是 Brg1/Brm 相关因子（BAF）复合体在调控心脏生长、分化和基因表达方面起关键作用。BAF 复合体以两种相反方式发挥作用：它们使染色质松弛并促进 RNA 聚合酶 II 接近转录起始位点，从而激活转录；同时，它们与参与转录抑制的蛋白（如 HDACs 和甲基化酶）相关联。这种双向作用机制得益于组成复合体的多个亚基。复合体的 ATPase 组分由两个基因之一编码：Brg1 或 Brm。在器官发生过程中，Brg1 似乎是 BAF 复合体功能的主要效应物，而 Brm 对胚胎发育则是可有可无的。复合体的所有其他亚基（如 Baf60a、Baf60b、Baf60c）以组织特异性的方式表达，并作为与不同 DNA 结合因子之间的桥梁。Baf60c（一种心脏富集的 BAF 复合体亚基）在预心肌中胚层中表达得很早，特别是小鼠胚胎的心脏和体节，特别是心管环化处两极——这些位置将产生流出道和心房。事实上，在小鼠模型中删除或下调 Baf60c 或 Brg1 均会导致严重的心脏形成缺陷（心房发育不全、单心室、流出道异常、小梁化受损等）。

BAF 复合体的重要性以及由 Baf60c 和 Brg1 驱动的转录激活机制，在以下研究中得到彰显：这些研究证明了 Baf60c 在促进 BAF 复合体与心脏发育所涉及的特定心脏转录因子（如 Gata4、Nkx2.5 和 Tbx5）之间相互作用中的作用。在 Brg1 存在下，Baf60c 通过增强 Gata4 依赖性的 Nkx2.5（标记原发和继发心场的一种心脏转录因子）激活来诱导心脏分化。Baf60c 与 Gata4 的相互作用被证明可启动心脏基因表达程序并驱动中胚层向心肌细胞的分化；然而，需要加入 Tbx5 来诱导负责心脏收缩的基因并抑制非心脏中胚层基因。因此，Baf60c 增强了 Gata4 和 Tbx5 的功能，使 Gata4 能够结合心脏基因位点，从而诱导完整的心脏分化程序。如上所述，BAF 复合体也可以与参与转录抑制的蛋白相关联：事实上，最近的一项研究表明 Brg1 通过与另外两类染色质修饰酶——转录抑制因子 HDAC 和多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）——相互作用来维持胎儿心脏分化。Brg1 将心肌细胞维持在胚胎状态，并在心脏生长和分化过程中调控 α-MHC 和 β-MHC 的表达。Brg1、PARP 和 HDAC 在 α-MHC 启动子上物理地形成一种染色质重塑复合体来共抑制 α-MHC，而 Brg1 在 β-MHC 启动子上与 PARP 形成复合体来激活 β-MHC。因此，Brg1 调控两条平行路径，以独立地控制胚胎中心肌的生长和分化。

25.8 心力衰竭中的表观遗传学：HDAC 的对立角色

心力衰竭常常伴随心脏质量、大小和形状的变化，这些变化源于肥大和纤维化。在分子层面，这种综合征与心肌细胞和成纤维细胞中的基因表达重编程相关：在心肌细胞中，胎儿基因（如胎儿型 MHC——小鼠为 β-MHC 或 Myh7，人为 α-MHC 或 Myh6——BNP 即脑钠肽，以及 ANP 即心房钠肽）被重新表达，而成年基因（如成年型 MHC——小鼠为 α-MHC 或 Myh6，人为 β-MHC 或 Myh7）则被下调。许多研究已经证明表观遗传机制在心力衰竭期间基因转录调控中的作用。这些研究大多聚焦于组蛋白乙酰化和核小体定位。

关于心力衰竭的表观遗传学研究主要集中在组蛋白乙酰化上。与心脏发育一样，关于组蛋白乙酰化在心力衰竭中作用的大部分信息也是通过研究编码 HDAC 的基因的敲除小鼠模型获得的。这些研究表明不同的 HDAC 类别在肥大通路调控中具有相反的作用。HDAC9 和 HDAC5 是 II 类 HDAC，在肥大通路控制中起重要作用。缺乏 HDAC9 和/或 HDAC5 的小鼠在应答肥大刺激时比野生型小鼠更容易发生心肌肥大和心力衰竭。这些酶通过调节 MEF2（一种调控促肥大基因表达的转录因子）的活性参与心力衰竭。在正常成年心肌中，MEF2 与 HDAC 的结合抑制其转录活性，而在肥大心肌中，MEF2 不与 HDAC 结合，因此促肥大基因的转录被促进。MEF2 与 II 类 HDAC 的相互作用受 HDAC 磷酸化状态调控：在心肌肥大过程中，这些 HDAC 被应激诱导的激酶（如钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 CaMK 和蛋白激酶 D PKD）磷酸化，导致酶从 MEF2 解离并从细胞核转运到细胞质。

与 II 类 HDAC 相反，I 类 HDAC 中的 HDAC2 是促肥大的。事实上，Hdac2 敲除小鼠对肥大刺激具有抗性，而在成年心肌中过表达此酶则诱导心肌肥大。有人提出 HDAC2 的促肥大活性与其阻断抗肥大基因 Inpp5f 表达的能力相关——Inpp5f 编码磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）磷酸酶，并通过降解 PIP3 来抑制 PI3K-Akt-Gsk3 通路。因此，不同的 HDAC 涉及肥大反应：II 类 HDAC 阻断促肥大基因的表达，而 I 类 HDAC（如 HDAC2）则抑制抗肥大基因的表达。这些结果提示药理学上阻断 HDAC 酶可能对心肌肥大和心力衰竭具有积极的治疗作用。在这方面，广谱 HDAC 抑制剂（如曲古抑菌素 A TSA 和丁酸钠 NaB）被发现可在体外预防心肌肥大，而对 I 类 HDAC 更特异的抑制剂在小鼠心力衰竭模型中显示出对病程进展有积极影响。尽管这些药物的分子作用机制尚未研究清楚，但一种假设是 HDAC 抑制剂通过促进组蛋白乙酰化和随后的抗肥大基因的转录激活而发挥作用。关于心力衰竭中的组蛋白乙酰化作用已被广泛研究，而其他组蛋白修饰在该病理中的功能目前知之甚少。然而，最近的文献提示组蛋白甲基化在心力衰竭中具有作用：事实上，在 H9c2 心肌细胞系中，前炎症细胞因子白介素-18 触发了强烈的促肥大反应，伴随着在心肌肥大期间下调的基因上三甲基化组蛋白 H3K9（一种与转录抑制相关的表观遗传标记）水平的增加；相反，胎儿基因 desmin 和 β-MHC 的上调则与三甲基化 H3K9 的减少相关。

25.9 心力衰竭中的核小体定位：Brg1 的关键作用

核小体定位在心力衰竭中的作用正从染色质重塑因子 Brg1 的研究中浮现出来。这些研究表明 Brg1 是心肌肥大程序所必需的。在小鼠心力衰竭模型和肥厚型心肌病患者中 Brg1 的表达被发现增加；缺乏 Brg1 的小鼠比野生型小鼠对肥大刺激更具抗性。一种被提出的解释 Brg1 在心力衰竭中功能的模型赋予它调控从成年型到胎儿型 MHC 亚型表达转换的角色：在心肌肥大过程中，Brg1 在成年型 MHC 启动子上与转录抑制因子形成染色质重塑复合体，而在胎儿型 MHC 启动子上与转录激活因子形成染色质重塑复合体。这造成了心肌肥大过程中的两种效应——成年型 MHC 的抑制和胎儿型 MHC 的重新表达。

25.10 表观遗传学与动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种由遗传和环境因素（如脂蛋白水平升高、吸烟和高血压）共同引起的多因素疾病。过去十年中，研究一直致力于识别导致动脉粥样硬化的遗传因素，但对环境如何与基因相互作用以影响该病的发展却知之甚少。尽管最近的研究支持 DNA 甲基化在此过程中的作用，从而暗示表观遗传学在该心血管病理中也起作用，但其他表观遗传机制（如组蛋白修饰和染色质重塑）的功能仍未被研究。

动脉粥样硬化与 DNA 甲基化模式的改变相关。在从动脉粥样硬化患者和动脉粥样硬化小鼠模型（如缺乏载脂蛋白 E 的 ApoE 敲除小鼠）的动脉粥样硬化病灶中分离的平滑肌细胞中发现了全基因组的 DNA 低甲基化。在动脉粥样硬化中下调的基因（如雌激素受体 α 和 β）的启动子区域中，DNA 甲基化水平被发现升高。此外，更有意思的是，有人提出高同型半胱氨酸血症——动脉粥样硬化的一个风险因素——通过调节内皮细胞的 DNA 甲基化水平发挥作用：同型半胱氨酸水平的升高抑制 DNA 甲基转移酶，进而导致 DNA 低甲基化。

25.11 表观遗传治疗的现状与前景

药理学调节表观遗传机制具有巨大的治疗潜力。表观遗传治疗由于细胞表观遗传谱的可逆性而是可行的，包括通过使用抑制表观遗传酶活性的药物来恢复受影响细胞中正确的基因表达。目前，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）伏立诺他（vorinostat）已被用于 T 细胞淋巴瘤的临床治疗。最近的研究表明 HDACi 可预防心肌肥大和心力衰竭，提示表观遗传治疗也有可能用于心力衰竭的管理。然而，心血管疾病表观遗传治疗的发展目前在以下方面受限：这些药物的多效性效应以及我们对相关表观遗传机制认识的不足。更好地定义心血管疾病中涉及的表观遗传机制可能有助于克服这些问题，并基于新分子靶点（如 DNA 和组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶）的鉴定，开发出针对心力衰竭的更具特异性的治疗策略。

表观遗传学在心血管疾病诊断中也可能发挥重要作用。事实上，与遗传性变化相比，表观遗传变化的一个区别特征是它们倾向于以渐进而非突变的方式获得。这使得表观遗传改变成为预防策略的良好靶点。例如，越来越多的证据表明 CpG 区域的高甲基化可以成为人类癌症最普遍的分子标志之一。尽管如此，心血管疾病中的诊断潜力尚未得到广泛研究。

表观遗传学的另一个重要应用可能在于调节心脏分化的效率和特异性，并解释心脏发育畸形的基础缺陷。然而，由于对相关机制认识的不足，目前我们距离临床应用表观遗传机制控制心脏发育还很遥远。因此，需要进一步研究以阐明心脏分化和发育中转录的信号事件。

本章个人批注

本章作为 Hill 2012 心脏篇中"系统/治疗"板块的入口，承担了从分子病理学（Ch21-23）转向治疗学/系统生物学（Ch25-30）的桥梁角色。最值得记住的几个核心论点：(1) 表观遗传机制在心脏发育中并非可有可无——HDAC1/2 双敲除的新生致死、HDAC5/9 敲除的室间隔缺损、Baf60c/Brg1 敲除的单心室畸形都提示染色质调控是心脏形态发生的硬约束。(2) HDAC 抑制并非"一刀切"——II 类 HDAC（HDAC5/9）抗肥大而 I 类 HDAC（HDAC2）促肥大，这一双向性提示未来的 HDACi 必须是亚类特异性的；广谱抑制剂（如 TSA）虽然在体外抗肥大但其多效性效应严重阻碍临床转化。(3) "组蛋白密码"作为概念框架虽然优美，但 ChIP-on-chip/ChIP-Seq 的全基因组数据更多是描述性的（哪些位点有 H3K9me3）而非机制性的（什么 writer/reader/eraser 决定这种分布）。作者自己也承认 DNA 甲基化在心脏发育中"目前未知"，HMT 在胚胎心脏中"完全未知"——这种坦率恰好区分了机制研究与描述性研究的边界。

需要警惕的是，作者对"表观遗传治疗前景"的讨论相当乐观，但伏立诺他获批的临床指征（T 细胞淋巴瘤）与心血管疾病的治疗范式差异巨大：肿瘤治疗可以接受较大的脱靶毒性，而慢性心血管病需要长期给药、毒性窗口很窄。从这个角度看，作者对 HDACi 治疗心力衰竭的临床转化预期可能过于乐观。另一个值得在后续章节验证的连接点是：Baf60c/Brg1 在发育和肥大中扮演的不同角色——前者是心脏分化的关键驱动，后者是肥大程序的必要组分——这种"同一因子、相反功能"的二态性在 Ch39（心肌再生）和 Ch32（Wnt/Notch）中是否也有类似例子，值得追踪。

与上下章的衔接（一段话）

从 Hill 2012 心脏篇的结构看，Ch25（Papait/Cattaneo/Latronico/Condorelli 表观遗传学）是 Ch21-24（病理性 vs 生理性肥大机制 + 氧化应激）"机制深挖"板块与 Ch26-30（microRNA、蛋白质量控制、心肌保护、纤维化、自噬）"系统调控"板块之间的桥梁。本章为前文多次出现的转录因子（MEF2、GATA4、Nkx2.5、SRF）提供了染色质层面的解释——Ch21 讨论的 CaMKII-HDAC、Ch22 讨论的 PI3K-Akt-GSK3β、Ch23 讨论的 Trx1-HDAC、Ch24 讨论的 CITED4/C/EBPβ 调控——都在本章获得了"染色质可及性"层面的整合；与此同时，Ch25 末尾对"DNA 甲基化/HMT 在心脏发育中未知"的坦率，直接为 Ch26（microRNA 在心血管中的作用）保留了登场空间——microRNA 是表观遗传四大机制中唯一被系统讨论的。前承 Ch4（心脏祖细胞的转录控制）、Ch16（心肌线粒体生物发生的转录控制）、Ch22（病理性 vs 生理性肥大的概念框架）；后启 Ch26（microRNA）、Ch27（蛋白质量控制，与本章 BAF/PARP-HDAC 复合体在蛋白稳态上的功能呼应）、Ch32（Wnt/Notch——与本章 BAF 复合体的发育调控深度交织）以及 Ch39（心肌再生——将应用本章表观遗传工具来理解再生失败）。Ch25 把"染色质重塑"提升为心脏发育与疾病的核心调控层级，这一定位直接塑造了后续章节的论证方式：任何关于转录因子、microRNA 或信号通路的讨论都必须最终回答"它如何改变了染色质状态"这一问题。